Détermination de radeaux lipidiques partitionnement de sondes par fluorescence-marqués dans les cellules vivantes par spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS)

1. Calibrage de l'installation de FCS

1. Démarrez le microscope confocal, les lasers, les ordinateurs, un incubateur pour la température et le CO ₂ de contrôle.
2. Assurez-vous que le SPAD (Single Photon Avalanche Diode) est allumé et le filtre de fluorescence à l'intérieur du SPAD est bien adapté à votre échantillon. Vérifiez que le SPAD est synchronisé dans le temps. Attention à ne lancer votre logiciel FCS fois vos paramètres SPAD sont prêts pour l'acquisition.
3. Préparer une solution fraîche de la toxine cholérique Alexa488 dilué dans du PBS pour atteindre une concentration de 1 pg / ml (17,5 nM).
4. Optimiser imagerie confocale de la solution en utilisant la détection interne du microscope.
5. Se mettre en mode de balayage et de choisir un point dans l'échantillon de solution. Assurez-vous que la durée de l'éclairage laser est suffisamment long pour effectuer vos acquisitions FCS (> 5 minutes).
6. Mettre à la détection externe par le SPAD et le logiciel FCS. Surveillez votre signal de fluorescence et assurez-vous qu'il est bien suiTed à la SPAD (signal suffisant, mais pas de saturation, de 10 000 à 50 000 points / s est très bien). Si nécessaire, modifier la position z, le gain et / ou la puissance du laser pour atteindre correcte signal de fluorescence.
7. L'acquisition de 10 séries de mesures secondes 30. Le temps d'acquisition doit être optimisé pour votre échantillon (compromis entre le meilleur échantillonnage et les problèmes de photoblanchiment).
8. Analysez vos données (voir l'étape 4) à veiller à ce que vous avez une courbe d'auto-corrélation correspondant à une espèce fluorescentes diffusion en solution (équation dans la Fig. 2) et que le temps de diffusion obtenu après le montage est correct (environ 0,2 ms) (Fig. . 3).

2. La coloration des cellules vivantes avec des lipides radeaux Marker

1. Plate cellules HEK293 sur 8-même Labteks recouvertes de poly-L-lysine (1mg/ml) la veille de l'imagerie afin de s'assurer que leur adhérence est correcte. Utiliser le milieu sans rouge de phénol pour s'assurer qu'il n'y a pas de perturbation du signal de fluorescence.
2. Laver les cellules deux fois avec HBSS (solution de Hank saline tamponnée).
3. Ajouter la toxine cholérique Alexa488 (1 pg / ml) / BSA (0,1%) dans 500 ul HBSS aux cellules pendant 30 minutes à 37 ° C. Toxine cholérique se liera à ganglioside GM1, connu pour être partitionnée préférentiellement dans des radeaux lipidiques.
4. Laver les cellules deux fois avec HBSS (solution de Hank saline tamponnée).

3. FCS Acquisition de données sur des cellules vivantes

1. Placez les cellules colorées sur la platine du microscope. Assurez-vous que la température et de CO ₂ conditions sont optimales autrement cela peut conduire à des artefacts dans les temps de diffusion.
2. Optimiser imagerie confocale d'une cellule d'intérêt en utilisant la détection interne du microscope (fig. 4).
3. Se mettre en mode de numérisation et de choisir un point dans la membrane plasmique de la cellule d'intérêt. Effectuer 1-2 images en direct de la cellule afin de s'assurer de la cellule ne se déplace pas lors de l'acquisition.
4. Mettre à la détection externe de la SPAD et à la douce FCSware. Surveillez votre signal de fluorescence et assurez-vous qu'il est bien adapté à la SPAD (signal suffisant, mais pas de saturation, 10 000 à 50 000 points / s est très bien). Si nécessaire, modifier la position z, le gain et / ou la puissance du laser pour atteindre correcte signal de fluorescence. Si cela ne suffit pas, vous pouvez envisager de modifier les conditions de coloration.
5. L'acquisition de 10 échantillons de mesures secondes 30. Comme la plupart des cellules sont auto-fluorescente, vous pouvez voir une diminution de la fluorescence au cours des premières acquisitions, en raison de l'auto-fluorescence décoloration.

4. FCS Analyse des données

1. Définissez l'intervalle de corrélation et de générer des courbes d'auto-corrélation avec le logiciel FCS. L'intervalle de corrélation varient généralement entre le temps de latence plus court résoluble à le plus longtemps possible (comme les statistiques de la mesure devient de plus en plus insuffisante lorsque le temps de corrélation maximale s'approche le temps total d'acquisition, le temps de latence maximale est limitée à 80% de la temps d'acquisition sur la Picoquant le logiciel).
2. Pour chaque échantillon, exporter des fichiers correspondant à des fluctuations de fluorescence et d'auto-corrélation en tant que fonction du temps.
3. Utiliser une analyse des données et des logiciels de montage telles que l'origine Pro pour importer les fichiers.
4. Pour chaque échantillon, assurez-vous qu'il n'ya pas de photoblanchiment lors de l'acquisition soit la fluorescence reste stable pendant les 30 secondes. Jeter toute mesure affichage photoblanchiment car cela pourrait provoquer artificiels temps de diffusion plus longs.
5. Vérifiez que la forme de la courbe restant FCS est correct (voir figure 5). Déterminer la courbe moyenne de FCS.
6. Monter la courbe avec le modèle mathématique approprié (Fig. 2). Cet ajustement sera de vous donner le temps de diffusion (s) et la proportion de molécules qui diffusent avec ce temps de diffusion (ESE) (s).

5. Les résultats représentatifs

Un exemple d'un étalonnage avec un FCS toxine cholérique Alexa488 solution est montré dans la figure 3 (figure 3A), individuels et moyens des courbes FCS ont été calculés. Mean courbes FCS ont été équipés avec des équations correspondant à différents modèles de diffusion (exemples de la figure 2). Le paramètre classiquement considéré pour déterminer la qualité d'un ajustement est le coefficient de détermination R ^2. Le plus proche R ² est à 1, le meilleur est le modèle. Dans ce cas, le modèle le plus précis pour s'adapter à la courbe moyenne de FCS est la description d'une population de molécules fluorescentes diffusant librement en trois dimensions (l'équation 1 dans la figure 2 et la figure 3B). Le temps de diffusion provenant de l'ajustement est de 0,32 ms. Résidus de courbe-raccord (figure 3C) et R ² facteur (0,99906) fournir une estimation de la qualité de l'ajustement.

Un exemple d'analyse FCS pour la toxine cholérique Alexa488 teinté HEK293 cellules est illustré à la figure 5. La forme moyenne multiphasique courbe FCS révèle l'existence de populations de molécules fluorescentes avec des temps de diffusion différents. Le meilleur ajustement de cette courbe correspond à un modèle à trois populations de sondes fluorescentes: deux avec une diffusion entravée (diffusion en deux dimensions, comme dans le plan de la membrane) et un diffusant librement en trois dimensions (équation 2 dans la Figure 2 et Figure 5) . Population ce dernier correspond à des molécules fluorescentes se déplacent en dehors du plan de membrane, à savoir, soit liaison ou déliaison à leurs cibles membrane, pour atteindre la membrane à travers la voie de sécrétion ou de recyclage, ou sortant de la membrane par endocytose. Les deux temps de diffusion à la membrane, ce qui correspond à la toxine cholérique lié à GM1, sont de 2 ms (25% de molécules), correspondant à la diffusion à l'extérieur de radeaux lipidiques, et 75 ms (50% de molécules), correspondant à la diffusion dans des radeaux lipidiques . S'il vous plaît noter que toute photoblanchimentING lors de l'acquisition conduira à artificielles temps de diffusion plus longs donc peut-être la création d'un biais vers la localisation de GM1 dans les domaines radeaux lipidiques.

Figure 1. Représentation schématique de la FCS set-up (photo modifiée de MARQUER et al. ¹²⁾

Figure 2. Exemple de modèles de diffusion et équations correspondantes utilisées pour ajuster les courbes d'autocorrélation. Le paramètre de structure S peuvent être écrites en tant que S = z ₀ / n ₀ avec z ₀ le rayon focale effective le long de l'axe optique de 1 / e ² intensité et l'efficacité w0 laTeral rayon focal à 1 / e ² intensité. Ces valeurs peuvent être extraites à partir d'un écart de points fonction classique (PSF) de mesure.

Figure 3. Evaluation du temps de diffusion de la toxine cholérique Alexa488 en solution pour l'étalonnage de FCS. A) de fluctuation de fluorescence en fonction du temps pour un exemple représentatif d'une acquisition 30 secondes. B) Moyenne courbe d'autocorrélation obtenue à partir de 10 échantillons de 30 secondes d'acquisition équipé avec l'équation 1 (voir Figure 2). C) Résidus de l'ajustement de courbes.

Figure 4. HEK-293 cellules colorées avec la toxine cholérique Alexa488. Les cellules ont été imagées sur un microscope confocal SP5 (Leica Microsystems, Wetzlar, Allemagne) sur la ligne laser 488nm interne. Fluorescence ont été recueillies avec un objectif x60 apochromatique immersion plan de l'huile entre 500et 650 nm.

Figure 5. Evaluation du temps de diffusion de la toxine cholérique Alexa488 à la membrane plasmique des cellules HEK293. A) courbe moyenne autocorrélation équipé avec l'équation 2 (voir Figure 2). B) Les résidus de l'ajustement de courbes. (Modifié d'après MARQUER et al. ¹²⁾

La méthode présentée ici permet de FCS une analyse sensible et rapide de la répartition des lipides radeau de sondes fluorescentes d'intérêt dans les cellules vivantes. FCS combine la précision de la localisation de la microscopie confocale avec la sensibilité de comptage de photon unique. La principale différence entre FCS et standards techniques biochimiques, c'est que FCS permet la détermination absolue de lipides radeaux de la partition de la cible et non pas la partition relative comme c'est le cas pour l'isolement DRM ou co-patching.

Acquisition de données FCS prend environ 5 minutes (10 acquisitions de 30 secondes) pour chaque échantillon et est donc assez rapide par rapport à des techniques biochimiques habituelles. Cette rapidité permet de suivre en temps la perturbation dans le partitionnement radeau lipidique qui peut résulter de la toxicomanie. Cependant, l'analyse des courbes d'autocorrélation peut être un peu délicate car les différents modèles pour le montage doivent être parcouru pour déterminer laplus exacte. En outre, lors de l'acquisition photoblanchiment doit être évité car cela peut conduire à des artefacts.

Nous décrivons ici un exemple où l'on peut délimiter le radeau lipidique de partitionnement d'un lipide: ganglioside GM1 (Fig. 5). Une telle étude n'aurait pas été possible avec les procédures standard biochimiques qui ne peuvent être appliquées aux protéines. FCS est pas limité à des lipides cependant et peut également être utilisé pour des protéines, soit marqué avec un ligand fluorescent (par exemple la transferrine-Alexa555 se lie au récepteur de la transferrine, connu pour être située à l'extérieur de radeaux ⁹⁾ ou exprimé comme une fusion avec une protéine fluorescente (par exemple APP-YFP ou BACE1-GFP ^9, deux joueurs protéine clé dans la maladie d'Alzheimer). Il peut donc être utilisé pour un large éventail de cibles. En outre, FCS peut être mis en œuvre non seulement dans des lignées cellulaires, comme décrit ici, mais aussi dans des cultures primaires ^9.

En ce qui concerne la toxine cholérique, vous devriez garder à l'espritce qu 'il a tendance à GM1 agrégat dans pentamères, créant ainsi la membrane de micro-domaines pouvant être différente de radeaux lipidiques natifs. C'est pourquoi vous ne pouvez pas utiliser colocalisation avec la toxine cholérique pour déterminer si votre protéine d'intérêt est à l'intérieur ou à l'extérieur des radeaux. Néanmoins, les protéines membranaires tels que l'APP-YFP et BACE1-GFP, diffusent dans des radeaux lipidiques avec des temps de diffusion de 60-80 ms ^9, très semblables à ce qui a été observé avec la toxine cholérique (75 ms). Ainsi la toxine du choléra peuvent être utilisés pour calibrer votre set-up et vérifier que vous pouvez différencier les temps de diffusion rapide et lente.

FCS est également adapté pour de nombreuses autres applications telles que ^13,14 détermination de l'état d'oligomérisation d'un ¹⁵ ou un ligand / récepteur de protéine études pharmacologiques ^16. Il peut également être couplé à d'autres techniques de microscopie de fluorescence tels que la réflexion interne totale (TIRF) ^17,18 ou épuisement émission stimulée (STED) ^19.En effet, STED-FCS permet une détermination encore plus précise de radeau lipidique partitionnement ^19, mais jusqu'à présent, la microscopie STED est toujours coûteuse et n'est donc pas généralisée.

Les principales limites de FCS sont la nécessité pour les faibles concentrations de fluorophores (dans la gamme nanomolaire) et les heures de diffusion rapides de sorte que les fluorophores ne sera pas photoblanchiment avant de quitter le volume d'excitation. Des techniques complémentaires pour évaluer la diffusion des protéines comprennent FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) et ICS (spectroscopie de corrélation de l'image) techniques (revue dans ^20).

Dans FRAP, un faisceau laser de haute intensité est utilisée pour agent de photoblanchiment une région d'une cellule et la récupération de la fluorescence après photoblanchiment est ensuite surveillée. Cette récupération vient de la diffusion de fluorophores de non-blanchie zones de la région de blanchie. Ainsi, les temps de diffusion peuvent être extraites de la cinétique de récupération. FRAP peut être utilisé à des concentrations élevées ofluorophores f et peut accéder à large gamme de temps de diffusion, ce qui rend complémentaire de FCS. FRAP a été utilisée pour évaluer si un fluorophore était majoritairement à l'intérieur ou à l'extérieur des radeaux de ^21,22, mais il est encore une méthode plutôt en vrac afin de quantifier la proportion de l'intérieur fluorophores diffusant ou en dehors de radeaux dans la zone d'intérêt.

ICS est un analogue d'imagerie de FCS, dans lequel la corrélation spatiale est calculée pixel par pixel pour une image donnée ^23. Il a l'avantage de se prêter à l'étude de la diffusion lente des sondes fluorescentes, mais est limitée à l'analyse 2D. Cette limite a été vaincu par le développement de l'ICS appelé spatio-temporelle ICS (STICS) ^24. STICS permet de corrélation spatio-temporelle de sondes fluorescentes sur une pile d'images et est donc une technique puissante mais elle exige beaucoup de la mise en œuvre informatique et possède une résolution inférieure de temps que FCS. En fait, ICS et STICS sont limités à traiter e beaucoup plus lentune fois l'acquisition d'une trame d'image. Une autre extension de l'ICS appelé trame ICS (RICS) ^25,26 permet l'analyse des processus de diffusion rapide, en profitant des avantages du mode de balayage de trame disponible sur la plupart commerciales microscopes confocaux. La RICS est polyvalent car il peut être utilisé pour une large diffusion à grande (de ms à ms), mais sa mise en œuvre (les paramètres de numérisation, de traitement de données) peut être lourd. Nous n'avons pas trouvé de nombreux articles dans la littérature qui déclarent avoir utilisé des ICS et ses techniques dérivées pour étudier les radeaux lipidiques ^27-29.