Producción eficiente de parvovirus recombinante con la ayuda de derivados de adenovirus-Systems

Nótese que un laboratorio con un nivel de bioseguridad 2 se requiere para la producción de parvovirus recombinantes (recPV).

El protocolo se divide en dos partes principales. La primera parte (producción de recPV a través de la transfección) se requiere para producir la cantidad mínima de recPVs que sirve como inóculo en la segunda parte del protocolo (producción de recPVs a través de la infección). Una vez que una pequeña cantidad de recPVs se produce, la primera parte del protocolo puede ser omitido, y el parvovirus recombinante puede ser amplificado sólo a través de la infección proporcionar el gen que codifica para las proteínas parvovirus cápside a través de la ayudante de adenovirus (véase más adelante).

1. Producción de recPVs través Transfección

1,1 transfección de ADN viral

Es posible utilizar cualquier método de transfección de ADN establecido en esta sección del protocolo ya sea sobre la base de lípidos catiónicos o fosfato cálcico. Generalmente usamos Fugene HReactivo D transfección. Para controlar la eficacia de transfección, se recomienda que la transfección de la placa adicional con un plásmido que expresa mayor proteína verde fluorescente (por ejemplo, pEGFP-N1, Clontech). Transfección se considera eficiente y óptima para la producción de virus cuando al menos 50% de la población de células resulta EGFP-positivas 24 horas después de la transfección.

1. 1 día antes de la transfección, las células HEK293T 2 millones de semillas en una placa de 10 cm, para obtener 50% de confluencia celular en el día de la transfección. Se cultivan las células en 10 ml de medio modificado de Dulbecco Eagle (DMEM) con adición de 10% de suero fetal bovino, 2 mM de L-glutamina, 100 U por ml de penicilina y 100 ug / ml de estreptomicina.
2. Preparar el virus de la toma de mezcla (1:2:1 proporción molar) en un tubo de 1,5 ml:
   1. 3 g de recPV vector de albergar el transgen de interés (IE PhH-1-GFP ^6).
   2. 6 g de vector pCMV / VP ⁵ albergar la cápsida del parvovirus unidad de gen
   3. 8 mg of adenovirus derivado de plásmido ayudante pXX6 ^7.
3. Se diluye la mezcla plásmidos con medio libre de suero hasta 850 (concentración final de 20 ng / l) l.
4. Añadir 42,5 l Fugene HD (2,5:1 Fugene l ratio: ADN g). No toque el lado del tubo cuando se añade Fugene al medio.
5. Vortex suavemente durante 5-10 segundos.
6. Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 30 minutos.
7. Añadir las mezclas de transfección una sabia gota a las células. Agitar la placa suavemente para distribuir uniformemente la mezcla de todo.

1.2 Virus de la producción

1. Incubar la placa a 37 ° C con un 92% de humedad y 5% de CO ₂ durante 72 horas antes de la cosecha. Durante este período partículas progenie parvovirus se forman a partir de los plásmidos parvovirus.

1.3 Virus de la cosecha

1. En una campana de cultivo de tejidos, raspar las células dentro de su medio, aspirar y transferir la suspensión de la placa en un 15ml tubo de plástico.
2. Centrifugar el tubo a 250 xg durante 5 min a temperatura ambiente.
3. Eliminar el 95% del sobrenadante.
4. Vortex el tubo suavemente para resuspender el precipitado en el sobrenadante restante (aproximadamente 0,5 ml).
5. Congelar el tubo a -80 ° C. Es posible detener la producción en esta etapa o para continuar con el protocolo.
6. Descongelar la suspensión y llevarlo a la temperatura ambiente.
7. Congelar la suspensión en un baño de nitrógeno líquido y descongelación en agua caliente a 37 ° C. Vortex los tubos vigorosamente durante 15 segundos y repita los ciclos de congelación-descongelación dos veces más.
8. Centrifugar los tubos a 16.000 xg durante 15 min a 4 ° C.
9. Recoger el sobrenadante en un tubo nuevo. El tubo en esta etapa contiene la preparación de virus extracto crudo.
10. Continúe con la titulación del virus (ver más abajo). Para el recPV que lleva el gen GFP, una típica producción debe dar de 1-3 x 10 ⁷ unidades virales infecciosas que corresponden a alrededor de 1 -3 x ¹⁰ 10 genoma viral que contiene partículas.

1.4 Virus de almacenamiento

1. Para almacenamiento a largo plazo congele el tubo que contiene el extracto de virus de crudo a -80 ° C. Es posible utilizar extractos crudos virales como inóculo en la segunda parte del protocolo.

2. Producción de recPVs través de la infección

Antes de comenzar con la producción recPV través de la infección, producción y purificación de adenovirus 5 que lleva el parvovirus VP gen (Ad-vicepresidente ayudante, se describe en el ⁵⁾ de acuerdo a protocolo estándar de ^8. También es necesario disponer de una cantidad mínima de recPVs portadores del transgén de interés (por ejemplo, producida a través de la transfección como se describió anteriormente).

A continuación, se describe la producción de recPV en 175 cm ² frasco (T175) en formato. Amplificación adicional del stock de virus producido de esta manera puede llevarse a cabo en 10 cámaras multicapa CellSTACK cultivo (Corning)con pequeños ajustes del protocolo propuesto.

2.1 La infección

1. 1 día antes de la infección, las células NB324K placa 10 millones en un matraz T175 para obtener 60-80% de confluencia celular en el día de la infección. Preparar un segundo matraz que contiene el mismo número de células como un control (células no infectadas). Cada T175 debe tener 20 ml de Medio Esencial Mínimo (MEM) como un volumen final, suplementado con 5% de suero fetal bovino, 2 mM de L-glutamina, 100U por ml Penicilina y 100 estreptomicina g / ml.
2. A la mañana siguiente preparar la mezcla de virus en un tubo de plástico de 2 ml que consiste en:
   1. Ad-VP-auxiliar ⁵ en multiplicidad de infección (MOI, las unidades infecciosas / celulares) = 10 (correspondiente a 1 x 10 ⁸ unidades infecciosas);
   2. recPVs en Moi = 0,5 (correspondiente a 5 x 10 ⁶ unidades infecciosas). Completar a 1,5 ml con MEM.
3. Aplicar la mezcla de virus entero en un matraz de la T175.
4. Incubar elmatraz durante 2 horas a 37 ° C, 92% de humedad, 5% de CO ₂ agitando suavemente cada 15 min.
5. Incubar durante 20-24 h más a 37 ° C, 92% humedad, 5% de CO _2.
6. Vuelva a colocar el medio de cultivo con medio fresco.

2.2 Virus de la producción

Incubar los matraces a 37 ° C con 92% de humedad y 5% de CO ₂ durante 48 horas. Como indicación de la producción viral eficiente, claros signos de citotoxicidad se deben observar en el matraz que contenía células infectadas por virus, a partir de 36-48 horas post-infección.

2.3 Virus de la cosecha

1. En una campana de cultivo de tejidos, aspirar y transferir el sobrenadante del medio desde el matraz en un tubo de centrífuga de 50 ml.
2. Se lavan las células dos veces con 1,5 ml de PBS.
3. Trypsinize las células con 1,5 ml de 0,25% Trysin-EDTA. Añadir la suspensión de células al medio eliminado.
4. Centrifugar las células y el sobrenadante a 5.000 xg durante 5 min a temple habitacióntura.
5. Eliminar el sobrenadante.
6. Añadir 1 ml de tampón TE (1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,7) al sedimento de células y vórtice suavemente el tubo para resuspender las células.
7. Congelar la suspensión celular en un baño de nitrógeno líquido y descongelación en agua caliente a 37 ° C. Vortex el tubo vigorosamente durante 15 segundos y repita el ciclo de congelación-deshielo en tres ocasiones.
8. Tratar la suspensión celular con 50 nucleasa U / ml Benzonase durante 30 min a 37 ° C con el fin de digerir el genómico de células y no envasados ​​ADNs virales.
9. Centrifugar el tubo a 5.000 xg durante 20 min a 4 ° C.
10. Recoger el sobrenadante en un tubo nuevo. El sobrenadante en esta etapa contiene la preparación de virus extracto crudo. Los rendimientos típicos de recPV-GFP producido siguiendo este protocolo debe estar en el intervalo de 1-10 x 10 ⁸ unidades infecciosas víricas.

2.4 Virus de almacenamiento

1. Para el almacenamiento a corto plazo (máximo 2 meses), virus de la tienda de a 4 ° C.
2. Por long almacenamiento a largo plazo (más de 2 meses), el virus de la tienda a -80 ° C.

3. RecPV Purificación

1. Para la purificación de recPVs de los lisados ​​crudos, se recomienda ejecutar un iodixanol gradiente discontinua de acuerdo a Zolotukhin et al. ^9. Recomendamos utilizar un mínimo de 5 ml de extracto crudo viral (obtenido de la producción en cinco matraces T175) para la purificación del virus eficiente.

4. Titulación parvovirus recombinante

1. Realizar titulación recPV como se describe en El-Andaloussi et al. ⁵

5. Controles de calidad

1. Utilizar el protocolo descrito en El-Andaloussi et al. ⁵ para comprobar la presencia de virus de replicación no deseados competentes (RCV) que llevan a cabo ensayos parvovirus placa en células indicadoras NB324K.

6. Los resultados representativos

Un ejemplo de recPVs production mediante transfección en presencia o ausencia de elementos genómicos de adenovirus se muestra en la Figura 3. Las células se transfectaron con pCMV / VP (plásmido que lleva el gen que codifica para las proteínas de la cápside VP parvovirus) junto con PhH-1-GFP (una recPV que alberga el gen GFP) o PhH-1-luciferasa (una recPV que alberga el gen de luciferasa de luciérnaga) , con (+ pXX6) o sin (-pXX6) la pXX6 plásmido (llevando el adenovirus E2A, E4 (orf6) y los genes VA RNA). Volumen igual de extractos de células brutos se aplica a NB324K células y transducción de GFP o ensayos de luciferasa se ​​realizaron como se informó en El-Andaloussi et al. ^5. Un claro aumento en la producción recPVs se obtuvo de la presencia de pXX6 con aumento de la producción de 0,3 unidades GFP transduccionales (TU) o de células obtenidas de acuerdo con protocolos convencionales a aproximadamente 5 TU / célula obtenida siguiendo nuestro método (Fig. 3A, B). Un aumento significativo (alrededor de 24 veces) de recPV Produccionessobre también se observó en el caso de PhH-1-luciferasa (fig. 3C). Estos resultados indican que el material genético contenido en pXX6 es capaz de impulsar la producción de parvovirus.

Un ejemplo representativo de la producción recPVs través de la infección se muestra en la Figura 4. Células NB324K fueron co-infectados con recPVs diferentes (como se indica en la figura) y Ad-VP-helper (que alberga el gen que codifica para las proteínas de la cápside VP PV). Ad-VP ayudante producción recPV mejorarse aún más hasta> 70 TU por sembrado de células (Fig. 4A), sin aumentar la ocurrencia de indeseables replicación competentes partículas virales (Fig. 4B).

Figura 1. Vectores sobre la base de los parvovirus autónomos. (A) superior: El transgén sustituye una parte de los genes codificantes VP y está bajo el control del promotor viral P38. Los genes para NS1 / 2 son recontenidas y su expresión está controlada por el promotor viral P4. El genoma del vector está flanqueado por el parvovírica RTI, que contienen elementos de acción cis que se requieren para la replicación y empaquetamiento del genoma recombinante. Conclusión: Un plásmido que lleva el gen VP-bajo o bien una heteróloga (por ejemplo por CMV.), O autógeno (por ejemplo, P38.) Promotor (Px), se suministra en trans durante la producción del parvovirus recombinante con el fin de compensar la interrupción de los genes estructurales en el genoma recombinante. ITR, repetición terminal invertida. Figura adaptada de ⁴ (B). Vista esquemática del protocolo clásico utilizado para la producción de recPVs. HEK293T células se transfectadas transitoriamente con ADN viral (vectores y plásmidos auxiliares) y después de tres días, las células se recogen y se recogieron los virus.

Figura 2. Producción de recPVs con ella ayuda de la Ad-VP. (A) Esquema de mapas de genomas recPV y Ad-VP. El recPV contiene un transgén heterólogo que sustituye parte de la región VP. El Ad-VP alberga el gen VP parvovirus. (B) Representación esquemática del protocolo descrito en este manuscrito. NB324K células están co-infectados con el virus recPV y Ad-VP. Después de tres días se cosechan las células y partículas recPV recuperado de lisado celular.

Figura 3. Estimulación de la producción recPV por el adenovirus-basados ​​en plásmidos pXX6. HEK293T células, se siembran en platos de 10 cm, fueron transfectadas con pCMV / VP en combinación con PhH-1-GFP (A y B) o PhH-1-luciferasa (C) para producir recPVs. Simultáneamente, las células fueron co-transfectadas con los plásmidos auxiliares derivados de adenovirus-pXX6 o no, como se indica. Tres días después de la transfección, las células se cosecharon y se lisaron mediante tres ciclos de congelación y descongelación. Volúmenes iguales de crudextractos de correos de virus se aplicaron a NBK células indicadoras, y los ensayos de transducción se llevaron a cabo. (A) micrografías representativas que muestran las células GFP positivos en monocapas confluentes NB324K. (B) Cuantificación de los ensayos de transducción de GFP expresada en la unidad de transducción (UT) por célula cabeza de serie . (C) La cuantificación de la actividad de la luciferasa expresado como unidades relativas de luciferasa (RLU). El ensayo de luciferasa se ​​realizó como se describe en el-Andaloussi et al. ^5. Las columnas representan los valores promedio de tres repeticiones con barras de desviación estándar. Número en la parte superior de la columna + pXX6, en (B y C), indica el aumento veces en los títulos de virus recPV, obtenido en la presencia de pXX6 versus sin.

Figura 4. Estimulación de la producción recPV por medio de virus recombinante ayudante ad-VP. (A) células NB324K, fueron infecciónTed con virus purificado ayudante Ad-VP en MOI de 10 (Ad-X unidad / célula, se titula con adeno-X Kit para la titulación) y, a continuación superinfección con cualquiera de los parvovirus siguiente recombinante Chi-HH-1-EGFP ¹¹ (0,1 TU / célula) o H-1-GFP (0,5 TU / célula) ^5. Un día después de la infección, el medio se cambió y dos días más tarde, las células se recogieron y se lisaron mediante tres de congelación-descongelación y ciclos. Los extractos crudos de células se utilizan para determinar los títulos de virus mediante el ensayo de transducción de acuerdo con El-Andaloussi et al. ^5. TU, unidad de transducción. (B) lotes virales producidos en la presencia de la ausencia de Ad-VP se analizaron para determinar su contenido de replicación competentes partículas virales (VN) por ensayo en placa en células indicadoras NB324K.

Hemos demostrado que la producción recPV puede mejorarse por la presencia de elementos genómicos adenovirales. Hemos aumentado los rendimientos recPV por más de 10 veces (de 0,3 a 5 UT / célula), proporcionando elemento adenovirus genómico a través de la transfección y por más de 100 veces infectan co-las células con Ad-VP-ayudante en combinación con el recPV en comparación con los protocolos convencionales. El protocolo descrito aquí puede optimizarse mediante la determinación de la temporización más adecuada para la entrega de los elementos de adenovirus genómicas y la concentración óptima de Ad-VP auxiliar para ser utilizado en la infección.

RecPVs con grandes transgenes (más de 1.600 bases) se produce menos eficientemente. Esto es probablemente debido al hecho de que mediante la inserción del transgén, que actúan en cis elementos necesarios para PV adecuado embalaje ADN viral se eliminan. El tamaño óptimo de transgén que se puede insertar en el genoma de PV sin afectar su producción es de hasta 700 de bases ^6. También la especie del transgén insertado puede afectar la producción de recPV (por ejemplo. Inserción de genes que codifican para las proteínas citotóxicas puede resultar en menores rendimientos recPV).

Otro aspecto importante a tomar en cuenta durante la producción recPVs es la posible aparición de virus de replicación competente (RCV) que de forma espontánea puede ser formado a través de la recombinación homóloga entre el parvovirus recombinantes y plásmidos VP-que contienen. El presente protocolo no aumenta el riesgo de recombinación. No obstante, un control de calidad VN debe ser realizada de forma rutinaria (por ejemplo. Ensayo en placa en células indicadoras NB324K ⁵⁾ al final de la producción con el fin de asegurar que las poblaciones virales contienen sólo una cantidad insignificante de RCVS.

El protocolo descrito supera las limitaciones anteriores en la elección de la línea celular embalaje utilizado, ya que hace posible el uso de líneas celulares que son difíciles de transfectar (ypor lo tanto no es adecuado con protocolos basados ​​en la transfección), pero son buenos productores de PV. por ejemplo. NB324K células ¹⁰ que en las manos eran más eficientes en la producción de recPVs que HEK293T (datos no presentados). Un examen de las diferentes líneas celulares, ahora es posible aplicar el nuevo protocolo, y que podría identificar a las células más eficientes para la producción de recPV. Esto también allana el camino para una exploración más profunda del sistema de producción a gran escala de, por ejemplo el parvovirus recombinante. en biorreactores con células en suspensión.