Adenovirüs kaynaklı Sistemleri Yardımı ile verimli Rekombinant Parvovirus Üretim

Biyogüvenlik düzeyi 2 olan bir laboratuvar rekombinant parvoviruses (recPV) üretimi için gerekli olduğunu unutmayın.

Protokol, iki ana bölümden ayrılır. Birinci kısım (transfeksiyon ile recPV üretimi) protokolü ikinci bölümü (enfeksiyonu yoluyla recPVs üretiminde) inokulum olarak hizmet recPVs minimal miktarda üretmek için gereklidir. Bir kez recPVs küçük bir miktar protokolünün birinci bölümü atlanabilir, üretilen ve rekombinant parvovirüsü, sadece adenovirüs helper yoluyla parvovirüsü kapsid proteinler (bkz. aşağıda) için gen kodlaması sağlayan enfeksiyonu yoluyla amplifiye edilebilir.

1. Transfeksiyon üzerinden recPVs Üretimi

1.1 Viral DNA transfeksiyon

Bu ya da katyonik lipidler veya kalsiyum fosfat dayalı protokol, bu bölümde oluşturulan bir DNA transfeksiyon yöntemi kullanmak mümkündür. Biz genellikle Fugene H kullanırD Transfeksiyon Reaktif. Transfeksiyon etkinliğini kontrol etmek için bir plazmid ifade gelişmiş Yeşil floresan proteini (örneğin pEGFP-N1, Clontech) ile ilave plaka transfekte öneririz. Hücre nüfusunun en az% 50 EGFP-pozitif 24 saat sonra, transfeksiyon sonucunda meydana transfeksiyon verimli ve virüsünün üretimi için optimal olarak kabul edilir.

1. Transfeksiyon günde% 50 hücresel konfluent elde etmek için bir 10 cm plakası, içinde transfeksiyonuyla, tohum 2.000.000 HEK293T hücreleri daha önce 1 saat. % 10 fetal bovin serumu, 2 mM L-glutamin, 100 ml penisilin başına U ve 100 ug / ml streptomisin ilavesiyle Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 10 ml hücre büyümesi.
2. 1.5 ml tüp virüs verme karışımı (01:02:01 molar oranı) hazırlayın:
   1. RecPV vektörünün 3 ug ilgi transgen (EI hastayı-1-GFP ⁶⁾ barındıran.
   2. Vektör pCMV / VP ⁵ 6 mikrogram parvovirus kapsid gen birimi barındıran
   3. 8 mikrogram of adenovirüs kökenli yardımcı plazmid pXX6 ^7.
3. 850 ul (20 ul / ng nihai konsantrasyon) ile serum içermeyen aracı kadar olan plazmid karışımı ile seyreltilir.
4. 42.5 ul Fugene HD (: mikrogram DNA 2.5:1 oranı ul Fugene) ekleyin. Orta Fugene eklerken tüp tarafında dokunmayın.
5. 5-10 saniye yavaşça vorteksleyin.
6. 30 dakika oda sıcaklığında inkübe karışımı.
7. Transfeksiyon karışımı hücrelere damla-akıllıca ekleyin. Eşit boyunca karışımı dağıtmak için hafifçe sallayın plaka.

1.2 Virüs üretim

1. Hasat önce 72 saat boyunca% 92 nem,% 5 _CO2 ile 37 ° C'de inkübe plakası. Bu süre içinde soyu parvovirüsü parçacıklar parvovirüsü plazmit ile oluşturulmaktadır.

1.3 Virüs hasat

1. Bir doku kültürü davlumbaz, bir 15 içine plakadan süspansiyon, bunların orta içinde hücreleri sıyırmak ve transfer aspireml plastik tüp.
2. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 250 x g'de santrifüje tüpü.
3. Üstte kalan% 95 çıkarın.
4. Vorteks tüpü yavaşça geri kalan süpernatan (0.5 ml) içine pelletini için.
5. -80 Azından tüp dondurmak ° C. Bu aşamada, üretim durdurmak ya protokolü ile birlikte devam etmek mümkündür.
6. Süspansiyon eritmeyi ve oda sıcaklığında getirmek.
7. 37 sıcak su, sıvı azot banyo ve çözülme içinde süspansiyon Freeze ° C Vortex gayretle 15 saniye için ve donma-çözülme çevrimi fazla iki kez tekrarlayın tüpler.
8. 4 azından 15 dakika süreyle 16,000 x g'de santrifüje tüpler ° C.
9. Taze bir tüp içine süpernatant toplayın. Bu aşamada, tüp ham virüsü ekstresi preparatı içerir.
10. Virüs titrasyon (bkz. aşağıda) ile devam edin. GFP genini taşıyan recPV için tipik bir üretim yaklaşık 1 tekabül eden 1-3 x 10 ⁷ viral enfeksiyon birimleri vermelidir -3 x 10 ¹⁰ viral genom parçacıklar içeren.

1.4 Virüs depolama

1. Uzun süreli saklama için -80 az ham virüs özü içeren tüp dondurmak ° C Bu protokolün bir ikinci bölümünde aşı malzemesi olarak ham viral ekstreler kullanmak mümkündür.

2. Enfeksiyon ile recPVs Üretimi

Enfeksiyon yoluyla recPV üretim başlamadan önce, üretmek ve Adenovirüs standart protokol ^8'e göre parvovirus VP gen (Ad-VP yardımcısı, ⁵ açıklanan) taşıyan 5 arındırmak. Aynı zamanda ilgi transgen (örn., yukarıda açıklandığı gibi transfekte yoluyla üretilen) taşıyan recPVs minimal miktarda olması gereklidir.

Aşağıda, 175 cm ² şişe (T175) biçiminde recPV üretimini açıklar. Bu şekilde üretilen virüsü stokunun daha da çok katlı amplifikasyon 10 CellSTACK kültürü odalarına (Corning) içinde gerçekleştirilebilmektedirprotokolünün küçük ayarlamalar teklif ile.

2.1 Enfeksiyon

1. Enfeksiyon günde% 60-80 hücresel konfluense elde etmek için bir T175 şişesi enfeksiyon, plaka 10 milyon NB324K hücreleri 1 gün öncesine. Bir kontrol olarak hücreler aynı sayıda (non-enfekte olmuş hücreler) içeren ikinci bir şişe hazırlayın. Her T175% 5 fetal bovin serumu, 2 mM L-glutamin, ml başına Penisilin 100U ve 100 ug / ml streptomisin ile desteklenmiş bir son hacim olarak Minimum Essential Medium (MEM) 20 ml sahip olmalıdır.
2. Ertesi sabah oluşan bir 2 ml plastik tüp içinde virüsü karışımının hazırlanması:
   1. Enfeksiyon çokluğu (İçişleri Bakanlığı, enfeksiyöz birim / hücre) de Ad-VP-helper ⁵ = 10 (1 x 10 ⁸ enfeksiyöz birim karşılık gelen);
   2. MOI azından recPVs = 0.5 (5 x 10 ⁶ enfeksiyöz birim karşılık gelir). MEM ile 1.5 ml'ye tamamlayın.
3. T175 şişeye birinde tamamını virüsü karışımı geçerlidir.
4. Inkübe37 de 2 saat için şişeye ° C,% 92 _nem,% 5 CO2 yavaşça her 15 dakikada çalkalama.
5. 37 daha az 20-24 saat boyunca inkübe ° C,% 92 _nem,% 5 CO2.
6. Taze ortam ile kültürel ortamı değiştirin.

2.2 Virüs üretim

48 saat süreyle% 92 nem,% 5 _CO2 ile 37 ° C'de inkübe şişeler. Etkin viral üretim göstergesi olarak, sitotoksisite açık işaretleri 36-48 saat sonrası enfeksiyon başlamadan, viral enfekte hücre içeren şişeyi dikkat edilmelidir.

2.3 Virüs hasat

1. Bir doku kültürü olarak davlumbaz, aspire ve bir 50 ml'lik bir santrifüj tüpüne şişesi orta süpernatan transfer.
2. 1.5 ml PBS ile iki kez yıkanır hücreleri.
3. % 0.25 Trysin-EDTA 1.5 ml hücreleri Trypsinize. Çıkarıldı ve orta hücre süspansiyonu ilave edin.
4. Oda sıcaklığında, 5 dakika boyunca 5000 x g'de hücreleri ve süpernatan santrifüjebelgelendiğinden.
5. Süpernatant atın.
6. Hücre topağı ve yavaşça vorteks hücreleri yeniden süspanse etmek tüpüne TE tampon 1 ml (1 mM Tris-HCI, 0.1 mM EDTA, pH 8.7) ilave edilir.
7. 37 sıcak su içinde bir sıvı azot içinde çözülme banyo ve hücre süspansiyonu dondurmak ° C. 15 sn için tüp şiddetle Vortex ve donma-çözülme döngüsü üç kez tekrarlayın.
8. Hücre genomik ve non-paketlenmiş viral DNA'lar sindirimi için, 37, 30 dakika için 50 U / ml Benzonase Nükleaz ° C ile hücre süspansiyonu Treat.
9. 4 de 20 dakika boyunca 5000 x g'de santrifüje tüp ° C.
10. Taze bir tüp içine süpernatant toplayın. Bu aşamada, süpernatan ham virüsü ekstresi preparatı içerir. RecPV-GFP tipik verimleri Bu protokol 1-10 x 10 ⁸ viral enfeksiyon birimlerinin aralığında olmalıdır takiben üretilir.

2.4 Virüs depolama

1. 4 ° C'de kısa süreli depolama için (en fazla 2 ay), mağaza virüs
2. Lon için-80 at g süreli saklama (daha uzun süre 2 ay), mağaza virüs ° C

3. RecPV Arıtma

1. Ham lizatları gelen recPVs saflaştırılması için, Zolotukhin ark göre bir iodixanol süreksiz degrade çalıştırmak için önerilir. ^9. Bu etkin virüsü saflaştırılması için ham özütü viral (beş T175 şişeler üretim elde) 5 ml en az kullanılarak önermektedir.

4. Rekombinant Parvovirus Titrasyon

1. El-Andaloussi ark açıklandığı gibi recPV titrasyonu gerçekleştirmek. ⁵

5.. Kalite Denetimleri

1. NB324K göstergesi hücrelerinde parvovirüsü plak assay yürüten istenmeyen virüslerin kopyelemeye yetkin (RCV) varlığında kontrol etmek için El-Andaloussi ve ark. ⁵ anlatılan protokolde kullanabilir.

6. Temsilcisi Sonuçlar

RecPVs productio bir örneğin adenovirüs genomik elemanlarının varlığında veya yokluğunda, transfeksiyon yoluyla Şekil 3 'de gösterilmiştir. Hücreler hastayı-1-GFP (a recPV GFP geni barındıran) veya hastayı-1-lusiferaz (a recPV ateşböceği lusiferaz geni barındıran) ile birlikte pCMV / VP (VP parvovirüsü kapsid proteinleri için kodlayan gen taşıyan plazmid) ile transfekte edildi ile (+ pXX6) veya olmayan (-pXX6) pXX6 plazmid (adenovirüs taşıyan E2A, E4 (orf6) ve VA RNA genleri). Ham hücre ekstreleri arasında eşit hacimde El-Andaloussi ark bildirildiği gibi hücreler ve GFP transdüksiyon ya lusiferaz deneyleri yapıldı. ⁵ NB324K uygulanmıştır. RecPVs üretiminde belirgin bir artış bizim yöntemi (Şekil 3A, B) takiben elde edilen yaklaşık 5 TU / hücre geleneksel protokollere göre üretim 0,3 GFP transductional birimleri (DS) / hücreden artan pXX6 varlığında elde elde edildi. RecPV verimlilik önemli bir artış (24-kat yaklaşık)ayrıca hastayı-1-lusiferaz (Şekil 3C) söz konusu gözlenmiştir. Bu sonuçlar pXX6 içerdiği genetik malzeme parvovirüsü üretimi artırmak için mümkün olduğunu göstermiştir.

Enfeksiyonu yoluyla recPVs üretim temsili bir örnek, Şekil 4 'de gösterilmiştir. NB324K hücreleri çeşitli recPVs (şekilde gösterildiği) ve Ad-VP-helper (PV VP kapsid proteinleri kodlayan gen barındıran) ile ko-enfekte edildi. Kadar Ad-VP yardımcısı daha gelişmiş recPV üretime> istenmeyen çoğaltma yetkili viral parçacıkların (Şekil 4B) oluşumunu artırmadan numaralı seribaşı hücre başına 70 TU (Şekil 4A).

Şekil 1.. Vektörler özerk parvoviruses dayanmaktadır. (A) Üst: transgen VP-kodlayan genlerin kısmını değiştirir ve viral promotor P38 kontrolü altındadır. NS1 / 2 için genlerin rebakımlı ve bunların ifade viral promotör P4 tarafından kontrol edilir. Vektör genom kopyelenmesi ve rekombinant genomunun ambalajları için gerekli olan cis-etkili elementleri içeren parvoviral ITRs tarafından taarruz altında kalır. Altta: bir plazmid, (örneğin, CMV.) Ya da heterolog bir veya otolog (örn. P38.) Promoter (Px) altında VP-genini taşıyan yapısal genlerin bozulması telafi etmek için rekombinant parvovirüsü üretimi sırasında trans temin edilir Rekombinant genomunda. ITR, ters terminali tekrarlayın. Şekil ⁴ uyarlanmıştır. RecPVs üretimi için kullanılan klasik protokolü (B) şematik görünüm. HEK293T hücreleri geçici olarak viral DNA (vektör ve yardımcı plazmid) ve üç gün sonra transfekte edilir, hücreleri toplanır ve virüsleri hasat edilir.

Şekil 2. Ile recPVs üretimiAd-VP yardımcı olur. RecPV ve Ad-VP genomların (A) şematik haritalar. RecPV VP bölgenin parçası yerine bir heterolog transgen içerir. Ad-VP parvovirus VP geni barındırır. Bu makalede açıklanan protokol (B) şematik görünümü. NB324K hücreleri recPV ve Ad-VP virüsleri ile birlikte enfekte olmaktadır. Üç gün hücreler hasat edilmiş ve recPV partikülleri hücre lizatı elde edilirler sonra.

Şekil 3. Adenovirüs tabanlı plazmidler pXX6 tarafından recPV üretiminin uyarılması. 10 cm tabaklar tohumlanmış HEK293T hücreleri, recPVs üretmek için hastayı-1-GFP (A ve B) veya hastayı-1-lusiferaz (C) ile kombinasyon halinde pCMV / VP ile transfekte edildi. Eş zamanlı olarak, hücreler adenovirüs-türetilmiş plazmidler helper pXX6 ya da olmasın, olarak belirtilen ile birlikte transfekte edildi. Üç gün sonrası transfeksiyon, hücreler üç donma ve çözülme döngüleri ile hasat ve parçalanır edildi. Rezil eşit hacimleriE virüsü özleri göstergesi hücreleri NBK uygulandı ve iletimi deneyleri yapılmıştır. (A) konfluent NB324K monotabaka içinde GFP pozitif hücreler gösteren Temsilcisi mikrografları. (B) GFP transdüksiyon tahlillerin Kantitasyonu numaralı seribaşı hücre başına transdüksiyon birimi (TU) olarak ifade . (C) lusiferaz aktivitesi Kantitasyonu nispi lusiferaz birimi (RLU) olarak ifade edilir. El-Andaloussi ark açıklandığı gibi lusiferaz yapıldı. ^5. Sütunlar üç ortalama değerler standart sapma çubuklarla çoğaltır temsil eder. + PXX6 sütun üzerine numarası, (B ve C), karşılık vermeden pXX6 varlığında elde recPV virüs titreleri in kat artış gösterir.

Şekil 4. Reklam rekombinant-VP yardımcı virüsü ile recPV üretimi uyarılması. (A) NB324K hücreleri, enfeksiyon olduğunudaha sonra İçişleri Bakanlığı 10 az saflaştırılmış Ad-VP yardımcı virüsü (Ad-X birim / hücre, Adeno-X Hızlı titresi Takımı ile titre) ile Ted ve aşağıdaki rekombinant parvovirus Chi-HH-1-EGFP ¹¹ (0.1 biriyle süperenfekte TU / hücre) ya da H-1-GFP (0,5 TU / hücre) ^5. Bir gün sonrası enfeksiyon, orta değiştirildi ve iki gün sonra, hücreler toplandı ve üç dondurma-ve-çözülme döngüleri ile parçalanır. Ham hücre ekstreleri El-Andaloussi ark göre transdüksiyon deneyi tarafından virüs titreleri belirlemek için kullanılmıştır. ^5. TU, iletim birimi. (B) Ad-VP yokluğu varlığında üretilen Viral toplu NB324K göstergesi hücreleri üzerinde plak testi ile çoğaltma yetkili viral parçacıkların (RCV) kendi içeriği için analiz edildi.

Biz recPV üretim adenoviral genomik elementin varlığını tarafından geliştirilmiş olabilir göstermiştir. Biz transfeksiyon ile adenovirüs genomik elemanı sağlayarak ve recPV ile kombinasyon halinde Reklam-VP-yardımcı ile 100 kat daha fazla eş-hücreleri tarafından enfekte 10'dan fazla kat (0,3-5 TU / hücreden) tarafından recPV verimleri artmıştır geleneksel protokollere karşılaştırılması. Protokol daha adenovirüs genomik elemanlarının teslimat ve enfeksiyonu için kullanılmak üzere Reklam-VP helper optimum konsantrasyonu için en uygun zamanlama belirlenerek optimize edilebilir burada açıklanan.

Büyük transgenlerin (1.600 'den fazla bazlar) RecPVs az verimli üretilmektedir. Bu durum muhtemelen transgen sokarak, PV uygun viral DNA ambalajları için gerekli olan cis-etkili elemanları kaldırılır olgusuna bağlıdır. Üretimini etkilemeden PV genomunun içine sokulabilmektedir transgen optimal büyüklüğü 700 taban kadardırs ^6. Ayrıca eklenmiş transgen sıralama recPV üretimi (örn.. Sitotoksik proteinleri şifreleyen genlerin yerleştirilmesi düşük verimler recPV neden olabilir) etkileyebilir.

RecPVs üretimi sırasında dikkate alınması gereken diğer bir önemli yönü kendiliğinden rekombinant parvovirüsü ve VP-içeren plazmit ile homolog rekombinasyon yoluyla oluşturulabilir virüslerin kopyelemeye yetkin oluşacağına (RCV) 'dir. Mevcut protokol rekombinasyon riski geliştirmek değildir. Bununla birlikte, bir RCV kalite kontrol rutin bir viral stokları, sadece RCVs ihmal edilebilir bir miktarını ihtiva sağlamak üzere üretim ucunda (örn.. Plak assay NB324K göstergesi hücrelerinde ⁵⁾ yapılmalıdır.

(Ve transfekte etmek zor olan hücre hatlarının kullanımı mümkün kılmaktadır olarak tanımlanan protokol, kullanılan ambalaj hücre hattı seçiminde önceki sınırlamalar üstesindenBu nedenle transfeksiyon dayalı protokolleri ile uygun) değil PV'lerin iyi üreticileridir. örneğin. Elimizde HEK293T (veriler gösterilmemiştir) daha recPVs üretiminde daha verimli olduğunu NB324K hücreleri ^10. Farklı hücre hatlarının bir tarama yeni protokol uygulayarak artık mümkün ve recPV üretim için daha verimli hücreleri belirlemek olabilir. Bu da rekombinant parvovirüs gibi büyük ölçekli üretimi için sistemin daha da keşif için önünü açıyor. süspansiyon hücreleri ile biyoreaktörler.