Bestämning av lipidaggregat avskärmning av fluorescensmärkt taggade proberna i levande celler genom fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS)

1. Kalibrering av FCS inställning

1. Starta konfokalmikroskop, lasrar, datorer, inkubator för temperaturmätning och CO ₂ kontroll.
2. Se till att SPAD (Single Photon Avalanche Diode) är påslagen och fluorescensen filtret i SPAD lämpar sig väl för ditt prov. Kontrollera att SPAD är synkroniserad i tid. Akta bara starta FCS programmet när dina SPAD inställningarna är klara för förvärvet.
3. Framställ en färsk lösning av koleratoxin-Alexa488 späddes i PBS för att nå en koncentration av 1 pg / ml (17,5 nM).
4. Optimera konfokal avbildning av lösningen med användning av inre detektering av mikroskopet.
5. Växla till punkt scanning och välj en punkt i lösningen provet. Se till att varaktigheten av lasern belysningen är tillräckligt lång för att utföra dina FCS förvärv (> 5 minuter).
6. Växla till extern detektion av SPAD och till FCS programvaran. Övervaka din fluorescenssignal och se det är väl suiTed till SPAD (tillräckligt signal men ingen mättnad, 10 000 till 50 000 pulser / s är bra). Om det behövs, ändra z-positionen, förstärkning och / eller laser makt för att uppnå rätt fluorescenssignal.
7. Skaffa 10 uppsättningar av 30 sekunder mätningar. Förvärv tid bör optimerad för ditt prov (kompromiss mellan bästa provtagning och fotoblekningsfrekvenser problem).
8. Analysera data (se steg 4) att se till att du har en auto-korrelation kurvan motsvarar en fluorescerande arter sprida i lösning (ekvation i figur. 2) och att spridningen tiden erhålls efter montering är korrekt (cirka 0,2 ms) (Fig . 3).

2. Färgning av levande celler med lipidaggregat Marker

1. Plate HEK293 celler på 8-samt Labteks belagda med poly-L-lysin (1 mg) dagen innan bildbehandling för att se till att deras vidhäftning är korrekt. Använda medium utan fenolrött att säkerställa att det inte finns någon störning av den fluorescenssignal.
2. Tvätta cellerna två gånger med HBSS (Hanks buffrade saltlösning).
3. Tillsätt koleratoxin-Alexa488 (1 pg / ml) / BSA (0,1%) i 500 | il HBSS till cellerna under 30 minuter vid 37 ° C. Koleratoxin kommer att binda till gangliosid GM-1, kända för att företrädesvis fördelades i lipidaggregat.
4. Tvätta cellerna två gånger med HBSS (Hanks buffrade saltlösning).

3. FCS Data Acquisition på levande celler

1. Placera de färgade cellerna på mikroskopställningen. Se temperatur och _CO2 förhållanden är optimala annars kan leda till artefakter i diffusions gånger.
2. Optimera konfokal avbildning av en cell av intresse med användning av inre detektering av ett mikroskop (fig. 4).
3. Växla till punkt avsökningsmod och välja en punkt i plasmamembranet hos cellen av intresse. Utför 1-2 levande bilder av cellen att se till att cellen inte rör sig under förvärvet.
4. Växla till extern detektion av SPAD och till FCS mjukaware. Övervaka din fluorescenssignal och se till att väl anpassad till SPAD (tillräckligt signal men ingen mättnad, 10 000 till 50 000 pulser / s är bra). Om det behövs, ändra z-positionen, förstärkning och / eller laser makt att uppnå korrekt fluorescenssignal. Om detta inte räcker, kan du överväga att ändra färgning förhållanden.
5. Skaffa 10 prover av 30 sekunder mätningar. Eftersom de flesta celler är auto-fluorescerande, kan du se en minskning i fluorescens under de första förvärven, på grund av auto-fluorescens blekning.

4. FCS Dataanalys

1. Ställa in korrelationsintervallet och generera autokorrelationsfunktionerna kurvor med FCS mjukvara. Korrelationen Intervallet varierar typiskt från den kortaste upplösliga fördröjning fram till den längsta möjliga tid (eftersom statistik mätningen blir mer och mer otillräckliga när maximal korrelation tiden närmar sig den totala förvärvet tid, den maximala fördröjning begränsas till 80% av ackvisitionstid på Picoquant programvara).
2. För varje prov, exportera filer motsvarande fluorescensfluktuationer och automatisk korrelation som en funktion av tiden.
3. Använd en dataanalys och montering program som Origin Pro att importera filerna.
4. För varje prov, se till att det inte finns någon fotoblekning under förvärvet dvs fluorescensen förblir stabil under de 30 sekunder. Kasta alla åtgärder visar fotoblekning eftersom detta kan orsaka artificiella längre diffusion gånger.
5. Kontrollera att formen av kvarvarande FCS kurvorna är korrekt (se figur 5). Bestäm medelvärdet FCS kurvan.
6. Passa kurvan med lämplig matematisk modell (fig. 2). Detta passform ger dig spridningen (s) och andelen av molekyler sprida denna (ESE) diffusion (s).

5. Representativa resultat

Ett exempel pÃ¥ en FCS kalibrering med en koleratoxin-Alexa488 lösning visas i figur 3 (figur 3A), individuell och innebär FCS kurvor beräknades. Innebär FCS kurvor utrustade med ekvationer motsvarar olika diffusionsmodeller (exempel i Figur 2). Parametern klassiskt ansÃ¥g att avgöra kvaliteten pÃ¥ en passning är determinationskoefficienten R ^2. Ju närmare R ² är att 1, desto bättre passform. I detta fall är den mest korrekta modellen för att passa den genomsnittliga FCS kurvan ena beskriver en population av fluorescerande molekyler diffunderar fritt i tre dimensioner (ekvation 1 i figur 2 och figur 3B). Den diffusionstid härrör frÃ¥n passformen är 0,32 ms. Rester frÃ¥n kurvanpassning (figur 3C) och R ² faktor (0,99906) ger en uppskattning av kvaliteten pÃ¥ passform.

Ett exempel på FCS analys för kolera toxin-Alexa488 färgade HEK293 celler visas i Figur 5. Den multiphasic genomsnittliga FCS kurvform visar att det föreligger populationer av fluorescerande molekyler med olika diffusion tider. Den bästa passform för den här kurvan motsvarar en modell med tre populationer av fluorescerande prober: två med en hindrad spridning (spridning i två dimensioner som i membranet planet) och en fritt sprida i tre dimensioner (ekvation 2 i figur 2 och figur 5) . Det senare population motsvarar fluorescerande molekyler flyttar utanför membranet planet, det vill säga antingen bindande eller ej bindande deras membran mål, når membranet genom utsöndring eller återvinning vägen, eller lämnar membranet genom endocytos. De två diffusionsområdena gånger vid membranet, som svarar mot kolera-toxin bundet till GM1, var 2 ms (25% av molekylerna), motsvarande diffusion utanför lipidaggregat och 75 MS (50% av molekylerna), motsvarande diffusion i lipidaggregat . Observera att all photobleachIng under Förvärvet kommer att leda till konstgjorda längre diffusionstider därmed eventuellt skapa en inriktning mot lokalisering av GM1 i lipidaggregat domäner.

Figur 1. Schematisk representation av FCS strukturen (bild modifierat frÃ¥n Marquer et al. ¹²⁾

Figur 2. Exempel pÃ¥ diffusionsmodeller och motsvarande ekvationer som används för att passa autokorrelationen kurvor. Strukturen parametern S kan skrivas som S = z ₀ / w ₀ med z ₀ effektiv fokus radien längs den optiska axeln vid 1 / e ² intensitet och W0 effektiv larala fokal radie pÃ¥ 1 / e ² intensitet. Dessa värden kan extraheras frÃ¥n en klassisk punktspridningsfunktion (PSF) mätning.

Figur 3. Bedömning av diffusionstiden av koleratoxin-Alexa488 i lösning för FCS kalibrering. A) Fluorescens variation som funktion av tid för ett representativt exempel på en 30 sekunder förvärv. B): autokorrelation erhållen från 10 prover av 30 sekunder förvärvet utrustad med ekvation 1 (se figur 2). C) rester från kurvanpassning.

Figur 4. HEK-293 celler färgades med koleratoxin-Alexa488. Cellerna försågs med bild på en SP5 konfokalmikroskop (Leica Microsystems, Wetzlar, Tyskland) med den inre 488nm laserlinjen. Fluorescens samlades med en x60 plan för apochromat oljeimmersion mål mellan 500och 650 nm.

Figur 5. Bedömning av diffusionstiden av koleratoxin-Alexa488 vid plasmamembranet av HEK293-celler. A) medel-autokorrelation kurvan anpassades med ekvation 2 (se figur 2). B) rester frÃ¥n kurvanpassning. (Modifierad frÃ¥n Marquer et al. ¹²⁾

FCS metod som presenteras här ger en känslig och snabb analys av lipidaggregat avskärmning av fluorescerande prober av intresse i levande celler. FCS kombinerar noggrannheten av lokaliseringen av konfokalmikroskopi med känsligheten hos enda fotonräkning. Den största skillnaden mellan FCS och standard biokemiska tekniker är att FCS möjliggör absoluta bestämning av lipidaggregat partitionen på målet och inte den relativa partition som är fallet för DRM isolering eller co-lapp.

Anskaffning av FCS data tar ungefär 5 minuter (10 förvärv av 30 sekunder) för varje prov och således ganska snabb i jämförelse med vanliga biokemiska metoder. Det snabbhet gör det möjligt att följa i tid störning på lipidaggregat uppdelning som kan uppstå drogberoende. Kan dock analysen av autokorrelationen kurvorna vara lite knepigt eftersom de olika modeller för montering måste bläddrat igenom för att bestämmamest riktiga. Dessutom fotoblekning vid förvärv måste undvikas eftersom detta kan leda till artefakter.

Här beskriver vi ett exempel där vi kan avgränsa lipidaggregat uppdelning av en lipid: gangliosid GM1 (Fig. 5). En sÃ¥dan studie skulle inte ha varit möjligt med standardiserade biokemiska förfaranden som endast kan tillämpas pÃ¥ proteiner. FCS är inte begränsade till lipider dock och kan ocksÃ¥ användas för proteiner, antingen märkt med en fluorescerande ligand (t.ex. transferrin-Alexa555 binder till transferrinreceptorn, kända för att vara placerad utanför flottar ⁹⁾ eller uttryckt som en fusion med en fluorescerande protein (t.ex. APP-YFP eller Bace1-GFP ^9, tvÃ¥ viktiga proteiner spelare i Alzheimers sjukdom). Den kan sÃ¥ledes användas för en mängd olika mÃ¥l. Vidare kan FCS genomföras inte bara i cellinjer, som beskrivs här, men ocksÃ¥ i primära kulturer ^9.

När det gäller kolera toxin, bör du tänka påatt den har en tendens att aggregera GM1 i pentamerer, vilket skapar membran mikro-domäner som kan skilja sig från infödda lipidaggregat. Det är därför du inte kan använda colocalisation med koleratoxin att avgöra om ditt protein av intresse är inom eller utanför flottar. Ändå sprida membranproteiner, såsom APP-YFP och Bace1-GFP, i lipidaggregat med diffusion tider på 60-80 ms ^9, som liknar vad som observerats med koleratoxin (75 ms). Således kolera toxin kan användas för att kalibrera din set-up och kontrollera att du kan skilja mellan snabba och långsam diffusion gånger.

FCS lämpar sig ocksÃ¥ för mÃ¥nga andra tillämpningar ^{ökats med 13,14} sÃ¥som bestämning av oligomerisering tillstÃ¥ndet hos ett protein ¹⁵ eller ligand / receptor farmakologiska studier ^16. Den kan ocksÃ¥ kopplas till andra mikroskopitekniker sÃ¥som fluorescens vid total internreflexion (TIRF) ^17,18 eller stimulerad emission Utarmning (sted) ^19.I själva verket gör sted-FCS en ännu mer noggrann bestämning av lipidaggregat avskärmning ¹⁹ men fram till nu är sted mikroskopi fortfarande dyrt och därför inte utbredd.

De huvudsakliga begränsningarna för FCS är behovet av låga koncentrationer av fluoroforer (i det nanomolära området) och snabba spridning, så att fluoroforema kommer inte photobleach innan det lämnar excitering volym. Kompletterande metoder för att bedöma spridningen av proteiner inkluderar FRAP (fluorescens återhämtning efter fotoblekning) och ICS (Bild Correlation Spectroscopy) tekniker (över ^20).

I FRAP, är en hög intensitet laserstråle som används för att photobleach en region av en cell och återvinning av fluorescens efter fotoblekning övervakas sedan. Denna återhämtning kommer från diffusionen av fluoroforer från icke-blekta områden till blekta området. Således diffusion tider kan extraheras från återvinningen kinetik. FRAP kan användas med höga koncentrationer of fluoroforer och kan komma stort utbud av diffusionsprocesser gånger, vilket gör det ett komplement till FCS. FRAP har använts för att bedöma huruvida en fluorofor var majoritarily insidan eller utsidan av flottar ^21,22 men det är ändå en ganska bulk metod för att kvantifiera hur stor andel av fluoroforer sprida innanför eller utanför flottar i området av intresse.

ICS är en avbildning analog av FCS, i vilken spatial korrelation beräknas pixel för pixel för en given bild ^23. Den har fördelen att vara mottagliga för att studera långsamt sprida fluorescerande prober, men är begränsad till 2D analys. Denna gräns har övervinnas genom utvecklingen av ICS kallas tid och rum ICS (STICS) ^24. STICS gör rums-tidsmässig korrelation av fluorescerande prober på en bunt bilder och är därmed en kraftfull teknik men det kräver en hel del computational genomförande och har en lägre tidsupplösning än FCS. I själva verket är både ICS och STICS begränsas till processen mycket långsammare then ackvisitionstiden av en bildram. En annan utvidgning av ICS kallas raster ICS (RICS) ^25,26 möjliggör analys av snabb spridning genom att dra nytta av den raster scanningsläge finns i de flesta kommersiella konfokala mikroskop. RICS är mångsidig eftersom den kan användas för en stor diffusion intervall (från is till ms) men dess genomförande (avsökningstäthet, databehandling) kan vara betungande. Vi hittade inte många tidningar i litteraturen rapporterar att använda ICS och bearbetade för att studera lipidaggregat ^27-29.