Efficiënte Recombinant Parvovirus productie met de hulp van Adenovirus-afgeleide systemen

Merk op dat een laboratorium met een bioveiligheidsniveau 2 is vereist voor de productie van recombinante parvovirussen (recPV).

Het protocol is onderverdeeld in twee grote delen. Het eerste deel (productie van recPV via transfectie) is nodig om de minimale hoeveelheid recPVs dat als inoculum dient in het tweede deel van het protocol (productie van recPVs via infectie) te produceren. Zodra een kleine hoeveelheid recPVs wordt geproduceerd, het eerste deel van het protocol kan worden weggelaten, en het recombinant parvovirus kunnen worden geamplificeerd alleen via infectie die het gen voor de parvovirus capside eiwitten door het adenovirus helper (zie hieronder).

1. Productie van recPVs via transfectie

1,1 viraal DNA transfectie

Het is mogelijk om een ​​ingestelde DNA transfectie methode in dit deel van het protocol ofwel gebaseerd op kationische lipiden of calciumfosfaat. We gebruiken over het algemeen Fugene HD transfectiereagens. Om transfectie-efficiëntie te controleren, raden wij u aan transfecteren extra plaat met een plasmide dat verbeterde Green Fluorescent Protein (bijv. pEGFP-N1, Clontech). Transfectie wordt als een efficiënte en optimaal voor virusproductie, wanneer tenminste 50% van de celpopulatie resultaten EGFP-positieve 24 uren na transfectie.

1. 1 dag voor transfectie, zaad 2000000 HEK293T cellen in 10 cm plaat 50% cellulaire confluentie verkregen op de dag van de transfectie. Cellen groeien in 10 ml van Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met toevoeging van 10% foetaal runderserum, 2 mM L-glutamine, 100 U per ml penicilline en 100 pg / ml streptomycine.
2. Bereid virus-making mengsel (01:02:01 molaire verhouding) in een 1,5 ml tube:
   1. 3 ug van de vector recPV het herbergen van de transgene van belang (ei PHH-1-GFP ^6).
   2. 6 ug van de vector pCMV / VP ⁵ herbergen van de parvovirus capside-gen-eenheid
   3. 8 pg of adenovirus-afgeleide helper plasmide pXX6 ^7.
3. Verdun de plasmiden mengen met serum-vrij medium tot 850 pi (eindconcentratie van 20 ng / pl).
4. Voeg 42,5 pi Fugene HD (2,5:1 verhouding pi Fugene: ug DNA). Raak kant van de buis bij het toevoegen van Fugene aan het medium.
5. Vortex zachtjes gedurende 5-10 seconden.
6. Incubeer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
7. Voeg de transfectie mengsels druppelsgewijs aan de cellen. Schud de plaat aan het mengsel gelijkmatig te verdelen in.

1,2 virusproductie

1. Incubeer de plaat bij 37 ° C met 92% vochtigheid en _5% CO2 gedurende 72 uur voor de oogst. Gedurende deze periode nakomelingen parvovirus deeltjes worden gevormd uit de parvovirus plasmiden.

1,3 Virus oogst

1. In een weefselkweek kap, schraap de cellen in hun medium, zuigen en breng de inhoud van de plaat in een 15ml plastic buis.
2. Centrifugeer de buis 250 g gedurende 5 min bij kamertemperatuur.
3. Verwijder 95% van het supernatans.
4. Vortex de buis langzaam aan de pellet resuspenderen in de overblijvende supernatant (0,5 ml).
5. Bevries de buis bij -80 ° C. Het is mogelijk om de productie stop in dit stadium of verder met het protocol.
6. Ontdooien van de schorsing en breng het op kamertemperatuur.
7. Bevries de suspensie in een vloeibare stikstof bad en ontdooien in warm water bij 37 ° C. Vortex de buizen krachtig gedurende 15 sec en herhaal de vries-dooi cyclus nog twee keer.
8. Centrifugeer de buizen bij 16.000 g gedurende 15 min bij 4 ° C.
9. Gebruik de bovenstaande vloeistof in een nieuwe buis. De buis bevat in deze fase de ruwe virus extract bereiden.
10. Ga verder met het virus titratie (zie hieronder). Voor de uitvoering recPV het GFP-gen, moet een typische geven 1-3 x 10 ⁷ virale infectieuze eenheden overeenkomt met ongeveer 1 -3 x ¹⁰ 10 virale genoom bevattende deeltjes.

1,4 Virus opslag

1. Voor opslag op lange termijn te bevriezen van de buis met de ruwe virus extract bij -80 ° C. Het is mogelijk om ruwe viral extracten inoculum gebruik in het tweede deel van het protocol.

2. De productie van recPVs via infectie

Alvorens te beginnen met de recPV productie via infectie, te produceren en te zuiveren adenovirus 5 het dragen van de parvovirus VP-gen (Ad-VP helper, beschreven in ⁵⁾ volgens de norm protocol ^8. Het is ook nodig om een minimale hoeveelheid recPVs die het transgen van belang (bijvoorbeeld geproduceerd door transfectie zoals hierboven beschreven) hebben.

Hieronder beschrijven we de recPV productie in ¹⁷⁵ cm2 kolf (T175) formaat. Verdere versterking van de virusvoorraad op deze wijze kan worden uitgevoerd in 10 meerlaagse CellStack cultuur kamers (Corning)met kleine aanpassingen van het protocol voorgesteld.

2.1 Infectie

1. 1 dag voor infectie plaat 10000000 NB324K cellen in een T175 kolf 60-80% cellulaire confluentie verkregen op de dag van infectie. Bereid een tweede kolf met hetzelfde aantal cellen als controle (niet-geïnfecteerde cellen). Elke T175 moet 20 ml Minimum Essential Medium (MEM) als eindvolume aangevuld met 5% foetaal runderserum, 2 mM L-glutamine, 100 E per ml Penicilin en 100 pg / ml streptomycine.
2. De volgende morgen bereiden virus mengsel in een 2 ml plastic buis bestaande uit:
   1. Ad-VP-helper ⁵ aan multipliciteit van infectie (MOI, infectieuze eenheden / cel) = 10 (overeenkomend met 1 x 10 ⁸ infectieuze eenheden);
   2. recPVs op MOI = 0,5 (overeenkomend met 5 x 10 ⁶ infectieuze eenheden). Voltooien 1,5 ml met MEM.
3. Breng de gehele virus mengsel in een van de kolf T175.
4. Incubeer dekolf gedurende 2 uur bij 37 ° C, 92% luchtvochtigheid, _5% CO2 zachtjes schudden om de 15 minuten.
5. Incubeer verdere 20-24 uur bij 37 ° C, 92% luchtvochtigheid, _5% CO2.
6. Vervang de culturele medium met vers medium.

2,2 virusproductie

Incubeer de kolven bij 37 ° C met 92% vochtigheid en _5% CO2 gedurende 48 uur. Als aanduiding van efficiënte virale productie moet duidelijk symptomen van cytotoxiciteit worden waargenomen in de kolf met virale geïnfecteerde cellen, vanaf 36 tot 48 uur na infectie.

2,3 Virus oogst

1. In een weefselkweek kap, zuigen en over te dragen het medium supernatans van de kolf in een centrifugebuis van 50 ml.
2. Twee keer Spoel de cellen met 1,5 ml PBS.
3. Trypsinize de cellen met 1.5 ml van 0,25% Trysin-EDTA. Voeg de celsuspensie de verwijderde medium.
4. Centrifugeer de cellen en de supernatant bij 5000 g gedurende 5 min bij kamertemperatuur buiARD.
5. Verwijder het supernatant.
6. Voeg 1 ml TE-buffer (1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,7) aan de celpellet voorzichtig vortex de buis om de cellen te resuspenderen.
7. Bevries de celsuspensie in een vloeibare stikstof bad en ontdooien in warm water bij 37 ° C. Vortex de buis krachtig gedurende 15 sec en herhaal de vries-dooi-cyclus drie keer.
8. Behandel de celsuspensie met 50 U / ml Benzonase Nuclease gedurende 30 min bij 37 ° C om de cellen genoom en onverpakte virale DNA te verteren.
9. Centrifugeer de buis 5000 g gedurende 20 minuten bij 4 ° C.
10. Gebruik de bovenstaande vloeistof in een nieuwe buis. De supernatant dit stadium bevat ruw extract virus preparaat. Typische opbrengsten van recPV-GFP geproduceerd naar aanleiding van deze protocol dient te worden in het bereik van 1-10 x 10 ⁸ virale infectieuze eenheden.

2,4 Virus opslag

1. Voor korte termijn opslag (maximaal 2 maanden), op te slaan virus bij 4 ° C.
2. Voor long termijn opslag (langer dan 2 maanden), op te slaan virus bij -80 ° C.

3. RecPV Zuivering

1. Voor de zuivering van recPVs uit de ruwe lysaten, raden wij u aan een Iodixanol discontinue gradiënt uitgevoerd volgens Zolotukhin et al.. ^9. Wij raden u aan een minimum van 5 ml van ruwe virale extract (afkomstig van de productie in vijf T175 kolven) voor een efficiënte virus zuivering.

4. Recombinant Parvovirus Titratie

1. Voer recPV titratie als beschreven in El-Andaloussi et al. ^5.

5. Quality Controls

1. Gebruik het protocol beschreven in El-Andaloussi et al.. ⁵ om te controleren op de aanwezigheid van ongewenste replicatie competente virussen (RCV) het verrichten van parvovirus plaque assay in NB324K indicator cellen.

6. Representatieve resultaten

Een voorbeeld van recPVs production via transfectie in de aanwezigheid of afwezigheid van adenovirus genomische elementen in figuur 3. Cellen werden getransfecteerd met pCMV / VP (plasmide dat het gen dat codeert voor de VP parvovirus capside eiwitten) met PHH-1-GFP (a recPV herbergt het GFP-gen) of PHH-1-luciferase (a recPV herbergt de vuurvlieg luciferase-gen) met (+ pXX6) of zonder (pXX6) de pXX6 plasmide (die de adenovirus E2A, E4 (ORF6) en VA RNA genen). Gelijke hoeveelheden van ruwe celextracten werden aangebracht op NB324K cellen en GFP transductie of luciferase assays werden uitgevoerd zoals in El-Andaloussi et al.. ^5. Een duidelijke verhoging van de recPVs productie werd in de aanwezigheid van pXX6 de productie verhogen van 0,3 GFP transductional eenheden (TU) / cel verkregen volgens de conventionele protocollen ongeveer 5 TU / cel verkregen bij onze methode (Fig. 3A, B). Een significante toename (ongeveer 24-voudig) van recPV productiop werd ook waargenomen bij PHH-1-luciferase (fig. 3C). Deze resultaten geven aan dat het genetische materiaal in pXX6 kan parvovirus productie verhogen.

Een representatief voorbeeld van recPVs productie via infectie in figuur 4. NB324K cellen werden geïnfecteerd met verschillende recPVs (zoals aangegeven in de figuur) en Ad-VP-helper (herbergen van het gen dat codeert voor de PV-VP capside eiwitten). Ad-VP helper verder verbeterd recPV productie tot> 70 TU per gezaaide cellen (Fig. 4A) zonder het optreden van ongewenste replicatiecompetente virusdeeltjes (Fig. 4B).

Figuur 1. Vectoren gebaseerd op autonome parvovirussen. (A) boven: Het transgen vervangt een deel van de VP-coderende genen en onder de controle van de virale promotor P38. De genen voor NS1 / 2 weer wordenonderhouden en de expressie wordt gecontroleerd door de virale promotor P4. De vector genoom wordt geflankeerd door de parvoviral ITRs, dat cis-werkende elementen die nodig zijn voor replicatie en inpakken van het recombinante genoom bevatten. Onder: een plasmide dat het VP-gen onder ofwel een heterologe (bijvoorbeeld CMV.) Of autologe (bijv. P38.) Promoter (Px) wordt geleverd in trans in recombinant parvovirus productie om te compenseren voor de verstoring van de structurele genen in de recombinante genoom. ITR, inverted terminal repeat. Figuur afgeleid van ^4. (B) Schematische weergave van de klassieke protocol gebruikt voor de productie van recPVs. HEK293T cellen transient getransfecteerd met virale DNA (vector en helper plasmiden) en na drie dagen worden de cellen verzameld en virus geoogst.

Figuur 2. Productie van de recPVshulp van de Ad-VP. (A) Schematische kaarten van recPV en Ad-VP genomen. De recPV bevat een heteroloog transgen welk deel van de VP regio vervangt. De Ad-VP herbergt het parvovirus VP-gen. (B) Schematische weergave van het protocol zoals beschreven in dit manuscript. NB324K cellen worden geïnfecteerd met recPV en Ad-VP virussen. Na drie dagen cellen worden geoogst en recPV deeltjes hersteld van cellysaat.

Figuur 3. Stimulatie van recPV productie adenovirus gebaseerde plasmiden pXX6. HEK293T cellen geënt in 10 cm schaaltjes werden getransfecteerd met pCMV / VP in combinatie met PHH-1-GFP (A en B) of PHH-1-luciferase (C) recPVs produceren. Tegelijkertijd werden cellen gecotransfecteerd met de adenovirus-afgeleide plasmiden helper pXX6 of niet, zoals aangegeven. Drie dagen na transfectie werden de cellen geoogst en gelyseerd door drie vries en ontdooi cycli. Gelijke volumes van crude virus extracten werden toegepast op de indicator cellen NBK, en transductie testen werden uitgevoerd. (A) Representatieve microfoto met GFP-positieve cellen in confluerende NB324K monolagen. (B) Kwantificering van het GFP-transductie assays uitgedrukt in transductie-eenheid (TU) per geplaatste cel . (C) Kwantificering van de luciferaseactiviteit uitgedrukt als relatieve luciferase eenheden (RLU). De luciferase test werd uitgevoerd zoals beschreven in El-Andaloussi et al.. ^5. Kolommen staan ​​gemiddelden van drie replicaten met standaardafwijking staven. Aantal boven op de + pXX6 kolom in (B en C) geeft de toename in de recPV virus titers, verkregen in de aanwezigheid van pXX6 versus zonder.

Figuur 4. Stimulatie van recPV productie met behulp van recombinant Ad-VP helpervirus. (A) NB324K cellen werden infectiested met gezuiverd Ad-VP helper virus met een moi van 10 (Ad-X eenheid / cel getitreerd met Adeno-X Rapid Titer Kit) en superinfectie met een van de volgende recombinant parvovirus Chi-hH-1-EGFP ¹¹ (0,1 TU / cel) of H-1-GFP (0,5 TU / cel) ^5. Een dag na infectie, werd het medium, en twee dagen later werden de cellen verzameld en gelyseerd door drie vries-dooi-en cycli. Ruwe celextracten werden gebruikt virus titers bepalen transductie test volgens El-Andaloussi et al.. ^5. TU, transductie eenheid (B). Virale batches die in aanwezigheid van afwezigheid van Ad-VP werden geanalyseerd op hun inhoud van replicatie-competente virusdeeltjes (HS) van plaque assay op NB324K indicator cellen.

We hebben aangetoond dat recPV productie kan worden versterkt door de aanwezigheid van adenovirale genoom elementen. We hebben het recPV opbrengst van meer dan 10 maal (0,3 tot 5 TU / cel) door adenovirus genomische element via transfectie en niet meer dan 100-voudig co-infecteren van de cellen met Ad-VP-helper in combinatie met de in recPV vergelijking met conventionele protocollen. Het protocol beschreven kan verder worden geoptimaliseerd door het bepalen van de meest geschikte timing voor de levering van het adenovirus genomische elementen en de optimale concentratie van Ad-VP helper worden gebruikt voor de infectie.

RecPVs met grotere transgenen (meer dan 1.600 basen) worden minder efficiënt geproduceerd. Dit is te wijten aan het feit dat door toevoeging van de transgen cis-werkende elementen voor PV goede viraal DNA verpakking verwijderd. De optimale grootte van de transgene dat kan in de PV-genoom worden ingebracht zonder dat de productie is tot 700 voets ^6. Ook de soort van de ingevoegde transgene van invloed kunnen zijn recPV productie (bv.. Inbrengen van genen die coderen voor cytotoxische eiwitten kan leiden tot lagere opbrengsten recPV).

Een ander belangrijk aspect in aanmerking tijdens recPVs productie is het mogelijk optreden van replicatie-competente virussen (HS) die spontaan kunnen worden gevormd door homologe recombinatie tussen het recombinant parvovirus en VP-bevattende plasmiden. Het huidige protocol is niet van verbetering van de recombinatie risico. Niettemin is een HS kwaliteitscontrole dient regelmatig te worden uitgevoerd (bv. Plaque assay in NB324K indicator cellen ⁵⁾ aan het einde van de productie om ervoor te zorgen dat virale voorraden bevatten slechts een te verwaarlozen hoeveelheid RCVs.

De beschreven protocol overwint voorgaande beperkingen in de keuze van de verpakkingen cellijn, zoals maakt het gebruik mogelijk van cellijnen die moeilijk te transfecteren (endaarom niet geschikt met protocollen op basis van transfectie), maar zijn goede producenten van PV's. bijvoorbeeld. NB324K cellen ¹⁰ die in onze handen werden efficiënter bij het ​​voortbrengen recPVs dan HEK293T (gegevens niet getoond). Een screening van verschillende cellijnen is het nu mogelijk de toepassing van het nieuwe protocol, en kon efficiëntere cellen te identificeren voor de recPV productie. Dit effent ook de weg naar een verdere verkenning van het systeem voor de grootschalige productie van recombinante parvovirus bijvoorbeeld. in bioreactoren met cellen in suspensie.