Submit
Browse  

The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.

Recommend to Librarian

Automatic Translation

This translation into Turkish was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE General

Lipid Raft belirlenmesi Flüoresan Korelasyon Spektroskopisi (FCS) tarafından Yaşayan hücreler içinde floresan etiketli Soruşturmasının Bölümleme

1, 2,3, 1

1Centre de Recherche de l’Institut du Cerveau et de la Moelle Épinière, Hôpital de la Pitié-Salpêtrière, 2Institut des Sciences Moléculaires d'Orsay, Université Paris-Sud, 3Centre de Photonique Biomédicale du Centre Laser, Université Paris-Sud

You must be subscribed to JoVE to access this content.

This article is a part of   JoVE General. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.

Recommend JoVE to Your Librarian

Current Access Through Your IP Address

You do not have access to any JoVE content through your current IP address.

IP: 23.22.76.170, User IP: 23.22.76.170, User IP Hex: 387337386

Current Access Through Your Registered Email Address

You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please or create an account with your institutional email address to access this content.

 

Video Article Chapters

Cite this Article: Lipid Raft belirlenmesi Flüoresan Korelasyon Spektroskopisi (FCS) tarafından Yaşayan hücreler içinde floresan etiketli Soruşturmasının Bölümleme

Marquer, C., Lévêque-Fort, S., Potier, M. C. Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS). J. Vis. Exp. (62), e3513, doi:10.3791/3513 (2012).

Abstract: Lipid Raft belirlenmesi Flüoresan Korelasyon Spektroskopisi (FCS) tarafından Yaşayan hücreler içinde floresan etiketli Soruşturmasının Bölümleme

Son on beş yıl içinde hücre zarları homojen değildir ve işlevleri sarfetmek microdomains güveniyor görüşünü yaygın olarak kabul haline gelmiştir. Lipid sallar kolesterol ve spingolipitler zenginleştirilmiş membran microdomains vardır. Bunlar sinyalizasyon gibi hücresel fizyolojik süreçlerin bir rol oynar ve ticareti 1,2 değil, aynı zamanda viral veya bakteriyel enfeksiyonlar ve nörodejeneratif hastalıklar 3 dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarda önemli oyuncular olduğu düşünülmektedir.

Ancak varlıklarını hala tartışma 4,5 meselesidir. Gerçekten de, lipid sal boyutu böylece doğrudan görüntüleme engelleyen, çok konvansiyonel mikroskobu (200 nm dolaylarında) çözünürlük sınırının altında, yaklaşık 20 nm 6 olarak tahmin edilmiştir. Şimdiye kadar, lipid sallar içinde ilgi proteinlerin bölümü değerlendirmek için kullanılan ana teknikleri Deterjan Dayanıklı Membranlar (DRMS) antikorları ile izolasyon ve co-yama vardı. Rağmen yaygın olarak kullanılan becaonların yerine kolay uygulama kullanımı, bu tekniklerin eserler eğilimli oldukları ve böylece 7,8 eleştirdi. Teknik gelişmeler dolayısıyla bu eserlerin aşmak ve canlı hücrelerin lipid sallar bölüm soruşturma edebilmek için gerekli idi.

Burada yaşayan hücrelerin plazma membranında floresan etiketli protein veya lipitlerin lipid sallar bölümünün hassas analizi için bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, Flüoresan Korelasyon Spektroskopisi (FCS) olarak adlandırılan, lipid salların içinde veya dışında bulunan flüoresan prob difüzyon zamanlarda eşitsizliği dayanır. Aslında, yapay membranlar ve hücre kültürlerinde hem de kanıtlandığı, probları çok daha hızlı dışında yoğun lipid sallar 9,10 içinde daha dağılırdı. Difüzyon kez belirlemek için, dakikalık bir floresans dalgalanmaları (Şekil bir konfokal mikroskop ile hücre plazma membranında bulunan, bir odak hacmi (yaklaşık 1 femtoliter) zamanın bir fonksiyonu olarak ölçülmektedir1). Oto-korelasyon eğrileri sonra bu dalgalanmaların alınan ve uygun matematiksel difüzyon modelleri 11 ile takılabilir.

FCS bunlar floresan etiketlenmiş olduğu sürece, çeşitli prob bölümleme lipid sal belirlemek için kullanılabilir. Floresan etiketleme flüoresan füzyon proteinlerinin ifadesini ya da flüoresan ligand bağlanması ile elde edilebilir. Ayrıca, yakın zamanda 12 FCS olarak tanımlanan, suni membranları ve hücre çizgileri, ama aynı zamanda primer kültürler olarak değil yalnızca kullanılabilir. Ayrıca ilaç eklenmesi veya membran lipid kompozisyonunda değişim 12 sonrası lipid sal bölümleme dinamiklerini takip için kullanılabilir.

Protocol: Lipid Raft belirlenmesi Flüoresan Korelasyon Spektroskopisi (FCS) tarafından Yaşayan hücreler içinde floresan etiketli Soruşturmasının Bölümleme

1. FCS Kur Kalibrasyon

  1. Konfokal mikroskop, lazerler, bilgisayarlar, sıcaklık için kuvöz ve CO 2 kontrolü başlatın.
  2. SPAD (Single Photon Çığ Diyot) üzerindedir ve SPAD içinde floresan filtre iyi numunenin uygun olduğundan emin olun. SPAD zaman içinde senkronize olup olmadığını kontrol edin. Lütfen SPAD ayarları edinimi için hazır kez sadece FCS yazılımı başlatmak için dikkat edin.
  3. 1 ug / ml (17.5 nM) bir konsantrasyona ulaşmak için PBS ile seyreltilerek kolera toksini-Alexa488 taze bir çözeltisi hazırlayın.
  4. Mikroskop iç algılama kullanarak çözüm konfokal görüntüleme Optimize.
  5. Tarama modu gelin ve çözüm örnek bir nokta seçin geçin. Lazer aydınlatma süresi (> 5 dakika) sizin FCS alımları gerçekleştirmek için yeterince uzun olduğundan emin olun.
  6. SPAD dış algılama ve FCS yazılım geçin. Lütfen floresans sinyal izlemek ve iyi sui olduğundan emin olunSPAD için ted (yeterli sinyal ancak doygunluk, 10 50 000 sayımları 000 / s iyidir). Gerekirse, z konumunu, kazanç ve / veya doğru floresan sinyal elde etmek için lazer gücü değiştirin.
  7. 30 saniye ölçümleri 10 takım edinin. Zaman kazancı (en iyi örnekleme ve photobleaching sorunları arasında uzlaşma) için numune için optimize edilmelidir.
  8. Eğer çözüm difüzyon bir floresan türlerin karşılık gelen bir oto-korelasyon eğrisi (Şekil. 2 denklemi) sahip olmasını sağlamak ve montaj sonrası elde edilen difüzyon süresi (Şekil (yaklaşık 0,2 ms) doğru olduğunu verilerinizi (bkz: adım 4) analiz . 3).

2. Lipid Rafts Marker ile Yaşayan hücreler boyanması

  1. Poli-L-lisin (1mg/ml) yapışmasının doğru olduğundan emin olmak için görüntüleme önceki gün kaplı 8-iyi Labteks üzerine Plaka HEK293 hücreleri. Floresan sinyal hiçbir karışıklık yoktur sağlamak için fenol kırmızısı olmadan orta kullanın.
  2. HBSS (Hank Tamponlu Tuz Çözeltisi) ile iki kez hücre yıkayın.
  3. 37 de 30 dakika boyunca hücrelere 500 ul HBSS kolera toksini-Alexa488 (1 ug / ml) / BSA (% 0.1) ekleyin ° C. Kolera toksini tercihen lipid sallar bölümlenmiş olması bilinen gangliozid GM1, bağlanacaktır.
  4. HBSS (Hank Tamponlu Tuz Çözeltisi) ile iki kez hücre yıkayın.

3. Yaşayan hücreler üzerindeki FCS Veri Toplama

  1. Mikroskop sahnede boyanan hücrelerin yerleştirin. 2 durumları bu difüzyon zamanlarda eserlerin yol açabilir aksi takdirde uygun olduğundan emin Sıcaklık ve CO olun.
  2. Mikroskop iç algılama (Şekil 4) kullanarak bir ilgi hücrenin konfokal görüntüleme Optimize.
  3. Tarama modunu işaret ve faiz hücrenin plazma membranı bir nokta seçin geçin. Hücre edinimi sırasında hareket olmadığından emin olmak için hücrenin 1-2 canlı görüntüleri gerçekleştirin.
  4. SPAD dış algılama geçin ve FCS yumuşakware. Lütfen floresans sinyal izlemek ve iyi (yeterli sinyal ancak doygunluk, 10 000 50 000 sayım / s ince) SPAD uygun olduğundan emin olun. Gerekirse, z konumunu, kazanç ve / veya doğru floresan sinyal elde etmek için lazer gücü değiştirin. Bu yeterli değil ise, boyama, değişen koşullara düşünebilirsiniz.
  5. 30 saniye ölçümlerin 10 örnek edinin. En hücreleri otomatik floresan olduğundan, otomatik floresans solma nedeniyle, ilk satın almalar sırasında floresans bir düşüş görebilirsiniz.

4. FCS Veri Analizi

  1. Korelasyon aralığı ayarlayın ve FCS yazılımı ile oto-korelasyon eğrileri oluşturmak. Korelasyon aralığı genellikle kısa çözülebilir gecikme zaman kadar olası en uzun süre (ölçüm istatistikleri daha yetersiz maksimum korelasyon zaman toplam satın alma zamanı yaklaştığında olur, azami gecikme süresini% 80 ile sınırlıdır uzanacağım Picoqua üzerine alma süresint yazılım).
  2. Her numune için, zamanın bir fonksiyonu olarak floresans dalgalanmalar ve oto-korelasyon karşılık gelen dosyaları ihracat.
  3. Bir veri analizi ve bu dosyaları almak için Pro Origin gibi uydurma yazılımı kullanın.
  4. Her bir örnek için, floresans 30 saniye boyunca sabit kalır yani hiçbir photobleaching edinimi sırasında olduğundan emin olun. Bu yapay uzun difüzyon kez neden olabilir photobleaching gösteren herhangi bir önlem atın.
  5. Kalan FCS eğrilerinin şekli (Şekil 5) doğru olup olmadığını kontrol edin. Ortalama FCS eğrisi belirleyin.
  6. Uygun matematiksel model (Şekil 2) ile eğrisi uyar. Bu uygun bir difüzyon süresi (ler) ve bunun (ese) difüzyon süresi (lar) ile difüzyon moleküllerinin oranı verecektir.

5.. Temsilcisi Sonuçlar

Bir kolera toksini-Alexa488 solüsyonu ile bir FCS kalibrasyon bir örneği, Şekil 3 'de gösterilmiştir (Şekil 3A), bireysel göstermek ve FCS eğrileri gelmediğini kontrol ettikten sonra hesaplandı. Anlamına FCS eğrileri çeşitli difüzyon modelleri (Şekil 2'de örnekler) tekabül eden denklem ile donatılmış edildi. Klasik bir uyum kalitesini belirlemek için kabul parametre belirleme katsayısı R 2 dir. R 2 yakın daha iyi bir uyum, 1 etmektir. Bu durumda, ortalama FCS eğrisi uyacak şekilde en doğru modeli üç boyutlu (Şekil 2 ve Şekil 3B, denklem 1) serbestçe difüzyon flüoresan moleküller nüfusu tarif biridir. Uyum elde difüzyon süresi 0.32 ms. Eğri (Şekil 3C) ve R 2 faktörü (0,99906) gelen artıklar uyum kaliteli bir tahmin sağlar.

Kolera toksini-Alexa488 lekeli HEK2 için FCS analizi bir örneği93 hücreleri Şekil 5 de gösterilmiştir. Multifazik ortalama FCS eğrisi şekli farklı difüzyon kez floresan moleküllerin nüfusun varlığını ortaya koymaktadır. Bir engel difüzyon (membran düzlemde gibi, iki boyutlu difüzyon) ve üç boyutta serbestçe difüzyon biri (Şekil 2 ve Şekil 5 denklem 2) iki: Bu eğri için en uygun floresan probların üç nüfusa sahip bir model tekabül . Bu ikinci nüfusu salgılanması veya geri dönüşüm yol aracılığıyla membran ulaşan veya endositoz ile membran bırakarak, bunların membran hedefler için bağlayıcı ya da bağlantısını kesme düzlemi membranı, yani, hareket dışındaki moleküller flüoresan karşılık gelir. GM1 bağlı kolera toksini tekabül membran iki kez difüzyonu, lipid salların dışında difüzyon tekabül 2 MS (moleküllerinin% 25), ve lipid sallara difüzyon karşılık gelen 75 ms (moleküllerinin% 50), idi . Unutmayın ki herhangi bir photobleachedinimi sırasında ing yapay uzun difüzyon kez böylece muhtemelen lipid sal alanlarda GM1 lokalizasyonu konusunda bir önyargı oluşturmaya yol açacaktır.

Åžekil 1
Åžekil 1. FCS kurulumu (Marquer ark modifiye resim. 12) ÅŸematik

Åžekil 2
Şekil 2. Difüzyon modelleri ve otokorelasyon eğrileri sığdırmak için kullanılacak karşılık gelen denklem örneği. Yapısı parametresi S 1 / e 2 yoğunluğu ve W0 etkili la azından optik ekseni boyunca S = z z 0 / W 0 0 etkili odak uzunluğu gibi yazılabilir1 / e 2 yoğunlukta teral odak yarıçapı. Bu değerler, klasik bir nokta dağılım fonksiyonu (PSF) ölçümü elde edilebilir.

Åžekil 3
Şekil 3. FCS kalibrasyon için çözüm kolera toksin Alexa488 difüzyon zaman değerlendirilmesi. Bir 30 saniye kazanım bir temsili örneğin zamanın bir fonksiyonu olarak A) Floresans dalgalanması. B) denklemi 1 ile donatılmış 30 saniye edinimi 10 örnek (bkz. Şekil 2). C) eğri gelen artıklardan elde edilen otokorelasyon eğrisi ortalama.

Åžekil 4
Şekil 4. HEK-293 hücre kolera toksin Alexa488 ile boyandı. Hücreler iç 488nm lazer çizgisi ile bir SP5 konfokal mikroskop (Leica Microsystems, Wetzlar, Almanya) görüntülendi. Floresans 500 arasında bir x60 planı apochromat immersiyon yağı amacı ile toplanmışve 650 nm.

Åžekil 5,
Şekil 5. HEK293 hücrelerinin plazma membranında kolera toksini-Alexa488 yayılma süresi değerlendirmesi. A) (bkz. Şekil 2) denklemi 2 ile donatılmış otokorelasyon eğrisi ortalama. B eğri itibaren) artıklar. (Marquer ve ark modifiye. 12)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion: Lipid Raft belirlenmesi Flüoresan Korelasyon Spektroskopisi (FCS) tarafından Yaşayan hücreler içinde floresan etiketli Soruşturmasının Bölümleme

FCS yöntemi burada sunulan canlı hücrelerin ilgi floresan probların lipid sal bölümleme bir hassas ve hızlı analiz sağlar. FCS tek foton sayma duyarlılığı ile konfokal mikroskopi lokalizasyonu doğruluğunu birleştirir. FCS ve standart biyokimyasal teknikler arasındaki temel fark DRMS ​​izolasyon ya da eş-yama için olduğu gibi FCS hedef lipid sallar bölümü değil, göreceli bölüm mutlak belirlenmesi olanak tanımasıdır.

FCS veri kazanım her bir örnek için yaklaşık 5 dakika (30 saniye 10 satın) alır ve olağan biyokimyasal teknikler ile karşılaştırıldığında, böylece çok kısa olmasıdır. Bu, hızlılık bu sürede ilacın yanı sıra kaynaklanabilir lipid sal bölme içinde pertürbasyon takip yapar. Montaj için farklı modeller belirlemek yoluyla göz atmak zorunda Ancak, otokorelasyon eğrileri analizi biraz zor olabiliren kesin bir. Ayrıca, satın alma sırasında photobleaching Bu eserler neden olabileceğinden kaçınılmalıdır.

Gangliozid GM1 (Şekil 5): Burada biz bir lipid bölümleme lipid sal vurgulamaktadir örneği sunuldu. Böyle bir çalışma, yalnızca proteinlerin uygulanabilir standart biyokimyasal işlemleri ile mümkün olmazdı. FCS olsa lipidler ile sınırlı değildir, aynı zamanda protein için kullanılabilir, ya bir flüoresan ligandı (örn. transferin-Alexa555 sal 9 dışına yerleştirilmiş olduğu bilinen transferin reseptörü, bağlar) ya da bir floresan proteini içeren bir füzyon olarak ifade ile etiketlendi (örneğin, APP-YFP veya Bace1-GFP 9, Alzheimer hastalığında iki anahtar protein oyuncu). Böylece, hedeflerin geniş bir aralığı için kullanılabilir. Bundan başka, FCS primer kültürler 9 da burada açıklandığı gibi, hücre hatlarında sadece uygulanan, fakat edilebilir.

Kolera toksini ile ilgili olarak, aklınızda tutmalısınızki böylece membran yerli lipid sallar farklı olabilir mikro etki yaratarak, pentamers agrega GM1 eğilimi vardır. Eğer ilgi protein içinde ya da dışında sallar olup olmadığını belirlemek için kolera toksini ile colocalisation kullanamazsınız nedeni budur. Bununla birlikte, böyle APP-YFP ve Bace1-GFP olarak membran proteinleri, ne kolera toksin (75 ms) olduğu gözlenmiştir ms 9, çok benzer 60-80 difüzyon süreleri ile lipid sallar karışacaktır. Böylece kolera toksini için set-up kalibre ve hızlı ve yavaş difüzyon kat arasında ayrım olduğunu kontrol etmek için kullanılabilir.

FCS, aynı zamanda böyle bir proteinin 15 ya ligand / reseptör farmakolojik araştırmalar 16 oligomerizasyonu durumunun belirlenmesi gibi diğer birçok uygulama 13,14 için çok uygundur. Ayrıca bu tür Toplam İç Yansıma Floresans (TIRF) 17,18 veya uyarılmış emisyon tükenmesi (STED) 19 gibi diğer mikroskopi teknikleri akuple edilebilir.Nitekim, STED-FCS 19 bölümleme lipid sal bir daha da doğru belirlenmesi sağlayan ama bugüne kadar, STED mikroskopi hala pahalı ve bu nedenle yaygın değildir.

FCS ana sınırlar florofor düşük konsantrasyonlarda (nanomolar aralığındadır) ve hızlı bir difüzyon süreleri için ihtiyaç vardır, böylece florofor eksitasyon hacmi ayrılmadan önce photobleach olmaz. Proteinlerin difüzyon değerlendirmek için tamamlayıcı teknikler FRAP (Photobleaching sonra Floresan Kurtarma) ve ICS (Görüntü Difraksiyon) teknikleri (20 Yorumlar) içerir.

FRAP olarak, yüksek yoğunluklu lazer ışını photobleaching daha sonra takip edilmektedir sonra bir hücre ve floresans iyileşme bir bölgede photobleach için kullanılır. Bu kurtarma olmayan ağartılmış bölgelerden ağartılmış alana florofor difüzyon geliyor. Böylece difüzyon kez geri kazanım kinetikleri elde edilebilir. FRAP yüksek konsantrasyonlarda o ile kullanılabilmektedirf florofor ve böylece FCS için tamamlayıcı hale difüzyon kez geniş bir ürün yelpazesi erişebilirsiniz. FRAP bir fluorofor majoritarily içinde veya sallar 21,22 dışında olup olmadığını değerlendirmek için kullanılır ama yine de ilgi alanında florofor difüzyon içinde ya da dışında sallar oranını ölçmek için oldukça toplu yöntem değil.

ICS konumsal ilişki, belirli bir görüntünün 23 piksel için hesaplanan piksel edildiği FCS, bir görüntüleme analogudur. Bu yavaş difüzyon flüoresan prob çalışmaya yatkın olduğu bir avantaja sahiptir fakat 2B analizi ile sınırlıdır. Bu sınır, uzay-zamansal ICS (minde etkili nite) 24 adlandırılan ICS gelişimi ile aşıldı. Minde etkili nite görüntülerin bir yığın floresan probların uzay-zamansal korelasyon sağlar ve hesaplamalı uygulama bir sürü gerektirir ve FCS daha düşük bir zaman çözünürlüğe sahip olsa ve böylece güçlü bir tekniktir. Aslında, hem ICS ve minde etkili nite çok daha yavaş th işlemek için sınırlıdırbir resim çerçevesi bir kazanım zamanı. ICS bir uzantısı 25,26 çoğu ticari konfokal mikroskoplar mevcut raster tarama modu yararlanarak hızlı yayılma sürecinin analizi sağlar raster ICS (RICS) denir. Bu külfetli olabilir büyük bir difüzyon aralık (ms için μs gelen) fakat uygulamaları (parametreler, veri işleme tarama) için kullanılabilir olarak RICS yönlüdür. Biz lipid sallar 27-29 okumak için ICS ve bundan türetilen tekniklerinin kullanımı raporlama literatürde birçok bildiri bulamadık.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures: Lipid Raft belirlenmesi Flüoresan Korelasyon Spektroskopisi (FCS) tarafından Yaşayan hücreler içinde floresan etiketli Soruşturmasının Bölümleme

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgements: Lipid Raft belirlenmesi Flüoresan Korelasyon Spektroskopisi (FCS) tarafından Yaşayan hücreler içinde floresan etiketli Soruşturmasının Bölümleme

Bu çalışma, Agence Nationale de la Recherche (ChoAD) bir hibe ile desteklenmiştir. Biz de kendi mali destek için Fondation ICM (Institut du Cerveau et de la Moelle) minnettarız.

Materials: Lipid Raft belirlenmesi Flüoresan Korelasyon Spektroskopisi (FCS) tarafından Yaşayan hücreler içinde floresan etiketli Soruşturmasının Bölümleme

Name Company Catalog Number Comments
Cholera toxin subunit B-Alexa 488 Invitrogen C-34775 MW (pentamer) = 57 kg/mol
Confocal microscope Leica Microsystems SP5
Incubator for temperature and CO2 control Life imaging services The Cube and the Box
SPAD (Single Photon Avalanche Diode) MPD (Micro Photon Devices) PDM serie (100 µm sensitive area)
High pass 488 nm filter Semrock 488 nm blocking edge BrightLine long-pass filter Part # FF01-488/LP-25
FCS detection unit Picoquant Picoharp 300 module
Acquisition and auto-correlation software Picoquant SymPhoTime
Fitting software OriginLab OriginPro8

References: Lipid Raft belirlenmesi Flüoresan Korelasyon Spektroskopisi (FCS) tarafından Yaşayan hücreler içinde floresan etiketli Soruşturmasının Bölümleme

  1. Brown, D.A. & London, E. Functions of lipid rafts in biological membranes. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 14, 111-136 (1998).
  2. Simons, K. & Gerl, M.J. Revitalizing membrane rafts: new tools and insights. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 688-699 (2010).
  3. Simons, K. & Ehehalt, R. Cholesterol, lipid rafts, and disease. J. Clin. Invest. 110, 597-603 (2002).
  4. Munro, S. Lipid rafts: elusive or illusive? Cell. 115, 377-388 (2003).
  5. Shaw, A.S. Lipid rafts: now you see them, now you don't. Nat. Immunol. 7, 1139-1142 (2006).
  6. Pralle, A., Keller, P., Florin, E.L., Simons, K., & Horber, J.K. Sphingolipid-cholesterol rafts diffuse as small entities in the plasma membrane of mammalian cells. J. Cell Biol. 148, 997-1008 (2000).
  7. Brown, D.A. & London, E. Structure and function of sphingolipid- and cholesterol-rich membrane rafts. J. Biol Chem. 275, 17221-17224 (2000).
  8. Sharma, P., Sabharanjak, S., & Mayor, S. Endocytosis of lipid rafts: an identity crisis. Semin. Cell Dev. Biol. 13, 205-214 (2002).
  9. Kahya, N., Scherfeld, D., Bacia, K., Poolman, B., & Schwille, P. Probing lipid mobility of raft-exhibiting model membranes by fluorescence correlation spectroscopy. J. Biol. Chem. 278, 28109-28115 (2003).
  10. Bacia, K., Scherfeld, D., Kahya, N., & Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy relates rafts in model and native membranes. Biophys J. 87, 1034-1043 (2004).
  11. Kim, S.A., Heinze, K.G., & Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy in living cells. Nat. Methods. 4, 963-973 (2007).
  12. Marquer, C., et al. Local cholesterol increase triggers amyloid precursor protein-Bace1 clustering in lipid rafts and rapid endocytosis. FASEB J. 25, 1295-1305 (2011).
  13. Tian, Y., Martinez, M.M., & Pappas, D. Fluorescence correlation spectroscopy: a review of biochemical and microfluidic applications. Appl. Spectrosc. 65, 115A-124A (2011).
  14. Haustein, E. & Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy: novel variations of an established technique. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36, 151-169 (2007).
  15. Ilien, B., et al. Pirenzepine promotes the dimerization of muscarinic M1 receptors through a three-step binding process. J. Biol. Chem. 284, 19533-19543 (2009).
  16. Lieto, A.M., Cush, R.C., & Thompson, N.L. Ligand-receptor kinetics measured by total internal reflection with fluorescence correlation spectroscopy. Biophys. J. 85, 3294-3302 (2003).
  17. Thompson, N.L., Burghardt, T.P., & Axelrod, D. Measuring surface dynamics of biomolecules by total internal reflection fluorescence with photobleaching recovery or correlation spectroscopy. Biophys. J. 33, 435-454 (1981).
  18. Thompson, N.L. & Steele, B.L. Total internal reflection with fluorescence correlation spectroscopy. Nat. Protoc. 2, 878-890 (2007).
  19. Eggeling, C., et al. Direct observation of the nanoscale dynamics of membrane lipids in a living cell. Nature. 457, 1159-1162 (2009).
  20. Kolin, D.L. & Wiseman, P.W. Advances in image correlation spectroscopy: measuring number densities, aggregation states, and dynamics of fluorescently labeled macromolecules in cells. Cell Biochem. Biophys. 49, 141-164 (2007).
  21. Shvartsman, D.E., Kotler, M., Tall, R.D., Roth, M.G., & Henis, Y.I. Differently anchored influenza hemagglutinin mutants display distinct interaction dynamics with mutual rafts. J. Cell Biol. 163, 879-888 (2003).
  22. White, R., et al. Holin triggering in real time. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 798-803 (2011).
  23. Petersen, N.O., Hoddelius, P.L., Wiseman, P.W., Seger, O., & Magnusson, K.E. Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application. Biophys. J. 65, 1135-1146 (1993).
  24. Hebert, B., Costantino, S., & Wiseman, P.W. Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells. Biophys. J. 88, 3601-3614 (2005).
  25. Digman, M.A., et al. Measuring fast dynamics in solutions and cells with a laser scanning microscope. Biophys. J. 89, 1317-1327 (2005).
  26. Digman, M.A., et al. Fluctuation correlation spectroscopy with a laser-scanning microscope: exploiting the hidden time structure. Biophys. J. 88, L33-36 (2005).
  27. Nohe, A., Keating, E., Fivaz, M., van der Goot, F.G., & Petersen, N.O. Dynamics of GPI-anchored proteins on the surface of living cells. Nanomedicine. 2, 1-7 (2006).
  28. Semrau, S. & Schmidt, T. Particle image correlation spectroscopy (PICS): retrieving nanometer-scale correlations from high-density single-molecule position data. Biophys. J. 92, 613-621 (2007).
  29. Bates, I.R., et al. Membrane lateral diffusion and capture of CFTR within transient confinement zones. Biophys. J. 91, 1046-1058 (2006).

Ask the Author: Lipid Raft belirlenmesi Flüoresan Korelasyon Spektroskopisi (FCS) tarafından Yaşayan hücreler içinde floresan etiketli Soruşturmasının Bölümleme

1 Comment

First of all, thank you for this useful and interesting publication. I would like to know the following:

1) How many floating parameters are there in equation 2? Have you proved in some way that this equation is not over-parameterized?
2) Is there another determination of the lipid-raft partitioning of the probe that can be compared with the one you obtained by FCS?
3) How were you able to prove that two bi-dimensional populations are needed in order to fit the autocorrelation data? How different is the quality of the fit when you use an equation considering one tri-dimensional and one bi-dimensional population of fluorophores?

Thank you very much.

2

Reply

Posted by: Sergio L.April 5, 2013, 10:45 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Waiting
simple hit counter