Effektiv Rekombinant Parvovirus produktion med hjälp av adenovirus-härledda Systems

Notera att ett laboratorium med en skyddsnivå 2 erfordras för produktion av rekombinanta parvovirus (recPV).

Protokollet är uppdelad i två huvuddelar. Den första delen (framställning av recPV via transfektion) krävs för att producera den minimala mängden av recPVs som fungerar som inokulum i den andra delen av det protokoll (framställning av recPVs via infektion). När en liten mängd av recPVs produceras, den första delen av det protokoll som kan utelämnas, och den rekombinanta parvovirus kan amplifieras bara via infektion tillhandahålla den gen som kodar för parvoviruskapsiden proteiner genom adenovirus hjälpar (se nedan).

1. Produktionen av recPVs via transfektion

1,1 Viral DNA transfektion

Det är möjligt att använda någon etablerad metod DNA transfektion i detta avsnitt av protokollet baseras antingen på katjoniska lipider eller kalciumfosfat. Vi använder vanligtvis Fugene HD Transfection Reagent. För att kontrollera transfektionseffektiviteten, rekommenderar vi att transfekterande ytterligare plåt med en plasmid som uttrycker ökad grönt fluorescerande protein (t.ex. pEGFP-N1, Clontech). Transfektion anses effektivt och optimalt för virusproduktion när åtminstone 50% av cellpopulationen resulterar EGFP-positiva 24 timmar efter transfektion.

1. 1 dag före transfektion, frön 2 miljoner HEK293T-celler i en 10 cm platta, för att erhålla 50% cellulär konfluens vid dagen för transfektion. Odla celler i 10 ml Dulbeccos modifierade Eagle-medium (DMEM) med tillsats av 10% fetalt bovint serum, 2 mM L-glutamin, 100 U per ml penicillin och 100 pg / ml streptomycin.
2. Förbered virus-making blandning (1:2:1 molförhållande) i ett 1,5 ml rör:
   1. 3 pg av recPV vektor som härbärgerar den transgenen av intresse (EI PhH-1-GFP ^6).
   2. 6 pg av pCMV / VP ⁵ hyser parvovirus enheten kapsidgenen
   3. 8 ng of adenovirus-härledda hjälpar-plasmiden pXX6 ^7.
3. Späd den plasmider blandning med serumfritt medium upp till 850 | il (slutlig koncentration av 20 ng / | il).
4. Lägg 42,5 ul Fugene HD (2,5:1 förhållandet ul Fugene: ig DNA). Rör inte sidan av röret när du lägger Fugene till mediet.
5. Vortex försiktigt i 5-10 sekunder.
6. Inkubera blandningen vid rumstemperatur under 30 minuter.
7. Lägg till transfektions blandningarna droppvis till cellerna. Skaka plattan försiktigt för att jämnt fördela blandningen hela tiden.

1,2 Virusproduktion

1. Inkubera plattan vid 37 ° C med 92% fuktighet och _5% CO2 under 72 timmar före skörd. Under denna period avkomma parvoviruspartiklarna bildas från de parvovirus-plasmider.

1,3 Virus skörden

1. I en vävnadsodling huv, skrapa cellerna på deras medium aspirera och överföra suspensionen från plattan till en 15ml plaströr.
2. Centrifugera röret vid 250 xg under 5 minuter vid rumstemperatur.
3. Avlägsna 95% av supernatanten.
4. Virvel röret försiktigt för att resuspendera pelleten i den återstående supernatanten (ca 0,5 ml).
5. Frysa röret vid -80 ° C. Det är möjligt att stoppa produktionen vid detta stadium eller fortsätta med protokollet.
6. Frosta av suspensionen och föra den i rumstemperatur.
7. Frysa suspension i en flytande kväve-bad och upptining i varmt vatten vid 37 ° C. Vortex rören kraftigt under 15 sekunder och upprepa frys-tö-cykler ytterligare två gånger.
8. Centrifugera rören vid 16.000 xg under 15 min vid 4 ° C.
9. Samla upp supernatanten till ett nytt rör. Röret vid detta stadium innehåller rå beredning viruset extrakt.
10. Vidare med virustitrering (se nedan). För recPV bär GFP-genen, bör en typisk framställning ge 1-3 x 10 ⁷ virala infektiösa enheter som motsvarar ca 1 -3 x ¹⁰ 10 virala genomet innehåller partiklar.

1,4 Virus lagring

1. För långtidsförvaring frysa röret med det råa viruset extraktet vid -80 ° C. Det är möjligt att använda råa virala extrakt som inokulat i den andra delen av protokollet.

2. Produktionen av recPVs via Infektion

Innan du börjar med recPV produktion via infektion, producera och rena Adenovirus 5 bär parvovirus VP-genen (Ad-VP hjälpare, som beskrivs i ⁵⁾ enligt standard protokoll ^8. Det är också nödvändigt att ha en minimal mängd av recPVs bär transgenen av intresse (t.ex., framställt genom transfektion, såsom beskrivits ovan).

Nedan beskriver vi recPV produktionen i 175 cm ² kolv (T175) format. Ytterligare amplifiering av virusförrådet produceras på detta sätt kan utföras i 10 flerskiktade kamrarna CellSTACK kultur (Corning)med mindre justeringar av protokollet föreslås.

2,1 Infektion

1. 1 dag före infektion, plåt 10 miljoner NB324K celler i en T175 kolv för att få 60-80% cellulär sammanflytning på dagen för infektion. Framställa en andra kolv innehållande samma antal celler som en kontroll (icke-infekterade celler). Varje T175 bör ha 20 ml minimalt essentiellt medium (MEM) som en slutlig volym, kompletterat med 5% fetalt bovint serum, 2 mM L-glutamin, 100 E per ml penicillin och 100 pg / ml streptomycin.
2. Nästa morgon framställa virus blandningen i en 2 ml plaströr som består av:
   1. Ad-VP-hjälpar ⁵ vid multiplicitet av infektion (MOI, infektiösa enheter / cell) = 10 (motsvarande 1 x 10 ⁸ infektiösa enheter);
   2. recPVs vid MOI = 0,5 (motsvarande 5 x 10 ⁶ infektiösa enheter). Fyll till 1,5 ml med MEM.
3. Applicera hela viruset blandningen i en av T175-kolv.
4. Inkuberakolv under 2 h vid 37 ° C, 92% fuktighet, _5% CO2 under försiktig skakning var 15 min.
5. Inkubera under ytterligare 20-24 h vid 37 ° C, 92% fuktighet, _5% CO2.
6. Byt kulturellt medium med färskt medium.

2,2 Virusproduktion

Inkubera kolvar vid 37 ° C med 92% fuktighet och _5% CO2 under 48 timmar. Som en indikation på effektiv viral produktion bör tydliga tecken på cytotoxicitet observeras i kolven innehållande virusinfekterade celler, med början 36-48 timmar efter infektion.

2,3 Virus skörden

1. I en vävnadsodling huv, aspirera och överföra det medium supernatanten från kolven till en 50 ml centrifugrör.
2. Tvätta cellerna två gånger med 1,5 ml PBS.
3. Trypsinisera celler med 1,5 ml av 0,25% Trysin-EDTA. Tillsätt cellsuspensionen till avlägsnades mediet.
4. Centrifugera cellerna och supernatanten vid 5000 x g under 5 min vid rumstemperaturenperatur.
5. Kasta bort supernatanten.
6. Tillsätt 1 ml TE-buffert (1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,7) till cellpelleten och försiktigt skaka röret för att återsuspendera cellerna.
7. Frysa cellsuspensionen i ett bad med flytande kväve och tining i varmt vatten vid 37 ° C. Vortex röret kraftigt i 15 sekunder och upprepa frys-tö-cykeln tre gånger.
8. Behandla cellsuspensionen med 50 U / ml Benzonase Nukleas under 30 min vid 37 ° C för att smälta den cell genomiska och oförpackade virala DNA.
9. Centrifugera röret vid 5000 xg under 20 min vid 4 ° C.
10. Samla upp supernatanten till ett nytt rör. Supernatanten i detta skede innehåller råpreparat viruset extrakt. Typiska utbyten av recPV-GFP produceras efter detta protokoll bör vara i intervallet 1-10 x 10 ⁸ virala infektiösa enheter.

2,4 Virus lagring

1. För kortvarig lagring (max 2 månader), lagra virus vid 4 ° C.
2. För long tids förvaring (längre än 2 månader), lagra virus vid -80 ° C.

3. RecPV Rening

1. För rening av recPVs från rålysat, rekommenderar vi att köra en Jodixanol diskontinuerlig gradient enligt Zolotukhin et al. ^9. Vi rekommenderar att du använder minst 5 ml rå viral extrakt (från produktion i fem T175 kolvar) för effektiv virus rening.

4. Rekombinant parvovirus Titrering

1. Utför recPV titrering som beskrivs i El-Andaloussi et al. ⁵

5. Kvalitetskontroller

1. Använd protokollet som beskrivs i El-Andaloussi et al. ⁵ för att kontrollera förekomsten av oönskade replikationskompetenta virus (ONU) utför parvovirus plackanalys i NB324K indikator celler.

6. Representativa resultat

Ett exempel på recPVs production via transfektion i närvaro eller frånvaro av elementen adenovirus genomiska visas i figur 3. Celler transfekterades med pCMV / VP (plasmid som bär genen som kodar för de VP parvovirus kapsidproteinerna) tillsammans med PhH-1-GFP (en recPV härbärgerande GFP-genen) eller PhH-1-luciferas (en recPV härbärgerande eldflugeluciferasgenen) , med (+ pXX6) eller utan (-pXX6) i pXX6 plasmiden (som bär det adenovirus-E2a-och E4 (ORF6) och VA-RNA-gener). Lika stor volym av råa cellextrakten appliceras NB324K celler och GFP-transduktions-eller luciferas-assays utfördes såsom rapporterats i El-Andaloussi et al. ^5. En tydlig ökning i recPVs produktionen erhölls i närvaro av pXX6 med produktion ökade från 0,3 GFP transduktionskorsningar enheter (TU) / cell som erhållits enligt konventionella protokoll till cirka 5 TU / cell erhålls efter vår metod (Fig. 3A, B). En signifikant ökning (ca 24-faldig) av recPV productipå observerades också i fallet med PhH-1-luciferas (fig. 3C). Dessa resultat indikerar att det genetiska materialet som finns i pXX6 kan öka parvovirus produktion.

Ett representativt exempel på recPVs produktion via infektion visas i Figur 4. NB324K celler samtidigt infekterade med olika recPVs (såsom anges i figuren) och Ad-VP-hjälparceller (hysa genen som kodar för PV VP kapsidproteinerna). Ad-VP hjälpar förbättras ytterligare recPV produktion upp till> 70 TU per ympad cell (fig. 4A) utan att öka förekomsten av oönskade replikationskompetenta virala partiklar (Fig. 4B).

Figur 1. Vektorer baserade på autonoma parvovirus. (A) Överst: Transgenen ersätter en del av de VP-kodande gener, och är under kontroll av den virala promotorn P38. Generna för NS1 / 2 ärhålls och deras expression styrs av den virala promotorn P4. Vektorgenomet flankeras av Parvoviral ITR, vilka innehåller cis-verkande element som krävs för replikation och packning av den rekombinanta genomen. Nederst: En plasmid bär VP-genen under antingen en heterolog (t.ex. CMV.) Eller autologa (t.ex. P38). Promotor (Px), levereras i trans under rekombinant parvovirus produktion för att kompensera för störningar i de strukturella generna i det rekombinanta genomet. ITR, inverterad terminal upprepning. Figur anpassad från ^4. (B) Schematisk vy av den klassiska protokoll som används för framställning av recPVs. HEK293T-celler transient transfekteras med viralt DNA (vektor och hjälpar-plasmider) och efter tre dagar, uppsamlas cellerna och virus skördades.

Figur 2. Produktion av recPVs medhjälp av Ad-VP. (A) Schematiska kartor över recPV och Ad-VP-genom. Den recPV innehåller en heterolog transgen som ersätter en del av VP-regionen. Ad-VP härbärgerar parvovirus VP-genen. (B) Schematisk bild av protokollet som beskrivs i detta manuskript. NB324K celler samtidigt är infekterade med recPV och Ad-VP virus. Efter tre dagar celler skördas och recPV partiklar återhämtat sig från cellysat.

Figur 3. Stimulering av recPV produktion av adenovirus-baserade plasmider pXX6. HEK293T-celler, sådda i 10 cm skålar, transfekterades med pCMV / VP i kombination med PhH-1-GFP (A och B) eller PhH-1-luciferas (C) för att producera recPVs. Samtidigt, cellerna samtransfekterades med de adenovirus-härledda plasmider hjälparceller pXX6 eller inte, såsom anges. Tre dagar efter transfektion, skördades cellerna och lyserades genom tre frysnings-och tiningscykler. Lika stora volymer av crudE-virus extrakten applicerades på NBK indikatorceller, och transduktion analyser utfördes. (A) Representativa mikrofotografier som visar GFP-positiva celler inom konfluenta monoskikt NB324K. (B) Kvantifiering av GFP transduktions-analyser uttryckt i transduktion (TU) per ympad cell . (C) Kvantifiering av luciferasaktiviteten uttrycks som relativa luciferas (RLU). Luciferas-analysen utfördes såsom beskrivits i El-Andaloussi et al. ^5. Kolumnerna representerar medelvärden från tre replikat med standardavvikelsen bar. Antal ovanpå + pXX6 kolonn, i (B och C), ger faldig ökning i de recPV virustitrar, erhållits i närvaro av pXX6 kontra utan.

Figur 4. Stimulering av recPV produktion genom rekombinant Ad-VP hjälparvirus. (A) NB324K celler, var infektionerTed med renat Ad-VP hjälpvirus med MOI av 10 (Ad-X enheter / cell, titreras med Adeno-X Rapid titer Kit) och sedan superinfekterad med något av följande rekombinanta parvovirus Chi-hH-1-EGFP ¹¹ (0,1 tu / cell) eller H-1-GFP (0,5 tu / cell) ^5. En dag efter infektion, var mediet och två dagar senare uppsamlades celler och lyserades genom tre frysnings-och-upptiningscykler. Orena cellextrakt användes för att bestämma virustitrar genom transduktion analys enligt El-Andaloussi et al. ^5. TU, transduktion enhet. (B) Virala satser framställda i närvaro eller frånvaro av Ad-VP analyserades med avseende på deras innehåll av replikationskompetenta viruspartiklar (ONU) genom plackanalys på NB324K indikatorceller.

Vi har visat att recPV produktion kan förbättras genom närvaron av adenovirala genomiska element. Vi har ökat recPV avkastning med mer än 10 gånger (från 0,3 till 5 TU / cell) genom att tillhandahålla elementet adenovirus genomisk via transfektion och mer än 100 gånger co-infektera cellerna med Ad-VP-helper i kombination med recPV i jämförelse med konventionella protokoll. Protokollet som beskrivs här kan optimeras ytterligare genom att bestämma den lämpligaste tidpunkten för leverans av elementen adenovirus genomiska och den optimala koncentrationen av Ad-VP helper som ska användas för infektionen.

RecPVs med större transgener (mer än 1600 baser) är mindre effektivt produceras. Detta beror troligen på det faktum att genom insättning av transgenen, är cis-verkande element som är nödvändiga för PV korrekt viralt DNA förpackning avlägsnats. Den optimala storleken av transgenen som kan sättas in i PV-genomet utan att påverka dess produktion är upp till 700 bass ^6. Också den typ av införd transgen kan påverka recPV produktion (t.ex.. Insättning av gener som kodar för cytotoxiska proteiner kan resultera i lägre utbyten recPV).

En annan viktig aspekt för att ta i beaktande under recPVs produktion är möjlig förekomst av replikationskompetenta virus (ONU) som spontant kan formas genom homolog rekombination mellan rekombinant parvovirus och VP-innehållande plasmider. Det nuvarande protokollet inte ökar inte rekombination risken. Trots en RCV kvalitetskontroll bör rutinmässigt (t. ex. Plackanalys i NB324K indikator celler ⁵⁾ i slutet av produktionen för att säkerställa att virala lager innehåller endast en försumbar mängd ONU.

Det protokoll som beskrivits övervinner tidigare begränsningar i valet av den förpackning som används cellinjen, eftersom detta gör det möjligt att använda cell-linjer som är svåra att transfektera (ochdärför inte lämplig med protokoll baserade på transfektion) men är goda tillverkare av PV. ex. NB324K celler ¹⁰ som i våra händer mer effektiva på att producera recPVs än HEK293T (data visas ej). En screening av olika cellinjer är nu möjligt att tillämpa det nya protokollet och kunde identifiera mer effektiva celler för recPV produktion. Detta banar också väg för att ytterligare utforskning av systemet för storskalig produktion av rekombinant parvovirus t. ex. i bioreaktorer med celler i suspension.