Submit
Browse  

The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.

Recommend to Librarian

Automatic Translation

This translation into Arabic was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE General

تقرير من الطوافة الدهن تقسيم المسابر Fluorescently الموسومة في الخلايا الحية بواسطة التحليل الطيفي الارتباط الإسفار (FCS)

1, 2,3, 1

1Centre de Recherche de l’Institut du Cerveau et de la Moelle Épinière, Hôpital de la Pitié-Salpêtrière, 2Institut des Sciences Moléculaires d'Orsay, Université Paris-Sud, 3Centre de Photonique Biomédicale du Centre Laser, Université Paris-Sud

You must be subscribed to JoVE to access this content.

This article is a part of   JoVE General. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.

Recommend JoVE to Your Librarian

Current Access Through Your IP Address

You do not have access to any JoVE content through your current IP address.

IP: 54.234.42.16, User IP: 54.234.42.16, User IP Hex: 921315856

Current Access Through Your Registered Email Address

You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please or create an account with your institutional email address to access this content.

 

Video Article Chapters

Cite this Article: تقرير من الطوافة الدهن تقسيم المسابر Fluorescently الموسومة في الخلايا الحية بواسطة التحليل الطيفي الارتباط الإسفار (FCS)

Marquer, C., Lévêque-Fort, S., Potier, M. C. Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS). J. Vis. Exp. (62), e3513, doi:10.3791/3513 (2012).

Abstract: تقرير من الطوافة الدهن تقسيم المسابر Fluorescently الموسومة في الخلايا الحية بواسطة التحليل الطيفي الارتباط الإسفار (FCS)

في السنوات الخمس عشرة الماضية أصبحت فكرة أن أغشية الخلايا ليست متجانسة والاعتماد على microdomains لممارسة وظائفها بقبول واسع النطاق. الطوافات الدهنية هي microdomains غشاء المخصب في الكولسترول وsphingolipids. انها تلعب دورا في العمليات الفيزيولوجية الخلوية مثل الإشارات، و1،2 الاتجار لكن يعتقد أيضا أن يكون لاعب رئيسي في العديد من الأمراض بما في ذلك العدوى الفيروسية أو البكتيرية وأمراض الاعصاب 3.

بعد وجودها لا يزال مثار جدل 4،5. في الواقع، فقد قدر حجم الدهون طوف أن يكون حوالي 20 نانومتر 6، حتى في إطار الحد الأقصى من قرار المجهري التقليدية (حوالي 200 نانومتر)، مما حال دون التصوير المباشر. حتى الآن، وكانت التقنيات الرئيسية المستخدمة لتقييم قسم من البروتينات ذات الاهتمام داخل الطوافات الدهنية أغشية مقاومة للمنظفات (DRMS) العزلة وشارك في التصحيح، مع الأجسام المضادة. على الرغم من استخدامها على نطاق واسع بيكاوكانت هذه التقنيات استخدام تنفيذها سهل نوعا ما، عرضة لالمصنوعات اليدوية، وانتقد وبالتالي 7،8. وكانت التحسينات التقنية اللازمة لذلك للتغلب على هذه المصنوعات اليدوية، وتكون قادرة على تحقيق دهن الطوافات التقسيم في الخلايا الحية.

هنا نقدم طريقة لتحليل الحساسية من تقسيم الطوافات الدهنية من البروتينات fluorescently الموسومة أو الدهون في الغشاء البلازمي للخلايا الحية. هذا الأسلوب، ووصف الإسفار الارتباط الطيفي (FCS)، تعتمد على تفاوت في الأوقات نشر تحقيقات نيون الواقعة داخل أو خارج من الطوافات الدهنية. في الواقع، كما يتضح في كل من الأغشية الاصطناعية والثقافات الخلية، ونشر تحقيقات أسرع بكثير خارج من داخل الطوافات الدهنية الكثيفة 9،10. لتحديد الأوقات ونشرها، وتقاس التقلبات مضان دقيقة بوصفها وظيفة من الوقت في وحدة التنسيق (ما يقرب من 1 فيمتولتر)، التي تقع في الغشاء البلازمي للخلايا مع المجهر متحد البؤر (الشكل1). ويمكن بعد ذلك منحنيات لصناعة السيارات في ارتباط يمكن استخلاصها من هذه التقلبات ومزودة نماذج ملائمة لنشر الرياضية 11.

ويمكن استخدام FCS لتحديد مجموعة كبيرة من الدهون تقسيم تحقيقات مختلفة، طالما يتم تمييزها fluorescently هم. لا يمكن أن يتحقق عن طريق وضع علامات فلوري التعبير عن البروتينات الانصهار فلوري أو عن طريق الربط من يغاندس فلوري. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام FCS ليس فقط في الأغشية الاصطناعية وخطوط الخلية ولكن أيضا في الثقافات الأولية، كما هو موضح في الآونة الأخيرة 12. ويمكن أيضا استخدامه لمتابعة ديناميكية تقسيم طوف الدهون بعد إضافة عقار أو تغيير تكوين الغشاء الدهني 12.

Protocol: تقرير من الطوافة الدهن تقسيم المسابر Fluorescently الموسومة في الخلايا الحية بواسطة التحليل الطيفي الارتباط الإسفار (FCS)

1. معايرة من إعداد FCS

  1. بدء مجهر متحد البؤر، وأشعة الليزر وأجهزة الكمبيوتر وحاضنة لدرجة الحرارة وثاني أكسيد الكربون سيطرة 2.
  2. تأكد من أن SPAD (واحدة ديود أفالانش فوتون) هو في ومناسب تماما للمرشح مضان داخل SPAD إلى عينتك. تأكد من أن تتم مزامنة SPAD في الوقت المناسب. حذار أن تبدأ بك فقط FCS البرامج مرة واحدة الإعدادات SPAD على استعداد لشراء.
  3. يعد حل جديد من الكوليرا Alexa488-السم المخفف في برنامج تلفزيوني من أجل التوصل إلى تركيز من 1 ميكروغرام / لتر (17.5 مترا).
  4. تحسين التصوير مبائر من الحل باستخدام الكشف الداخلي للمجهر.
  5. التحول إلى النمط يشير المسح واختيار نقطة في العينة حل. تأكد مدة إضاءة الليزر طويلة بما فيه الكفاية لتنفيذ عمليات الاستحواذ الخاص FCS (> 5 دقائق).
  6. التحول إلى كشف خارجي من قبل SPAD والبرامج FCS. رصد إشارة مضان والتأكد من أنها على ما يرام سويتيد لSPAD (إشارة كافية ولكن لا تشبع، 10 000 000 50 اتهاما / ثانية على ما يرام). إذا لزم الأمر، تعديل موقف Z، وزيادة و / أو قوة الليزر لتحقيق إشارة مضان الصحيح.
  7. الحصول على 10 مجموعات من القياسات 30 ثانية. وينبغي أن يكون الأمثل لاكتساب الوقت عينتك (وسطا بين أفضل لأخذ العينات والمشاكل photobleaching).
  8. تحليل البيانات الخاصة بك (راجع الخطوة 4) لضمان أن يكون لديك منحنى لصناعة السيارات في ارتباط المقابلة لنوع واحد فلوري نشرها في حل (المعادلة في الشكل 2)، وذلك في الوقت المناسب تم الحصول عليها بعد نشر هو الصحيح (ما يقرب من 0،2 مللي) (الشكل رقم 3).

2. تلطيخ الخلايا الحية مع ماركر الطوافات الدهن

  1. لوحة HEK293 الخلايا في 8 جيدا Labteks المغلفة مع البولي-L-يسين (1mg/ml) قبل يوم من التصوير للتأكد من أن الالتصاق بهم هو الصحيح. استخدام وسيط وبدون الفينول الحمراء لضمان عدم وجود اضطراب في إشارة مضان.
  2. غسل الخلايا مرتين مع HBSS (محلول هانك في سولت التخزين المؤقت).
  3. إضافة بكتيريا الكوليرا، Alexa488 (1 ميكروغرام / مل) / جيش صرب البوسنة (0،1٪) في 500 HBSS ميكروليتر إلى الخلايا لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. وبكتيريا الكوليرا ربط GM1 غانغليوزيد، من المعروف أن تقسيم تفضيلي في الطوافات الدهنية.
  4. غسل الخلايا مرتين مع HBSS (محلول هانك في سولت التخزين المؤقت).

3. FCS الحصول على البيانات في الخلايا الحية

  1. وضع الخلايا الملون على المسرح المجهر. جعل درجة الحرارة والتأكد CO 2 الشروط هي المثلى وإلا فإن هذا قد يؤدي إلى القطع الأثرية في أوقات نشر.
  2. تحسين التصوير مبائر خلية ذات الاهتمام باستخدام الكشف الداخلي للمجهر (الشكل 4).
  3. التحول إلى النمط يشير المسح واختيار نقطة في الغشاء البلازمي للخلية من الفائدة. نفذ 1-2 الصور الحية للخلية للتأكد من أن الخلية لا تتحرك خلال اكتساب.
  4. التحول إلى كشف خارجي من قبل SPAD وإلى السفح لينةوير. رصد إشارة مضان، وتأكد من انها مناسبة تماما لSPAD (إشارة كافية ولكن لا تشبع، 10 000 000 50 اتهاما / ثانية على ما يرام). إذا لزم الأمر، تعديل موقف Z، وزيادة و / أو قوة الليزر لتحقيق إشارة مضان الصحيح. إذا كان هذا لا يكفي، قد تفكر في تغيير الظروف تلطيخ.
  5. الحصول على 10 عينات من القياسات 30 ثانية. حيث أن معظم الخلايا لصناعة السيارات في فلوري، قد ترى انخفاضا في مضان خلال عمليات الاستحواذ الأولى، نظرا لصناعة السيارات في مضان يتلاشى.

4. FCS تحليل البيانات

  1. تعيين الفاصل الزمني الارتباط وتولد لصناعة السيارات في ارتباط مع منحنيات البرنامج FCS. والفاصل الزمني للارتباط تتراوح عادة من الفارق الزمني أقصر لحل يصل إلى أطول وقت ممكن (كما إحصائيات وقياس يصبح أكثر وأكثر كفاية عندما أقصى وقت ارتباط يقترب مجموع وقت الشراء، ويقتصر في الوقت تأخر الحد الأقصى إلى 80٪ من الوقت على اكتساب PicoquaNT البرامج).
  2. لكل عينة، تصدير ملفات المقابلة لتقلبات مضان والسيارات ارتباط، بوصفها وظيفة من الزمن.
  3. استخدام تحليل البيانات والبرمجيات تركيب مثل الأصل الموالية لاستيراد ملفات.
  4. لكل عينة، تأكد من عدم وجود photobleaching خلال اكتساب أي مضان تبقى مستقرة خلال 30 ثانية. تجاهل أي تدبير عرض photobleaching، فقد يؤدي هذا الاصطناعي مرات أطول نشر.
  5. التحقق من أن شكل منحنيات FCS المتبقي هو الصحيح (انظر الشكل 5). تحديد منحنى FCS المتوسط.
  6. تناسب منحنى مع نموذج رياضي مناسب (الشكل 2). وهذه مناسبة تعطيك وقت نشر (ق) ونسبة الجزيئات نشرها مع هذا الوقت نشر (جنوب شرقي) (ق).

5. ممثل النتائج

ويرد مثال لمعايرة FCS مع حل توكسين-Alexa488 الكوليرا في الشكل (3) (الشكل 3A)، الفردية ويعني منحنيات FCS حسبت. تم تركيب يعني منحنيات FCS مع المعادلات المقابلة لنشر نماذج مختلفة (الأمثلة في الشكل 2). المعلمة تعتبر تقليديا لتحديد نوعية نوبة هو معامل التحديد R 2. أقرب آر 2 هو 1، وعلى نحو أفضل مناسبا. في هذه الحالة، فإن النموذج الأكثر دقة لتناسب منحنى FCS يعني هو واحد يصف سكان الجزيئات فلوري نشرها بحرية في ثلاثة أبعاد (معادلة 1 في الشكل 2 والشكل 3B). الوقت نشر المستمدة من مناسبة هو 0.32 مللي. بقايا من تركيب منحنى (الشكل 3C) وR 2 عامل (0.99906) اعطاء تقدير نوعية مناسبة.

مثال على تحليل FCS لالملون توكسين-Alexa488 الكوليرا HEK2ويظهر 93 الخلايا في الشكل 5. والمتعدد المراحل منحنى FCS شكل يعني يكشف عن وجود السكان من جزيئات الفلورسنت مع انتشار مختلف الأوقات. الأنسب لهذا المنحنى يتوافق مع نموذج مع ثلاثة من سكان تحقيقات فلوري: اثنان مع نشر أعاقت (نشر في بعدين كما هو الحال في طائرة غشاء) ونشرها بحرية في ثلاثة أبعاد (المعادلة 2 في الشكل 2 والشكل 5) . هذه الفئة من السكان الأخير يتوافق مع جزيئات نيون تتحرك خارج الطائرة غشاء، أي إما ملزمة أو غير ملزمة لأهداف غشاء بهم، والوصول إلى غشاء من خلال مسار إفراز أو إعادة التدوير، أو ترك غشاء بواسطة الإلتقام. وكان العصر نشر اثنين في غشاء، الموافق توكسين الكوليرا بد أن GM1، 2 مللي ثانية (25٪ من الجزيئات)، المقابلة لنشر خارج من الطوافات الدهنية، و 75 مللي ثانية (50٪ من الجزيئات)، المقابلة للنشر في الطوافات الدهنية . يرجى ملاحظة أن أي photobleachوسوف جى خلال اكتساب يؤدي إلى الاصطناعي مرات أطول وبالتالي خلق نشر ربما وجود تحيز نحو توطين GM1 في المجالات طوف الدهون.

الشكل 1
الشكل 1. تمثيل تخطيطي لFCS مجموعة المتابعة (صورة معدلة من Marquer وآخرون. 12)

الشكل 2
الشكل 2. مثال على نماذج الانتشار والمعادلات المناظرة المستخدمة لتناسب منحنيات الارتباط الذاتي. يمكن كتابة المعلمة هيكل S كما = S ض 0 / ث 0 مع ض 0 نصف قطرها التنسيق الفعال على طول المحور البصري في 1/2 ه وكثافة W0 في لوس انجليس فعالتنسيق دائرة نصف قطرها teral في شدة 2 1 / ه. ويمكن استخراج هذه القيم من انتشار نقطة قياس الكلاسيكية (PSF) وظيفة.

الشكل (3)
الشكل 3. تقييم من وقت انتشار الكوليرا Alexa488-السم في حل للمعايرة FCS. أ) تقلب الإسفار بوصفها وظيفة من الوقت لمثل ممثل لشراء 30 ثانية. ب) متوسط ​​منحنى الارتباط الذاتي التي تم الحصول عليها من 10 عينات من اكتساب 30 ثانية مزودة معادلة 1 (انظر الشكل 2). C) البواقي من منحنى المناسب.

الشكل 4
الشكل 4. كلوة الجنين البشري-293 خلية ملطخة الكوليرا Alexa488-السم. تم تصوير الخلايا على مجهر متحد البؤر SP5 (لايكا مايكروسيستمز، يتزلا، ألمانيا) مع خط الليزر 488nm الداخلية. وقد تم جمع مضان مع خطة لامزيغ X60 الهدف غمر النفط ما بين 500و 650 نانومتر.

الشكل 5
الشكل 5. تقييم من وقت انتشار بكتيريا الكوليرا، Alexa488 في غشاء البلازما من HEK293 الخلايا. أ) متوسط ​​منحنى الارتباط الذاتي مزودة معادلة 2 (انظر الشكل 2). B) البواقي من منحنى المناسب. (معدلة من Marquer وآخرون. 12)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion: تقرير من الطوافة الدهن تقسيم المسابر Fluorescently الموسومة في الخلايا الحية بواسطة التحليل الطيفي الارتباط الإسفار (FCS)

طريقة FCS المقدمة هنا يمكن تحليل الحساسة والسريعة للدهن تقسيم مجموعة من المجسات فلوري من الاهتمام في الخلايا الحية. FCS يجمع بين دقة الترجمة من متحد البؤر المجهري مع حساسية العد فوتون واحد. والفرق الرئيسي بين السفح والتقنيات الحيوية هو معيار أن FCS تمكن من تحديد المطلقة من الدهون الطوافات قسم من الهدف، وليس التقسيم النسبي كما هو الحال بالنسبة للعزلة أو شارك DRMS ​​الترقيع.

الحصول على بيانات FCS يستغرق حوالي 5 دقائق (10 الاستحواذ على 30 ثانية) لكل عينة وبالتالي فهو سريع جدا بالمقارنة مع التقنيات الحيوية المعتادة. هذا سرعة يجعل من الممكن تتبع في الوقت الذي اضطراب في تقسيم طوف الدهون التي قد تنجم عن إدمان المخدرات. ومع ذلك، يمكن تحليل المنحنيات الارتباط الذاتي تكون صعبة بعض الشيء كما في نماذج مختلفة لمناسبة يجب أن تكون من خلال استعراضه لتحديدالأكثر دقة واحدة. وعلاوة على ذلك، photobleaching خلال اكتساب لابد من تجنب مثل هذا قد يؤدي إلى القطع الأثرية.

نحن هنا وصف على سبيل المثال حيث يمكننا ترسيم طوف تقسيم الدهون من الدهون: غانغليوزيد GM1 (الشكل 5). ومثل هذه الدراسة لم يكن ممكنا مع معيار إجراءات البيوكيميائية التي لا يمكن إلا أن تطبق على البروتينات. لا تقتصر على السفح الدهون على الرغم من ويمكن أن تستخدم أيضا للبروتينات، الموسومة إما مع يجند فلوري (على سبيل المثال، ترانسفيرين Alexa555 بربط مستقبلات ترانسفيرين، من المعروف أن تقع خارج الطوافات 9) أو كنسبة الانصهار مع بروتين فلوري (على سبيل المثال APP-YFP أو Bace1 GFP-9، لاعبين اثنين من بروتين رئيسي في مرض الزهايمر). وبالتالي يمكن أن تستخدم لمجموعة واسعة من الأهداف. كذلك، لا يمكن تنفيذ السفح، ليس فقط في خطوط الخلايا، كما هو موضح هنا، ولكن أيضا في الثقافات الابتدائية 9.

فيما يتعلق السم الكوليرا، يجب أن نضع في اعتبارناانه لديه ميل لتجميع GM1 في pentamers، وبالتالي خلق غشاء الدقيقة المجالات التي يمكن أن تكون مختلفة من الطوافات الدهنية الأصلي. وهذا هو السبب لا يمكنك استخدام colocalisation مع توكسين الكوليرا لتحديد ما إذا كان البروتين اهتمامك داخل أو خارج من الطوافات. مع ذلك، نشر بروتينات الغشاء، مثل APP-YFP وBace1 GFP، في الطوافات الدهنية مع أوقات انتشار 60-80 مللي 9، تشبه الى حد ما لوحظ مع توكسين الكوليرا (75 مللي ثانية). وبالتالي يمكن أن تستخدم بكتيريا الكوليرا لمعايرة الخاص مجموعة المتابعة والتحقق من أنه يمكنك التفريق بين الأوقات نشر السريعة والبطيئة.

هي مناسبة أيضا لFCS العديد من التطبيقات الأخرى 13،14 مثل عزم الدولة oligomerisation من الدراسات 15 أو يجند / مستقبلات البروتين الدوائية 16. يمكن أيضا أن يقترن إلى تقنيات الفحص المجهري أخرى مثل المجموع الإسفار التأمل الداخلي (TIRF) 17،18 أو حفز نضوب الانبعاثات (STED) 19.في الواقع، STED-FCS يسمح للتقرير أكثر دقة من مجموعة كبيرة دهن تقسيم 19 ولكن حتى الآن، الفحص المجهري STED لا تزال مكلفة وبالتالي فهي ليست على نطاق واسع.

حدود الرئيسي للFCS هي الحاجة إلى تركيزات منخفضة من fluorophores (في نطاق nanomolar) وأوقات نشر سريع بحيث fluorophores ولن photobleach قبل مغادرة حجم الإثارة. تقنيات متكاملة لتقييم نشر من البروتينات وتشمل FRAP (الاسترداد بعد الإسفار Photobleaching) والمركز (صورة الطيفي الارتباط) تقنيات (استعرضت في 20).

في FRAP، يتم استخدام الليزر عالية الكثافة شعاع إلى photobleach منطقة من خلية واسترداد مضان بعد أن يتم رصدها ثم photobleaching. هذا الانتعاش يأتي من نشر fluorophores من غير مبيضة المناطق إلى منطقة المبيض. بالتالي يمكن استخراج مرات نشر من حركية الانتعاش. ويمكن استخدام FRAP مع تركيزات عالية سfluorophores و يمكن والوصول إلى مجموعة كبيرة من الأوقات نشر، مما يجعل من مكملة لFCS. وقد استخدمت FRAP لتقييم ما إذا كان fluorophore كان داخل أو خارج majoritarily من الطوافات 21،22 لكنه لا يزال وسيلة وليس الجزء الأكبر لقياس نسبة من داخل fluorophores نشرها أو أطواف خارج في مجال الاهتمام.

ICS هو التناظرية التصوير من السفح، والتي تحسب الارتباط المكاني بكسل بكسل لصورة معينة 23. انها ميزة لتكون قابلة للدراسة من تحقيقات فلوري نشرها ببطء ولكن يقتصر على تحليل 2D. تم التغلب على هذا الحد من خلال تطوير ICS وصف المكانية والزمانية ICS (STICS) 24. STICS تمكن المكانية والزمانية ارتباط تحقيقات فلوري في كومة من الصور وبالتالي هو تقنية قوية على الرغم من أنه يتطلب الكثير من تنفيذ الحسابية، ولها دقة أقل وقت من السفح. في الواقع، وتقتصر على حد سواء ICS وSTICS لمعالجة ال أبطأ بكثيرالوقت اكتساب إطار صورة واحدة. ودعا آخر تمديد خطوط المسح ICS ICS (RICS) 25،26 تمكن من تحليل عملية نشر سريع من خلال الاستفادة من وضع الفحص النقطية المتوفرة على المجاهر مبائر معظم التجارية. RICS هي متعددة كما أنها يمكن أن تستخدم لمجموعة واسعة الانتشار (من ميكرو ثانية لمرض التصلب العصبي المتعدد)، ولكن تنفيذه (مسح معالم معالجة البيانات، و) يمكن ان تكون مرهقة. لم نجد العديد من البحوث في الأدب الإبلاغ عن استخدام ICS والتقنيات المشتقة منها لدراسة الطوافات الدهنية 27-29.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures: تقرير من الطوافة الدهن تقسيم المسابر Fluorescently الموسومة في الخلايا الحية بواسطة التحليل الطيفي الارتباط الإسفار (FCS)

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements: تقرير من الطوافة الدهن تقسيم المسابر Fluorescently الموسومة في الخلايا الحية بواسطة التحليل الطيفي الارتباط الإسفار (FCS)

وأيد هذا العمل عن طريق منحة من الوكالة الوطنية للبحوث دي لا (ChoAD). ونحن أيضا ممتنون لمؤسسة اي سي ام (معهد دو Cerveau آخرون دي لا Moelle) لما قدموه من دعم مالي.

Materials: تقرير من الطوافة الدهن تقسيم المسابر Fluorescently الموسومة في الخلايا الحية بواسطة التحليل الطيفي الارتباط الإسفار (FCS)

Name Company Catalog Number Comments
Cholera toxin subunit B-Alexa 488 Invitrogen C-34775 MW (pentamer) = 57 kg/mol
Confocal microscope Leica Microsystems SP5
Incubator for temperature and CO2 control Life imaging services The Cube and the Box
SPAD (Single Photon Avalanche Diode) MPD (Micro Photon Devices) PDM serie (100 m sensitive area)
High pass 488 nm filter Semrock 488 nm blocking edge BrightLine long-pass filter Part # FF01-488/LP-25
FCS detection unit Picoquant Picoharp 300 module
Acquisition and auto-correlation software Picoquant SymPhoTime
Fitting software OriginLab OriginPro8

References: تقرير من الطوافة الدهن تقسيم المسابر Fluorescently الموسومة في الخلايا الحية بواسطة التحليل الطيفي الارتباط الإسفار (FCS)

  1. Brown, D.A. & London, E. Functions of lipid rafts in biological membranes. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 14, 111-136 (1998).
  2. Simons, K. & Gerl, M.J. Revitalizing membrane rafts: new tools and insights. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 688-699 (2010).
  3. Simons, K. & Ehehalt, R. Cholesterol, lipid rafts, and disease. J. Clin. Invest. 110, 597-603 (2002).
  4. Munro, S. Lipid rafts: elusive or illusive? Cell. 115, 377-388 (2003).
  5. Shaw, A.S. Lipid rafts: now you see them, now you don't. Nat. Immunol. 7, 1139-1142 (2006).
  6. Pralle, A., Keller, P., Florin, E.L., Simons, K., & Horber, J.K. Sphingolipid-cholesterol rafts diffuse as small entities in the plasma membrane of mammalian cells. J. Cell Biol. 148, 997-1008 (2000).
  7. Brown, D.A. & London, E. Structure and function of sphingolipid- and cholesterol-rich membrane rafts. J. Biol Chem. 275, 17221-17224 (2000).
  8. Sharma, P., Sabharanjak, S., & Mayor, S. Endocytosis of lipid rafts: an identity crisis. Semin. Cell Dev. Biol. 13, 205-214 (2002).
  9. Kahya, N., Scherfeld, D., Bacia, K., Poolman, B., & Schwille, P. Probing lipid mobility of raft-exhibiting model membranes by fluorescence correlation spectroscopy. J. Biol. Chem. 278, 28109-28115 (2003).
  10. Bacia, K., Scherfeld, D., Kahya, N., & Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy relates rafts in model and native membranes. Biophys J. 87, 1034-1043 (2004).
  11. Kim, S.A., Heinze, K.G., & Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy in living cells. Nat. Methods. 4, 963-973 (2007).
  12. Marquer, C., et al. Local cholesterol increase triggers amyloid precursor protein-Bace1 clustering in lipid rafts and rapid endocytosis. FASEB J. 25, 1295-1305 (2011).
  13. Tian, Y., Martinez, M.M., & Pappas, D. Fluorescence correlation spectroscopy: a review of biochemical and microfluidic applications. Appl. Spectrosc. 65, 115A-124A (2011).
  14. Haustein, E. & Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy: novel variations of an established technique. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36, 151-169 (2007).
  15. Ilien, B., et al. Pirenzepine promotes the dimerization of muscarinic M1 receptors through a three-step binding process. J. Biol. Chem. 284, 19533-19543 (2009).
  16. Lieto, A.M., Cush, R.C., & Thompson, N.L. Ligand-receptor kinetics measured by total internal reflection with fluorescence correlation spectroscopy. Biophys. J. 85, 3294-3302 (2003).
  17. Thompson, N.L., Burghardt, T.P., & Axelrod, D. Measuring surface dynamics of biomolecules by total internal reflection fluorescence with photobleaching recovery or correlation spectroscopy. Biophys. J. 33, 435-454 (1981).
  18. Thompson, N.L. & Steele, B.L. Total internal reflection with fluorescence correlation spectroscopy. Nat. Protoc. 2, 878-890 (2007).
  19. Eggeling, C., et al. Direct observation of the nanoscale dynamics of membrane lipids in a living cell. Nature. 457, 1159-1162 (2009).
  20. Kolin, D.L. & Wiseman, P.W. Advances in image correlation spectroscopy: measuring number densities, aggregation states, and dynamics of fluorescently labeled macromolecules in cells. Cell Biochem. Biophys. 49, 141-164 (2007).
  21. Shvartsman, D.E., Kotler, M., Tall, R.D., Roth, M.G., & Henis, Y.I. Differently anchored influenza hemagglutinin mutants display distinct interaction dynamics with mutual rafts. J. Cell Biol. 163, 879-888 (2003).
  22. White, R., et al. Holin triggering in real time. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 798-803 (2011).
  23. Petersen, N.O., Hoddelius, P.L., Wiseman, P.W., Seger, O., & Magnusson, K.E. Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application. Biophys. J. 65, 1135-1146 (1993).
  24. Hebert, B., Costantino, S., & Wiseman, P.W. Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells. Biophys. J. 88, 3601-3614 (2005).
  25. Digman, M.A., et al. Measuring fast dynamics in solutions and cells with a laser scanning microscope. Biophys. J. 89, 1317-1327 (2005).
  26. Digman, M.A., et al. Fluctuation correlation spectroscopy with a laser-scanning microscope: exploiting the hidden time structure. Biophys. J. 88, L33-36 (2005).
  27. Nohe, A., Keating, E., Fivaz, M., van der Goot, F.G., & Petersen, N.O. Dynamics of GPI-anchored proteins on the surface of living cells. Nanomedicine. 2, 1-7 (2006).
  28. Semrau, S. & Schmidt, T. Particle image correlation spectroscopy (PICS): retrieving nanometer-scale correlations from high-density single-molecule position data. Biophys. J. 92, 613-621 (2007).
  29. Bates, I.R., et al. Membrane lateral diffusion and capture of CFTR within transient confinement zones. Biophys. J. 91, 1046-1058 (2006).

Ask the Author: تقرير من الطوافة الدهن تقسيم المسابر Fluorescently الموسومة في الخلايا الحية بواسطة التحليل الطيفي الارتباط الإسفار (FCS)

1 Comment

First of all, thank you for this useful and interesting publication. I would like to know the following:

1) How many floating parameters are there in equation 2? Have you proved in some way that this equation is not over-parameterized?
2) Is there another determination of the lipid-raft partitioning of the probe that can be compared with the one you obtained by FCS?
3) How were you able to prove that two bi-dimensional populations are needed in order to fit the autocorrelation data? How different is the quality of the fit when you use an equation considering one tri-dimensional and one bi-dimensional population of fluorophores?

Thank you very much.

2

Reply

Posted by: Sergio L.April 5, 2013, 10:45 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Waiting
simple hit counter