Bestemmelse af lipidklump opdeling af fluorescens-mærkede prober i levende celler ved fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS)

1. Kalibrering af FCS opsætning

1. Start konfokal mikroskop, lasere, computere, inkubator for temperatur og CO ₂ kontrol.
2. Sørg for, at SPAD (Single Photon Avalanche Diode) er tændt, og fluorescens filteret i SPAD er velegnet til din prøve. Kontroller, at SPAD er synkroniseret i tid. Pas på kun at starte din FCS-softwaren, når dine SPAD indstillinger er klar til overtagelse.
3. Fremstilling af en frisk opløsning af koleratoksin-Alexa488 fortyndet i PBS for at opnå en koncentration på 1 ug / ml (17,5 nM).
4. Optimere konfokal billeddannelse af opløsningen under anvendelse indre detektering af mikroskopet.
5. Skift til pege scanning mode og vælge et punkt i løsningen prøven. Sørge varighed laserbelysning er lang nok til at udføre Deres FCS erhvervelser (> 5 minutter).
6. Skifte til ekstern detektion af SPAD og til FCS software. Overvåg dit fluorescens signal og sørg for at det er godt suiTED til SPAD (nok signal men ingen mætning, 10 000 til 50 000 tællinger / s er fint). Hvis det er nødvendigt, ændre z position, gevinst og / eller laser magt til at opnå korrekt fluorescens signal.
7. Erhverve 10 sæt på 30 sekunder målinger. Køb tid bør være optimeret til din prøve (kompromis mellem de bedste prøvetagning og fotoblegemidler problemer).
8. Analyser dine data (se trin 4) at sikre, at du har en auto-korrelation kurven, der svarer til en fluorescerende arter diffuserer i opløsning (ligning i fig. 2), og at diffusionen tiden fås efter montering er korrekt (ca. 0,2 ms) (Fig 3).

2. Farvning af levende celler med lipidklumper Marker

1. Plade HEK293 celler på 8-brønds Labteks coatet med poly-L-lysin (1mg/ml) dagen før billeddannelse at sikre, at deres adhæsion er korrekt. Anvende medium uden phenolrødt at sikre, at der ikke er nogen forstyrrelse af fluorescenssignal.
2. Vask cellerne to gange med HBSS (Hanks Buffered Salt Solution).
3. Tilsættes koleratoksin-Alexa488 (1 ug / ml) / BSA (0,1%) i 500 pi HBSS til cellerne i 30 minutter ved 37 ° C. Choleratoksin vil binde til gangliosid GM1, vides at være fortrinsvis delt i lipidklumper.
4. Vask cellerne to gange med HBSS (Hanks Buffered Salt Solution).

3. FCS Data Acquisition på levende celler

1. Anbring de farvede celler på mikroskopbordet. Sørg for, at temperatur og CO ₂ betingelser er optimale ellers kan føre til artefakter i diffusions gange.
2. Optimere konfokal billeddannelse af en celle af interesse under anvendelse indre detektion af mikroskop (fig. 4).
3. Skifte til punkt scanningstilstand og vælge et punkt i plasmamembranen i cellen af ​​interesse. Udfør 1-2 live-billeder af cellen for at sikre, at cellen ikke bevæge sig under overtagelsen.
4. Skifte til ekstern detektion af SPAD og til FCS blødeware. Overvåg dit fluorescens signal og sørg for at det er velegnet til SPAD (nok signal men ingen mætning, 10 000 til 50 000 tællinger / s er fint). Hvis det er nødvendigt, ændre z position, gevinst og / eller laser magt til at opnå korrekt fluorescens signal. Hvis dette ikke er nok, kan du overveje at ændre farvningsbetingelser.
5. Erhverve 10 prøver af 30 sekunder målinger. Da de fleste celler er auto-fluorescerende, kan du se et fald i fluorescens i de første opkøb, på grund af auto-fluorescens fading.

4. FCS Dataanalyse

1. Indstil korrelationen interval og generere autokorrelation kurver med FCS-softwaren. Sammenhængen interval vil typisk strække sig fra den korteste detaljeopløsning Tidsforsinkelsen op til den længste tid muligt (da statistikken af ​​målingen bliver mere og mere utilstrækkelig, når den maksimale korrelation tiden nærmer sig total overtagelse tid, er den maksimale Tidsforsinkelsen begrænset til 80% af opsamlingstid på Picoquant software).
2. For hver prøve, eksportere filer svarende til fluorescens udsving og auto-korrelation som en funktion af tiden.
3. Brug en dataanalyse og tilpasningssoftware såsom oprindelse Pro til at importere filerne.
4. For hver prøve, sørg for der er ingen fotoblegning under købet, dvs fluorescens forbliver stabil under de 30 sekunder. Kassér enhver foranstaltning, der viser fotoblegning da dette kan forårsage kunstige længere diffusions gange.
5. Kontrollere, at formen af den resterende FCS kurver er korrekt (se figur 5). Bestemme den gennemsnitlige FCS kurve.
6. Passer kurve med den passende matematiske model (fig. 2). Dette pasform vil give dig den diffusion gang (e), og andelen af ​​molekyler diffunderende med denne (disse) diffusion gang (e).

5. Repræsentative resultater

Et eksempel på en FCS kalibrering med en koleratoksin-Alexa488 løsning er vist i figur 3 (figur 3A), individuelle og gennemsnitlige FCS kurver blev beregnet. Betyder FCS kurver blev udstyret med ligninger svarende til forskellige diffusionsmodeller (eksempler i figur 2). Den parameter klassisk anses for at bestemme kvaliteten af en fit er determinationskoefficienten R ^2. Jo tættere ^R2 er en, jo bedre pasform. I dette tilfælde er den mest nøjagtige model til at passe til middelværdien FCS kurve den ene beskriver en population af fluorescerende molekyler diffunderende frit i tre dimensioner (ligning 1 i figur 2 og figur 3B). Diffusionstiden afledt af pasform 0,32 ms. Rester fra kurvetilpasning (figur 3C) ^og R2 faktor (0,99906) giver en vurdering af kvaliteten af tilpasningen.

Et eksempel på FCS analyse for koleratoxin-Alexa488 farvet HEK293 celler er vist i figur 5. Den flerfasede gennemsnitlige FCS kurveform viser tilstedeværelsen af ​​populationer af fluorescerende molekyler med forskellige diffusionstider. Den bedste tilpasning til denne kurve svarer til en model med tre populationer af fluorescerende prober: to med en hindret diffusion (diffusion i to dimensioner som i membranen plan) og en frit diffundere i tre dimensioner (ligning 2 i figur 2 og figur 5) . Denne sidstnævnte population svarer til fluorescerende molekyler bevæger ydersiden af ​​membranen planet, dvs enten binding eller uforpligtende deres membran mål, når membranen gennem sekretion eller genvinding pathway eller forlader membranen ved endocytose. De to diffusionsområder gange på membranen svarende til koleratoksin bundet til GM1, var 2 ms (25% af molekylerne) svarende til diffusion uden lipidklumper og 75 ms (50% af molekylerne) svarende til diffusion i lipidklumper . Bemærk, at photobleachING under overtagelse vil føre til en kunstig længere diffusionstider dermed muligvis skabe en bias i retning af lokalisering af GM1 i lipidklump domæner.

Figur 1. Skematisk repræsentation af FCS opsætning (figur modificeret fra Marquer et al. ¹²⁾

Figur 2. Eksempel diffusionsmodeller og tilsvarende ligninger, der anvendes til at passe autokorrelationsfunktioner kurver. Strukturen parameteren S kan skrives som S = z ₀ / w ₀ til z ₀ effektiv fokale radius langs den optiske akse i 1 / e ^to intensitet og w0 effektiv lateral fokus radius på 1 / e ^{2-intensiteten.} Disse værdier kan ekstraheres fra en klassisk punktspredningsfunktionen (PSF) måling.

Figur 3. Vurdering af diffusion tid koleratoksin-Alexa488 i opløsning for FCS kalibrering. A) Fluorescens udsving som en funktion af tid for et repræsentativt eksempel på en 30 sekunder erhvervelse. B) Middel autokorrelation kurve opnået fra 10 prøver af 30 sekunder erhvervelse forsynet med ligning 1 (se figur 2). C) rester fra kurvetilpasning.

Figur 4. HEK-293 celler farvet med koleratoksin-Alexa488. Cellerne blev afbildet på en SP5 konfokalt mikroskop (Leica Microsystems, Wetzlar, Tyskland) med det indre 488 nm laser linje. Fluorescens blev opsamlet med en x60 plan apochromat olieimmersion mål mellem 500og 650 nm.

Figur 5. Vurdering af diffusion tid koleratoksin-Alexa488 på plasmamembranen af HEK293-celler. A) Middel autokorrelation kurve forsynet med ligning 2 (se figur 2). B) restprodukter fra kurvetilpasning. (Modificeret fra Marquer et al. ¹²⁾

FCS Fremgangsmåden præsenteret her muliggør en følsom og hurtig analyse af lipidklump opdelingen af ​​fluorescerende prober af interesse i levende celler. FCS kombinerer nøjagtigheden af ​​placeringen af ​​konfokal mikroskopi med følsomheden af ​​en enkelt foton-tælling. Den største forskel mellem FCS og standard biokemiske teknikker er, at FCS muliggør absolut bestemmelse af lipidklumper deling af målet og ikke den relative partition som det er tilfældet for DRM isolering eller co-lapning.

Erhvervelse af FCS data tager cirka 5 minutter (10 erhvervelse af 30 sekunder) for hver prøve, og er således ganske hurtigt sammenlignet med sædvanlige biokemiske teknikker. Dette hurtighed gør det muligt at følge i tid perturbation i lipidklump partitionering, der kan skyldes narkotikamisbrug. Imidlertid kan analysen af ​​autokorrelationsværdier kurver være en smule vanskelig, da de forskellige modeller for montering skal gennemses at bestemmemest nøjagtige. Desuden fotoblegning under erhvervelse skal undgås, da dette kan føre til artefakter.

Her beskriver vi et eksempel, hvor man kan afgrænse lipidklump opdeling af et lipid: gangliosid GM1 (fig. 5). En sådan undersøgelse ville ikke have været mulig med standard biokemiske fremgangsmåder, som kun kan anvendes på proteiner. FCS er ikke begrænset til lipider selv og kan også anvendes for proteiner, enten mærket med et fluorescerende ligand (f.eks transferrin-Alexa555 binder til transferrin-receptoren, vides at være placeret uden for klumper ⁹⁾ eller udtrykkes som en fusion med et fluorescerende protein (f.eks APP-YFP eller Bace1-GFP ^9, to centrale protein spillere i Alzheimers sygdom). Det kan således anvendes til en lang række mål. Endvidere kan FCS gennemføres ikke kun i cellelinier, som beskrevet her, men også i primære kulturer ^9.

Hvad angår kolera toksin, skal du huskeat den har en tendens til at aggregere GM1 i pentamerer, således skaber membran mikroorganismer domæner, kan være forskellig fra native lipidklumper. Det er derfor, du kan ikke bruge colocalisation med kolera toksin at afgøre, om din protein af interesse er inden for eller uden for flåder. Ikke desto mindre membranproteiner, såsom APP-YFP og Bace1-GFP og diffundere i lipidklumper med diffusionstider på 60-80 ms ^9, der ligner det, der blev observeret med koleratoksin (75 ms). Således koleratoksinet kan bruges til at kalibrere din set-up, og kontrollere, at du kan skelne mellem hurtige og langsomme diffusions gange.

FCS er også velegnet til mange andre anvendelser ^13,14 såsom bestemmelse af oligomerisering tilstand af et protein ¹⁵ eller ligand / receptor farmakologiske undersøgelser ^16. Det kan også være koblet til andre mikroskopi teknikker, såsom total indre refleksion Fluorescens (TIRF) ^17,18 eller stimuleret emission depletion (Sted) ^19.Faktisk Sted-FCS giver en endnu mere nøjagtig bestemmelse af lipidklump partitionering ^19, men indtil nu, Sted mikroskopi er stadig dyrt, og derfor ikke udbredt.

De vigtigste begrænsninger FCS er behovet for lave koncentrationer af fluoroforer (i det nanomolære område) og hurtige diffusion gange, således at fluoroforer vil ikke photobleach før de forlader excitation volumen. Supplerende teknikker til at vurdere udbredelsen af proteiner omfatter FRAP (Fluorescence Recovery Efter Fotoblegning) og ICS (Billede Correlation Spectroscopy) teknikker (revideret i ^20).

I FRAP er en høj intensitet laserstråle anvendes til photobleach en region af en celle og genvinding af fluorescens efter fotoblegning overvåges derefter. Dette opsving kommer fra diffusion af fluoroforer fra ikke-bleget områder til bleget området. Således diffusions gange kan hentes fra inddrivelse kinetik. FRAP kan anvendes ved høje koncentrationer of fluorophorer og kan få adgang til store udvalg af diffusion gange, hvilket gør det komplementære til FCS. FRAP er blevet anvendt til at vurdere, hvorvidt en fluorofor er fleste af svarene indersiden eller ydersiden af klumper ^21,22, men det er stadig en ret løs fremgangsmåde til at kvantificere antallet af fluoroforer spredende eller uden klumper i området af interesse.

ICS er en afbildning analog med FCS, hvor rumlig korrelation beregnes pixel for pixel for et givet billede ^23. Det har den fordel at være egnet til undersøgelse af langsomt diffunderende fluorescerende prober, men er begrænset til 2D analyse. Denne grænse blev overvundet af udviklingen af ICS betegnes spatio-Temporal ICS (STICS) ^24. STICS muliggør spatio-temporal korrelation af fluorescerende prober på en stak af billeder og er således en kraftfuld teknik om det kræver en masse beregningsmæssige implementering og har en lavere tidsopløsning end FCS. Faktisk er både ICS og STICS begrænset til behandling af meget langsommere then erhvervelse på én billedramme. En anden udvidelse af ICS kaldet raster ICS (RICS) ^25,26 muliggør hurtig analyse af diffusion proces ved at drage fordel af raster scanning tilgængelig på de fleste kommercielle konfokale mikroskoper. RICS er alsidig, da det kan bruges til en lang diffusion interval (fra us til ms), men dens gennemførelse (scanning parametre, databehandling) kan være besværligt. Vi kunne ikke finde mange papirer i litteraturen indberetning brugen af ICS og dens afledte teknikker til at studere lipidklumper ^27-29.