Bepaling van de lipid raft van afscherming van fluorescent-gelabelde probes in levende cellen met behulp van fluorescentie Correlatie Spectroscopie (FCS)

1. Kalibratie van de FCS Setup

1. Start de confocale microscoop, lasers, computers, incubator voor temperatuur-en CO _2-controle.
2. Zorg ervoor dat de SPAD (Single Photon Avalanche Diode) is ingeschakeld en de fluorescentie filter in de SPAD is zeer geschikt voor uw monster. Controleer of de SPAD wordt gesynchroniseerd in de tijd. Let op alleen begin je FCS-software zodra je SPAD instellingen zijn klaar voor overname.
3. Bereid een verse oplossing van cholera toxine Alexa488 verdund in PBS met een concentratie van 1 ug / ml (17,5 nM) bereikt.
4. Optimaliseren confocale beelden van de oplossing volgens interne detectie van de microscoop.
5. Schakel over naar de scanmodus te wijzen en een punt in de oplossing monster te kiezen. Zorg ervoor dat de duur van de laser verlichting is lang genoeg om je FCS overnames uit te voeren (> 5 minuten).
6. Schakel externe detectie door de SPAD en de FCS software. Bewaak uw fluorescentie-signaal en zorg ervoor dat het goed suibonden met de SPAD (genoeg signaal, maar geen verzadiging, 10 000 tot 50 000 counts / s is prima). Indien nodig, te wijzigen z-positie, winst en / of laservermogen om de juiste fluorescentie-signaal te bereiken.
7. Verwerven van 10 sets van 30 seconden metingen. Acquisitie tijd moet worden geoptimaliseerd voor uw monster (compromis tussen de beste bemonstering en fotobleken problemen).
8. Analyseer uw gegevens (zie stap 4) om ervoor te zorgen dat u een auto-correlatie curve die overeenkomt met een tl-soorten verspreiden in oplossing (vergelijking in Fig. 2) en dat de verspreiding tijd verkregen na montage de juiste is (ongeveer 0,2 ms) (Fig 3.).

2. Kleuring van levende cellen met lipid rafts Marker

1. Plaat HEK293 cellen op 8-goed Labteks bekleed met poly-L-lysine (1mg/ml) de dag voor beeldvorming om ervoor te zorgen dat hun hechting correct is. Gebruik medium zonder fenol rood om ervoor te zorgen is er geen verstoring van de fluorescentie-signaal.
2. Twee keer wassen cellen met HBSS (gebufferde Salt Hank's oplossing).
3. Voeg choleratoxine-Alexa488 (1 pg / ml) / BSA (0,1%) in 500 ul HBSS de cellen 30 minuten bij 37 ° C. Cholera toxine zal binden aan ganglioside GM1, bekend bij voorkeur worden gepartitioneerd in lipid rafts.
4. Twee keer wassen cellen met HBSS (gebufferde Salt Hank's oplossing).

3. FCS Data Acquisition op levende cellen

1. Plaats de gekleurde cellen op de microscoop podium. Zorg ervoor dat de temperatuur en CO _{2-omstandigheden} optimaal zijn anders kan dit leiden tot artefacten in diffusie tijden.
2. Optimaliseer confocale beelden van een cel van belang met behulp van interne detectie van de microscoop (afb. 4).
3. Schakel over naar de scanmodus te wijzen en een punt in de plasmamembraan van de cel van belang te kiezen. Voer 1-2 live-beelden van de cel te zorgen dat de cel niet beweegt tijdens de overname.
4. Schakel over naar de externe detectie door de SPAD en aan de FCS software. Bewaak uw fluorescentie-signaal en zorg ervoor dat het zeer geschikt voor de SPAD (genoeg signaal, maar geen verzadiging, 10 000 tot 50 000 counts / s is prima). Indien nodig, te wijzigen z-positie, winst en / of laservermogen om de juiste fluorescentie-signaal te bereiken. Als dit niet genoeg is, kunt u overwegen te veranderen vlekken omstandigheden.
5. Verwerven 10 monsters van 30 seconden gemeten. Aangezien de meeste cellen zijn auto-tl, kunt u een afname van de fluorescentie te zien tijdens de eerste aankopen, als gevolg van auto-fluorescentie vervagen.

4. FCS Data Analyse

1. Stel de correlatie interval genereren autocorrelatie krommen met FCS software. De correlatie interval zal doorgaans variëren van de kortste oplosbare vertraging tot aan de langste tijd mogelijk zijn (zoals de statistieken van de meting wordt meer en meer onvoldoende wanneer de maximale correlatietijd totale overnameprijs tijd nadert, is de maximale vertraging is beperkt tot 80% van de acquisitietijd de Picoquant software).
2. Voor elk monster uitvoeren bestanden die van fluorescentie fluctuaties en autocorrelatiefunktie als functie van de tijd.
3. Gebruik een data-analyse en passende software zoals Origin Pro om de bestanden te importeren.
4. Voor elk monster, zorg ervoor dat er geen fotobleken tijdens overname wil zeggen de fluorescentie blijft stabiel tijdens de 30 seconden. Gooi alle maatregelen die het weergeven van fotobleken, omdat dit kan leiden tot kunstmatige meer diffusie tijden.
5. Controleer de vorm van de resterende FCS krommen juist is (zie figuur 5). Bepaal de gemiddelde FCS curve.
6. Breng de curve met de juiste wiskundig model (Fig. 2). Deze fit geeft je de diffusie tijd (s) en het aandeel van moleculen verspreiden met deze (ESE) diffusie tijd (s).

5. Representatieve resultaten

Een voorbeeld van een FCS ijking met een cholera toxine Alexa488 oplossing is getoond in figuur 3 (figuur 3A), individuele vertonen en gemiddelde FCS curven werden berekend. Gemiddelde FCS curven voorzien vergelijkingen overeenkomstige verschillende diffusiemodellen (voorbeelden in figuur 2). De parameter klassiek als de kwaliteit van een geschikt vast is determinatiecoëfficiënt ^R2. Hoe dichter ^R2 1, hoe beter de past. In dit geval is de meest nauwkeurige model de gemiddelde FCS curve past is een beschrijving van een populatie van fluorescerende moleculen diffusie vrij in drie dimensies (vergelijking 1 in figuur 2 en figuur 3B). De diffusietijd uit de passing 0,32 ms. Residuen van curve-fitting (Figuur 3C) ^en R2 factor (0,99906) geven een schatting van de kwaliteit van de pasvorm.

Een voorbeeld van FCS-analyse voor cholera toxine-Alexa488 lood HEK293 cellen in figuur 5. De multifasische gemiddelde FCS curve vorm onthult het bestaan ​​van populaties van fluorescerende moleculen met verschillende diffusie tijden. De beste past bij de kromming overeenkomt met een model met drie populaties van fluorescerende probes: twee met een gehinderde diffusie (diffusie in twee dimensies in het membraan vlak) en een vrij diffusievast maakt in drie dimensies (vergelijking 2 in figuur 2 en figuur 5) . Dit laatste populatie overeen met fluorescerende moleculen zich buiten het membraan vlak, namelijk bindend of ontbinding hun membraan doelstellingen bereikt het membraan door afscheiding of recycling traject, of uit het membraan door endocytose. De twee diffusie tijden het membraan, overeenkomend met choleratoxine gebonden GM1, werden 2 ms (25% moleculen), overeenkomend met diffusie buiten rafts en 75 ms (50% moleculen), overeenkomend met diffusie in rafts . Houd er rekening mee dat elke photobleachING tijdens de overname zal leiden tot een kunstmatige meer diffusie keer wellicht dus ook het creëren van een voorkeur voor lokalisatie van GM1 in lipid raft domeinen.

Figuur 1. Schematische weergave van de FCS opstelling (figuur gemodificeerd uit Marquer et al. ^12).

Figuur 2. Voorbeeld van een diffusie-modellen en de bijbehorende vergelijkingen gebruikt om autocorrelatie bochten te passen. De structuur parameter S kan worden geschreven als S = z ₀ / w ₀ met z ₀ effectieve centrale straal langs de optische as 1 / e ² intensiteit w0 effectieve laTeral focale straal van 1 / e ² intensiteit. Deze waarden kunnen worden geëxtraheerd uit een klassiek punt spreiding functie (PSV) meting.

Figuur 3. Beoordeling van diffusie tijd van cholera toxine-Alexa488 in oplossing voor FCS kalibratie. A) Fluorescentie fluctuatie als functie van de tijd voor een representatief voorbeeld van 30 seconden acquisitie. B) Gemiddelde autocorrelatie verkregen kromme 10 monsters van 30 seconden verkrijging voorzien formule 1 (zie figuur 2). C) residuen van curve fitting.

Figuur 4. HEK-293 cellen gekleurd met cholera toxine-Alexa488. De cellen werden afgebeeld op een SP5 confocale microscoop (Leica Microsystems, Wetzlar, Duitsland) met de interne 488nm laser lijn. Fluorescentie werd verzameld met een x60 plannen apochromat olie-immersie objectief tussen de 500en 650 nm.

Figuur 5. Beoordeling van diffusie tijd van cholera toxine-Alexa488 op de plasmamembraan van HEK293 cellen. A) Gemiddelde autocorrelatie curve voorzien vergelijking 2 (zie figuur 2). B) residuen van curve fitting. (Gemodificeerd uit Marquer et al. ^12).

De FCS hier gepresenteerde methode zorgt voor een gevoelige en snelle analyse van de lipid raft verdeling van fluorescerende probes van belang in levende cellen. FCS combineert de nauwkeurigheid van de lokalisatie van confocale microscopie met de gevoeligheid van single photon tellen. Het belangrijkste verschil tussen FCS en standaard technieken is dat biochemische FCS de absolute bepaling van de rafts verdeling van het doel en niet de relatieve verdeling kan zoals het geval is DRM isolatie of co-patching.

Verwerving van FCS data duurt ongeveer 5 minuten (10 verwerving van 30 seconden) voor elk monster en is daarom snel vergeleken met gebruikelijke technieken biochemische. Deze snelheid maakt het mogelijk om te volgen in de tijd van de verstoring in lipid raft verdeling als gevolg van drugsverslaving. Echter, de analyse van autocorrelatie bochten een beetje tricky zijn als de verschillende modellen voor montage moeten worden doorzocht door naar de vast te stellennauwkeurigste. Bovendien fotobleken tijdens acquisitie te worden vermeden omdat dit kan leiden tot artefacten.

Hier beschrijven we een voorbeeld waar we de lipid raft verdeling van een lipide af te bakenen: ganglioside GM1 (afb. 5). Een dergelijk onderzoek zou niet mogelijk zijn met standaard biochemische die alleen kan worden toegepast om eiwitten. FCS is niet beperkt tot lipiden al en kunnen ook worden gebruikt voor eiwitten, hetzij gelabeld met een fluorescerende ligand (bijvoorbeeld transferrine Alexa555 bindt aan de transferrinereceptor, bekende buiten vlotten ⁹⁾ of uitgedrukt als een fusie met een fluorescerend eiwit (bijv. APP-YFP of BACE1-GFP ^9, twee belangrijke spelers eiwit bij de ziekte van Alzheimer). Derhalve kan worden gebruikt voor een groot aantal doelen. Verder kan niet alleen FCS worden uitgevoerd cellijnen, zoals hier beschreven, maar ook in primaire kweken ^9.

Met betrekking tot cholera toxine, moet u rekening houden metdat het heeft de neiging te aggregeren GM1 in pentamers, waardoor membraan micro-domeinen die kunnen afwijken van de inheemse lipid rafts. Dat is de reden waarom u niet kunt colocalisation gebruiken met cholera toxine te bepalen of uw eiwit van belang is binnen of buiten vlotten. Niettemin eiwitten, zoals APP-YFP en BACE1-GFP, diffunderen in rafts met diffusie tijd van 60-80 ms ^9, vergelijkbaar met wat gezien cholera toxine (75 ms). Zo cholera toxine kan worden gebruikt om uw set-up te kalibreren en dat je onderscheid maken tussen snelle en langzame diffusie keer te controleren.

FCS is ook geschikt voor vele andere toepassingen ^13,14 zoals de bepaling van de oligomerisatie toestand van een eiwit ¹⁵ of ligand / receptor farmacologisch onderzoek ^16. Het kan ook worden gekoppeld aan andere microscopische technieken, zoals Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) ^17,18 of gestimuleerde emissie uitputting (STED) ^19.Inderdaad, STED-FCS laat een nog nauwkeurige bepaling van lipid raft partitioneren van ¹⁹ maar tot nu toe, STED microscopie is nog steeds duur en dus niet wijdverspreid.

De belangrijkste grenzen van FCS zijn de behoefte aan lage concentraties van fluoroforen (in het nanomolaire bereik) en snelle verspreiding keer, zodat fluoroforen zal niet photobleach voor het verlaten van de excitatie volume. Aanvullende technieken om de verspreiding van eiwitten te beoordelen zijn FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) en ICS (Image Correlation Spectroscopy) technieken (overzicht in ^20).

In FRAP, is een hoge intensiteit laserstraal gebruikt om een ​​gebied van een cel en het herstel van fluorescentie na fotobleken wordt dan bewaakt photobleach. Dit herstel afkomstig van de diffusie van fluoroforen van ongebleekt gebieden het gebleekte gebied. Zo is de diffusie tijden kunnen worden geëxtraheerd uit het herstel kinetiek. FRAP kan met hoge concentraties of fluoroforen en toegang tot groot scala aan diffusie keer, waardoor het een aanvulling op FCS. FRAP is gebruikt om te beoordelen of een fluorofoor was in meerderheid binnen of buiten vlotten ^21,22, maar het is nog steeds een vrij bulk methode om het aandeel van de fluoroforen verspreiden binnen of buiten vlotten op het gebied van belang te kwantificeren.

ICS is een beeldvormende analoog FCS, waarin de ruimtelijke correlatie wordt berekend door pixel pixel van een gegeven ^23. Het heeft het voordeel dat zij vatbaar zijn voor de studie van langzaam verspreiden fluorescerende probes, maar is beperkt tot 2D-analyse. Deze limiet werd overwonnen door de ontwikkeling van ICS genoemd in ruimte en tijd ICS (PEN) ^24. PEN maakt spatio-temporele correlatie van fluorescerende probes op een stapel foto's en is dus een krachtige techniek maar het vergt veel van de computationele implementatie en heeft een lagere resolutie dan de tijd FCS. In feite zijn zowel ICS en PEN beperkt tot veel trager th verwerkeneen van de acquisitie tijd van een beeld frame. Een andere uitbreiding van ICS genoemd raster ICS (RICS) ^25,26 maakt de analyse van de snelle diffusie proces door gebruik te maken van het raster scan-modus beschikbaar op de meeste commerciële confocale microscopen. RICS is veelzijdig als het kan worden gebruikt voor een grote verspreiding bereik (van ps naar MS), maar de uitvoering ervan (het scannen van parameters, data verwerking) omslachtig kan zijn. We hebben niet veel kranten in de literatuur de rapportage van het gebruik van ICS en daarvan afgeleide technieken om te studeren lipid rafts ^27-29.