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 JoVE Bioengineering

用接着周波数アッセイその場で速度論解析

,

Biomedical Engineering Department, Georgia Institute of Technology

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Cite this Article: 用接着周波数アッセイその場で速度論解析

Zarnitsyna, V. I., Zhu, C. Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface. J. Vis. Exp. (57), e3519, doi:10.3791/3519 (2011).

Abstract: 用接着周波数アッセイその場で速度論解析

マイクロピペットの接着アッセイは、2次元（2D）受容体-リガンド結合速度1を測定するために、1998年に開発されました。アッセイは接着センサーと相互作用する分子のいずれかの提示細胞としてのヒト赤血球（RBC）を使用しています。それは正確に制御領域との結合形成を可能にするための時間と他の相互作用する分子を発現し、他の細胞と接触RBCを持って来るためにマイクロマニピュレーションを採用しています。接着イベントは離れた二つのセルを引っ張って上RBCの伸長として検出されます。赤血球表面上に固定化されたリガンドの密度を制御することにより、密着性の確率は0と1の間のミッドレンジ内に保持されます。付着確率は、所定の接触時間の2つの細胞間の繰り返し接触サイクルの順序で接着事象の頻度から推定される。接触時間を変化させることで結合曲線を生成します。結合する受容体-リガンドの反応速度論1の確率モデルのフィット曲線は、2次元親和性とオフレートを返します。

アッセイは、IgGのFc 1-6、複合糖質リガンド6-9、配位子10-13、homotypicalカドヘリン結合14、ペプチド-主要組織適合遺伝子複合体15とT細胞受容体とレセプターとのインテグリンとセレクチンとのFcγ受容体の相互作用を用いて検証されています- 19。

メソッドは、このような膜microtopology 5、膜アンカー2、分子配向と長さ6、キャリアの剛性9曲20、インピンジメント力20、ならびに生化学的要因として生物物理学的な要因によって2D速度の規制を定量化するために使用されていますこのような相互作用する分子が存在し、これらの分子15,17,19の表面の組織細胞骨格と膜の微小環境の変調器として。

方法は、tをも使用されていますOは、修正モデル21を使用してデュアル受容体-リガンドの種3,4の同時結合、および19 trimolecular相互作用を研究する。

法の大きな長所は、それが彼らのネイティブな膜環境での受容体の研究をできることです。結果は、精製された受容体17を用いて得られたものとは大きく異なる可能性があります。また、よく典型的な生化学的方法を超えて時間分解能を持つサブ秒の時間スケールにおける受容体 - リガンド相互作用の研究が可能になります。

マイクロピペットの接着周波数の方式を説明するために、我々はαLβ2をアクティブにするために溶液中で二量体のE -セレクチンと好中球上のインテグリンαLβ2に結合赤血球の官能細胞間接着分子1（ICAM - 1）の動態の測定を示す。

Protocol: 用接着周波数アッセイその場で速度論解析

1。全血から赤血球を分離

  1. EAS - 45溶液を調製。 表Iからすべての成分を秤量し、純水の100〜200ミリリットルに溶解する。千ミリリットルソリューションを作成し、pHを8.0に調整するために水を加えます。 50ミリリットルでフィルタと注し。ストレージ用に-20℃で凍結する。

注：ステップ1.2は、プロトコルを承認された治験審査委員会で、このような看護師として訓練を受けた医療専門家が行ってください。

  1. EDTAを含有する10mlのチューブに肘正中皮静脈からの血液の3〜5ミリリットルを描き、優しく直ちにEDTAと血液を混合し、完全に凝固しないように。
  2. プロセスの血液サンプルをできるだけ早く。遠心分離以外のすべての次の手順は、準備が無菌に保つためにフードの下で行われる必要があります。 、50ミリリットル遠心管に血液を移す5分@ 1000rpm、4℃で寒さと無菌1077 Histopaqueと遠心10mlのを追加します。二回繰り返します。
  3. 10を加算mlの冷と滅菌PBS、5分@ 1000rpmのための遠心、4℃上清を取り除く。 4回（5回の合計）を繰り返します。
  4. 二回滅菌EAS - 45（5分@ 1000rpm、4℃）で洗浄する。最後の洗浄の移動の赤血球中に新しい滅菌15ミリリットルチューブに。
  5. 再懸濁し、赤血球in10ml EAS - 45。

2。赤血球のビオチン化

  1. ステップ1からの赤血球とチューブを取る。 5分@ 1000rpm、4℃で遠心分離後上清を取り除くいくつかのバイアルの各々に赤血球ペレット10μlを入れ、（6種類の赤血球のビオチン濃度の調製例については、 表IIを参照）各バイアルにPBSの対応する量を加える。
  2. 表IIによれば、新鮮なBiotin-X-NHS/DMF 1:10、1:100希釈を行う。
  3. 各バイアルに0.1Mホウ酸緩衝液10μlを追加します。
  4. すぐに計算された各バイアルにビオチン溶液の量（例として表IIを参照）、ボルテックスを追加。
  5. 各赤血球のバイアルを配置50ミリリットルコニカルチューブと室温で30分間ローテーターでインキュベート内側。
  6. 2分@ 2000rpm用EAS - 45の800μlに各バイアルを3回洗浄。
  7. 4の各バイアルと店舗℃にEAS - 45の100μLを加える最終的なソリューションの各1μlのに今赤血球の〜1mlnでなければなりません。

3。赤血球にビオチン架橋配位子の*を官能

  1. 製造元の指示に従って、2mg/mlストレプトアビジン溶液を調製します。 Aliqouted溶液を-20℃で保存することができます
  2. すぐにストレプトアビジン溶液を、ボルテックスでステップ2.7（10μL）から赤血球の同量を混合し、4℃で30分間ローテーターでインキュベート℃に
  3. 2分@ 2000rpm用EAS - 45の500μLで3回洗浄する。 15μlEAS - 45ストレージ用/ 1％BSAを追加。
  4. すぐに20μg/mlリガンド溶液、渦とステップ3.3（10μL）から赤血球の同量を混合し、室温で30分間ローテーターでインキュベートする。
  5. の500μLで2回洗浄するEAS -2分@ 2000rpmは45 / 1％BSA。ストレージ用EAS - 45 / 1％BSAの15μlを追加。

目的タンパク質は、タンパク質のビオチン化のための市販のキットのいずれか（例えば、サーモサイエンティフィック＃21955 EZ -リンクマイクロNHS - PEG4 -ビオチン標識キット）を使用するか示すように中間ステップとして、ビオチン化捕捉抗体を使用できる、ビオチンのリンクがない場合*ビデオインチ

4。受容体とリガンド密度の定量化

  1. それぞれのモノクローナル抗体の飽和濃度の異なるバイアル、受容体を有する細胞において、室温で30分間、ステップ3からリガンドでコーティングされた赤血球をインキュベートし。制御とは無関係アイソタイプ適合抗体で別々のバイアルの細胞でインキュベートする。一次抗体が蛍光標識されていない場合は、製造元の指示に従って蛍光標識二次抗体でインキュベートする。
  2. 対応する蛍光CALとフローcytometeryでステップ4.1で調製したサンプルを分析するibrationビーズ。図に示すように密度を計算する。 1。

5。マイクロピペットおよびセルチャンバーのための準備

  1. PN - 30ナリシゲ"磁気ガラス管微小電極水平プラーまたはサターインスツルメンツマイクロピペットプラーを使用して、キャピラリーチューブからマイクロピペットを引き出します。
  2. 希望のサイズ（通常は1 -5μm以下から必要な直径の範囲の研究で使用するセルのサイズに依存）に引っ張らマイクロピペットの先端を調整するマイクロフォージでマニピュレータを使用してください。
  3. 希望のサイズに顕微鏡のカバーガラスを切断することにより、セルチャンバーを準備。実験中に浸透圧を変更するには培地の蒸発を防ぐために両側からミネラルオイルを使用してチャンバーを密閉する。
  4. チャンバーへの受容体とリガンド有利子細胞を追加。

6。マイクロピペットの接着周波数分析

  1. それぞれのピペットで相互作用する細胞を吸引し、コンピュータにプログラムさpiezoelectrを使用してください ICのトランスレータは、制御された接触面積と時間で他の細胞と接触してアウトのRBCを駆動する。細胞の分離時にRBCの伸長を観察することによって、接着事象を検出する。
  2. 所定の接触時間、接触収縮のサイクルを50〜100倍を繰り返します。 Excelスプレッドシートの列のない接着用接着または"0"のために"1"を追加して観測された付着のイベントを記録します。あなたは、顕微鏡画像については、例えば、デジタルメディアやビデオテープを記録装置を使用することができます。
  3. 接着周波数に対する平均値とSEMを取得するには、各接触時間のために少なくとも3つの異なるセルのペアを使用して接触時間曲線を記録します。
  4. 無関係のリガンド（例えばBSA）および/またはそれらの特定の機能的な封鎖のモノクローナル抗体を用いてリガンドまたは受容体を遮断することでコーティングされた赤血球を使用して、コントロールのための非特異的結合曲線を記録します。各接触時間の時点で特定の接着周波数は非特異的な接着周波数1を除去することによって計算することができます。
ove_title"> 7。データ解析

  1. 特定の接着周波数を合わせるP前方に二階と一階受容体の単一種と配位子1の単一種の間に逆、シングルステップの対話を記述する確率モデル（式1）により、対の接触時間 t のデータ：
    式（1）
    2D効果的な結合親和性であるここで、K、kは オフオフレートである、M RとM Lは、手順4で測定されたそれぞれの受容体とリガンド密度、c は接触面積である。カーブフィットは、CとKの2つのパラメータ、C K AとK から 、ひとまとめにし、効果的な2Dの親和性と総称と呼ばれるている。オフレートとその製品は、効果的な2次元上のレートです。 C K 上 = A C K x kでオフ 。
    特定の接着周波数Pの合計を測定接着（P 測定 ）1,21をから非特異的接着の割合（P 非特異的 ）の減算によって計算される。
    式（2）

8。代表的な結果：

図1
好中球上のインテグリンαLβ2サイトの密度の1決定図 。好中球は、最初に図3,4にまたはE -セレクチン- Igをせずに使用される実験条件に一致する10分のためのE -セレクチン- Igの1μg/mlのとインキュベートし、その後、PE標識抗の飽和濃度（10μg/ml）とされたヒトCD11aモノクローナル抗体（クローンHI111、 特定の表を参照してください試薬と装置）や制御のための無関係のマウスIgG1は、洗浄し、直ちに分析した。サンプルは標準QuantiBRITE PEのキャリブレーションビーズのBD LSRのフローサイトメーターで読み取った。パネルは、E -セレクチン- Igの処理（青色）または未処理の細胞（緑色）のものと一緒にキャリブレーションビーズの蛍光ヒストグラム（ピンク）を示します。特定のCD11aモノクローナル抗体の染色が実線で示されており、無関係なアイソタイプ適合コントロール抗体の染色は点線の曲線で示さ​​れています。未処理の細胞との比較から見て、E -セレクチン- Igは（すべての洗浄ステップでとFACS緩衝液中の存在）で処理した細胞はCD11aの密度に影響を与えなかった。パネルBは、密度の定量化のプロセスを示しています。 LOG10は、パネル（ピンクの円）とビーズあたりのロット別のPE分子（メーカーから）のための4つのキャリブレーションビーズのヒストグラムの各ピーク値の平均蛍光強度（FI）を算出した。 LOG10 fluorescに対するビーズ当たりLOG10 PE分子の線形回帰リファレンスはプロットした。 respectivly、E -セレクチン処理した細胞に対して特異的mAbおよびコントロール抗体のための3.99（青実線丸）と2.23（青白丸）に等しいLOG10 FI（y）の値。我々はPEとしては、x（値はパネルBの緑と青の円としてプロットされている）X = LOG10 PE /セルの線形方程式を解くと：モノクローナル抗体の比は1:1であった、好中球上のαLβ2の合計数があった9587として算出。面密度は、好中球の直径22として8.4μmを使用して、43分子/μm2であると計算された。 ICAM - 1の密度も同様に65モル/μm2のに匹敵PE -抗ヒトCD54モノクローナル抗体を、使用してフローのcytometeryによって測定した。

図2
図2 マイクロピペットのシステムの回路図 。私たちのマイクロピペットシステムは、家の中で組み立てられ、3つのサブシステムで構成されて：イメージングサブシステムを一つ、RECを観察できるようにするORDとマイクロピペット - 吸引された細胞の動きを分析し、一つのマイクロピペットに細胞を吸引できるように、セルチャンバーから細胞を選択するときは、1つ、および圧力のサブシステムを有効にするためにマイクロマニピュレーションのサブシステムを。イメージングシステムの中心部分は、100倍の油浸1.25 NAの目的で顕微鏡（オリンパスIMT - 2 IMT2を）反転されます。画像は、電荷結合デバイス（CCD）カメラを介してビデオカセットレコーダーに送信されます。ビデオのタイマーは時間を追跡するシステムに結合されている。各マイクロピペットを顕微鏡に装着され、細かく三軸油圧マイクロマニピュレーターと位置付け、機械的駆動によって操作することができます。ニューポートからの機械的なマニピュレータも使用可能です。マイクロピペットホルダーの一つは、圧電変換器にマウントされている、のドライバは、ピエゾアクチュエータに電圧​​アンプ（自家製）を介してDAQボードを介してコンピュータLabVIEWコード（リクエストを承ります）と信号の変換によって制御されます。このllows接着試験サイクルで正確にかつ繰り返ピペットを移動一つ。圧力調整のサブシステムは、実験中に吸引を制御するために使用されます。油圧ラインが流体リザーバへのマイクロピペットホルダーを接続します。微細な機械的な位置決めは、貯水池の高さを正確に操作することができます。

マイクロピペットはKIMAXの融点のホウケイ酸ガラス毛細管（1.0の外径± 0.07 mmと0.7の内径± 0.07 mmを使用して生成されます。まず、キャピラリーチューブからマイクロピペットをナリシゲ"磁気ガラス管微小電極水平プラーPN - 30を使用して引っ張られている（サッターインスツルメンツマイクロピペットプラーは、別の引き手のオプションです）。第二に、マイクロフォージシステムは、（家の中で構築された）目的のサイズの開口部にマイクロピペットをカットするために使用されます。マイクロフォージシステムの商用モデルもご用意しています。

実験、microsc中にマイクロピペットの振動を避けるためにOPE、マニピュレーターと共に、エアサスペンションのテーブルの上に置かれている。

図3
ICAM - 1（）またはhIgG（Bでコーティングされた赤血球の間で繰り返される接着試験サイクルから測定された（）と非特異的な（B）1S（赤）と10秒（青）で結合接触時間のための接着の周波数 f i を実行して図3 ）ヒト好中球はインテグリンαLβ2を表す。F I =（X 1 + X 2 + ... + X iを持つ）/ I（1≤i≤nの）、 私は、テストサイクルのインデックスです、X iは "1"となります（付着）または"0"（無接着）。F n回 （n = 50）が付着確率のための最良の推定値として使用されました。

図4
4カイネティクスを図好中球のインテグリンαLβ2（にICAM - 1結合スクエア ）。各接触時に3つの細胞ペアのために、図3に示すように測定された付着確率を平均し、接触時間に対してプロットされる。チャンバーの培地は、αのLのβ2の結合をアップレギュレートするために1mMのCa 2 +の各+およびMg 2 +二量体のE -セレクチン- Igのプラス1μg/mlのとHBSSいました。 、赤血球にICAM - 1 - Igを捕捉するための中間ステップは、ストレプトアビジンのインキュベーションステップの後に10μg/ml捕捉抗体（ビオチン化ヤギ抗ヒトFc抗体、eBioscience社）で赤血球をインキュベートするために追加されました。非特異的結合2つの異なる条件を制御するために使用されていました：1）赤血球は、抗ヒトFcを捕捉抗体を塗布し、ヒトIgGの代わりにICAM - 1 - Igは（O）と2でインキュベート）でコーティングされていない赤血球への結合好中球（Δ）抗体を捕捉。 10μg/mlヒトIgGは、Eの結合を最小限に抑えるために培地に添加した赤血球表面上に捕捉抗体の溶液中で-セレクチン- Igは。ヒトIgGの制御曲線として記録された非特異的結合は、特定の付着確率曲線を（得るために使用されたスクエア ）を算出する。 2。式とのフィッティング特定の付着確率の曲線。 1（実線）は、効果的な結合親和性は 、K = 1.4•10 -4μm4 と k オフ = 0.3秒-1を返しました。

試薬 MW（g /モル） 濃度（mM）を量（g）
アデニン 135.13 2 0.27
D -グルコース（ブドウ糖） 180.16 110 19.82
D -マンニトール 182.17 55 10.02
塩化ナトリウム（NaCl） 58.44 50 2.92
リン酸ナトリウム、二塩基（ナトリウム HPO ） 141.95 20 2.84
L -グルタミン 146.15 10 1.46

表1。EAS - 45バッファー調製（1L）。

DMF 550μlの25 mgのビオチン- XHS 0.1Mビオチン溶液
0.1ビオチンのw / DMFの10倍希釈 0.01Mビオチン溶液
0.1ビオチンのw / DMFの1:100希釈 0.001Mビオチン溶液

表2。ビオチン溶液の調製。

ビオチンの最終濃度（μM） 4 10 20 50 100 160
赤血球ペレット株式（μL） 10 10 10 10 10 10
1X PBS（μL） 179.2 178 176 179 178 176.8
0.1Mホウ酸緩衝液（液） 10 10 10 10 10 10
0.01Mビオチン溶液（μL） 1 2 3.2
0.001Mビオチン溶液（μL） 0.8 2 4

表3。赤血球のビオチン化。

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Discussion: 用接着周波数アッセイその場で速度論解析

首尾よく、いくつかの重要なステップを考慮する必要がありますマイクロ接着周波数アッセイを使用する。最初に、興味の受容体 - リガンドシステムのための特異的相互作用を記録することを確認してください。非特異的コントロールの測定値（図3参照、4）特異性を確認してください。理想的には、非特異的付着確率は、すべての接触の継続時間を0.05未満である必要がありますし、各時点の特定と非特異的付着確率の間に有意差を持っているため。別の方法は、赤血球の表面に結合するリガンドを使用することができる。それは、方法17をカップリング塩化クロム、ビオチン-ストレプトアビジンの結合より非特異的結合のより高いレベルを与えたことが示された。

第二に、特定の相互作用のための付着確率はミドルレンジにする必要があります。受容体は構成的に細胞上に発現している場合、この要件は、受容体とリガンド（または赤血球上のみリガンドの密度を変えることによって満たすことができるの変更が困難になっている密度）。この目的のために、未知の受容体 - リガンド結合親和性と新しいシステムをテストするとき、リガンド密度の様々なテストすること（例として、表IIIを参照）ビオチン化赤血球の範囲を準備する。平均的なリガンドの密度が高すぎると細胞 - 細胞受容体の密度変化は、通常は1にいくつかの細胞の接着のレベルをもたらすとして。定常状態の付着確率は、平均で0.8を超えてはいけません特異性のための最初のテスト中に、一部のセルは0または1の接着レベルを持っている場合、リガンドの密度を調整する必要があります。非特異的コントロールの測定は、通常、特定の測定値に従って、ここで一つは限りなくゼロに近づけるように付着確率を持っていると思います。

第三に、接触時間の正しい範囲を見つける。式の言葉- （K オフ t）との接触時間が長く十分なEXPである場合。 1はゼロになり、効果的な2Dの親和性はプラトーレベルから計算することができます。接着曲線1：
式（3）
オフ率kは オフ遷移段階またはどのように迅速に接着曲線はプラトーレベルに達したが決まります。オフ率を推定するためには、正確に移行期におけるプラトーレベルだけでなく、十分な時間の点でいくつかのポイントの測定を必要とします。より上の説明する3つの重要なステップの会計処理は、図と同様の結合曲線を取得します。 4。

残りのタスクは、実験的に測定された結合曲線を解釈し、データへのモデルの予測を当てはめるから2D動態パラメータの推定値に受容体 - リガンド結合動力学モデルを使用することです。それは、その式に注意する必要があります。 1は、単一の受容体-リガンドの種1の間の前方に二次、一次の逆、シングルステップ、可逆反応速度論の最も単純なモデルを表しています。より複雑な運動プロセスが目を含め、記載されている活性部位の形成ではなく、結合速度10で制限さ3,4、二段14のない、または19 trimolecular相互作用との結合、および接着動態デュアル受容体-リガンド種の電子ケース。これらのケースでは、より複雑な数学的モデルは、付着確率対の接触時間の曲線と受容体 - リガンド結合速度を関連付けるために必要とされています。

受容体 - リガンド相互作用の動力学における持続的な関心​​は、動力学パラメータは、セル内の下流のシグナル伝達イベントを決定する役割を果たしていることが根本的な仮説から生じている。ここで紹介するマイクロピペットの接着周波数アッセイは、2次元（2D）結合速度の現場測定ができる非常にいくつかの方法のいずれかです。受容体とリガンドの両方が細胞表面上にあることを二次元の手段、として自然に生物内部の多くの細胞間の相互作用で発生します。受容体- LIGの2D運動速度定数との結合細胞がお互いにまたは細胞外マトリックスに結合する方法迅速にするための情報を提供し、それらが結合したまま、そしてどのくらいの時間どのように多くの結合が形成されます。比較することにより、表面プラズモン共鳴（SPR）法で相互作用する分子の23つは、流体相のそれ故に3次元（3D）バインディングと呼ばれます。両方とも相互作用する分子を精製し、細胞環境から分離されているため、3次元計測で得られた動力学的パラメーターは、同じ受容体-リガンド対17の2次元測定で得られたものとは大幅に異なる可能性があります。

接着周波数の方法は、生きている細胞膜上に2次元動態を分析し、そのため一細胞環境の生物物理学的および生化学的規制を分析するための機会を提供しています。これらは、膜microtopology 5、膜アンカー2、分子配向と長さ6、キャリアの剛性9と曲率を含む温度20、インピンジメント力20、および相互作用する分子は、15,17を常駐細胞骨格と膜組織のモジュレーター。

クロス接合部の受容体 - リガンド相互作用、2つのセル間で物理的結合の2つのセルと結果の間に直接的な物理的接触を必要とするため、分子間相互作用の化学反応速度論は、接触してセルを置くと効果によって結合を検出する機械的なアッセイにより分析することができます。力の。我々は接着センサとしてマイクロピペット-吸引RBCを用いた接着周波数アッセイを例示が、他の力の技術は、原子間力顕微鏡24、生体膜力プローブ8,17、光ピンセット25、および統合されたマイクロピペットおよびカンチレバー26を含む、使用することができます。

他の機械的にベースの2Dアッセイが開発されている。これらは、熱揺らぎの検定8、centrifugaが含まれていますアッセイ29、およびフローチャンバーアッセイ30,31を rosettingるアッセイ27,28、。

接着周波数アッセイの制限は、細胞の単一のペアで繰り返しシリアルサイクルによるアッセイのが遅いと労働集約的な性質は、一度に一つの接触をテストされています。長い接触時間は、実験がinhibitively長いこと、定常状態に達するために結合曲線のために必要となるので、それはゆっく​​りオフ率の受容体 - リガンド相互作用のため困難になります。

マイクロピペット-吸引RBCによって構築された力変換器は、非共有結合性受容体-リガンド結合1,32の典型的な強さよりも桁違いに低いpiconewtonレベルの力を、検出することが可能です。しかし、受容体 - リガンド解離は、ゼロの力でも発生する可能性があります。結合親和性とオン率1の過小評価に検出されないリード線を超えるような弱い接着。

T彼接着周波数の方法は、各接着試験は、同一と他から独立していることを前提としています。現在の接着は、次の付着の確率を増加または減少したいくつかのシステム33、のために示されたようにこの要件に違反することができます。要件が接着事象の記録順序のために満たされているかどうかをチェックするためのMatlabのコードは、リクエストに応じて入手可能です。

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Disclosures: 用接着周波数アッセイその場で速度論解析

利害の衝突は宣言されません。

Acknowledgements: 用接着周波数アッセイその場で速度論解析

この研究は、NIHの助成金R01HL091020、R01HL093723、R01AI077343、およびR01GM096187によってサポートされていました。

Materials: 用接着周波数アッセイその場で速度論解析

Name Company Catalog Number Comments
10x PBS BioWhittaker

17-517Q

 Dilute to 1x with deionized water prior to use
Vacutainer EDTA BD Biosciences 366643 RBCs isolation
10ML PK100
Histopaque 1077 Sigma-Aldrich 10771 RBCs isolation
Adenine Sigma-Aldrich A2786 EAS-45 preparation
D-glucose (dextrose) Sigma-Aldrich G7528 EAS-45 preparation
D-Mannitol Sigma-Aldrich 6360 EAS-45 preparation
Sodium Chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S7653 EAS-45 preparation
Sodium Phosphate, Dibasic (Na₂HPO₄) Fisher Scientific S374 EAS-45 preparation
L-glutamine Sigma-Aldrich G5763 EAS-45 preparation
Biotin-X-NHS Calbiochem 203188 RBCs biotinylation
Dimethylformamide (DMF) Thermo Fisher Scientific, Inc. 20673 RBCs biotinylation
Borate Buffer (0.1M) Electron Microscopy Sciences 11455-90 RBCs biotinylation
Streptavidin Thermo Fisher Scientific, Inc. 21125 Ligand functionalizing
BSA Sigma-Aldrich A0336 Ligand functionalizing
Quantibrite PE Beads BD Biosciences 340495 Density quantification
Flow cytometer BD Biosciences

BD LSR II

 Density quantification

Capillary Tube

0.7-1.0mm x 30"		 Kimble Chase 46485-1 Micropipette pulling
Mineral Oil Fisher Scientific BP2629-1 Chamber assembly
Microscope Cover Glass Fisher Scientific 12-544-G Chamber assembly

PE α-human CD11a

Clone HI 111 		eBioscience 12-0119-71 Reagent for Fig.1
PE anti-human CD54 eBioscience 12-0549 Reagent for Fig.1
Mouse IgG1 Isotype Control PE eBioscience 12-4714 Reagent for Fig.1
hydraulic micromanipulator Narishige International MO-303 Micropipette system
Mechanical manipulator Newport Corp. 461-xyz-m, SM-13, DM-13 Micropipette system
piez–lectric translator Physik Instruments P-840 Micropipette system
LabVIEW National Instruments Version 8.6 Micropipette system
DAQ board National Instruments USB-6008 Micropipette system
Optical table Kinetic Systems 5200 Series Micropipette system

References: 用接着周波数アッセイその場で速度論解析

  1. Chesla, S.E., Selvaraj, P., & Zhu, C. Measuring two-dimensional receptor-ligand binding kinetics by micropipette. Biophys. J. 75, 1553-1572 (1998).
  2. Chesla, S.E., Li, P., Nagarajan, S., Selvaraj, P., & Zhu, C. The membrane anchor influences ligand binding two-dimensional kinetic rates and three-dimensional affinity of FcgammaRIII (CD16). J. Biol. Chem. 275, 10235-10246 (2000).
  3. Williams, T.E., Nagarajan, S., Selvaraj, P., & Zhu, C. Concurrent and independent binding of Fcgamma receptors IIa and IIIb to surface-bound IgG. Biophys. J. 79, 1867-1875 (2000).
  4. Williams, T.E., Selvaraj, P., & Zhu, C. Concurrent binding to multiple ligands: kinetic rates of CD16b for membrane-bound IgG1 and IgG2. Biophys. J. 79, 1858-1866 (2000).
  5. Williams, T.E., Nagarajan, S., Selvaraj, P., & Zhu, C. Quantifying the impact of membrane microtopology on effective two-dimensional affinity. J. Biol. Chem. 276, 13283-13288 (2001).
  6. Huang, J., et al. Quantifying the effects of molecular orientation and length on two-dimensional receptor-ligand binding kinetics. J. Biol. Chem. 279, 44915-44923 (2004).
  7. Long, M., Zhao, H., Huang, K.S., & Zhu, C. Kinetic measurements of cell surface E-selectin/carbohydrate ligand interactions. Ann. Biomed. Eng. 29, 935-946 (2001).
  8. Chen, W., Evans, E.A., McEver, R.P., & Zhu, C. Monitoring receptor-ligand interactions between surfaces by thermal fluctuations. Biophys. J. 94, 694-701 (2008).
  9. Wu, L., et al. Impact of carrier stiffness and microtopology on two-dimensional kinetics of P-selectin and P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1) interactions. J. Biol. Chem. 282, 9846-9854 (2007).
  10. Waugh, R.E. & Lomakina, E.B. Active site formation, not bond kinetics, limits adhesion rate between human neutrophils and immobilized vascular cell adhesion molecule 1. Biophys. J. 96, 268-275 (2009).
  11. Zhang, F., et al. Two-dimensional kinetics regulation of alphaLbeta2-ICAM-1 interaction by conformational changes of the alphaL-inserted domain. J. Biol. Chem. 280, 42207-42218 (2005).
  12. Lomakina, E.B. & Waugh, R.E. Adhesion between human neutrophils and immobilized endothelial ligand vascular cell adhesion molecule 1: divalent ion effects. Biophys. J. 96, 276-284 (2009).
  13. Chen, W., Lou, J., & Zhu, C. Forcing switch from short- to intermediate- and long-lived states of the alphaA domain generates LFA-1/ICAM-1 catch bonds. J. Biol. Chem. 285, 35967-35978 (2010).
  14. Chien, Y.H., et al. Two stage cadherin kinetics require multiple extracellular domains but not the cytoplasmic region. J. Biol. Chem. 283, 1848-1856 (2008).
  15. Huang, J., Edwards, L.J., Evavold, B.D., & Zhu, C. Kinetics of MHC-CD8 interaction at the T cell membrane. J. Immunol. 179, 7653-7662 (2007).
  16. Wasserman, H.A., et al. MHC variant peptide-mediated anergy of encephalitogenic T cells requires SHP-1. J. Immunol. 181, 6843-6849 (2008).
  17. Huang, J., et al. The kinetics of two-dimensional TCR and pMHC interactions determine T-cell responsiveness. Nature. 464, 932-936(2010).
  18. Sabatino, J.J., Jr., Huang, J., Zhu, C., & Evavold, B.D. High prevalence of low affinity peptide-MHC II tetramer-negative effectors during polyclonal CD4+ T cell responses. J. Exp. Med. 208, 81-90 (2011).
  19. Jiang, N., et al. Two-stage cooperative T cell receptor-peptide major histocompatibility complex-CD8 trimolecular interactions amplify antigen discrimination. Immunity. 34, 13-23 (2011).
  20. Spillmann, C.M., Lomakina, E., & Waugh, R.E. Neutrophil adhesive contact dependence on impingement force. Biophys. J. 87, 4237-4245 (2004).
  21. Zhu, C. & Williams, T.E. Modeling concurrent binding of multiple molecular species in cell adhesion. Biophys. J. 79, 1850-1857 (2000).
  22. Downey, G.P., et al. Retention of leukocytes in capillaries: role of cell size and deformability. J. Appl. Physiol. 69, 1767-1778 (1990).
  23. Li, P., et al. Affinity and kinetic analysis of Fcgamma receptor IIIa (CD16a) binding to IgG ligands. J. Biol. Chem. 282, 6210-6221 (2007).
  24. Chen, W., Zarnitsyna, V.I., Sarangapani, K.K., Huang, J., & Zhu, C. Measuring Receptor-Ligand Binding Kinetics on Cell Surfaces: From Adhesion Frequency to Thermal Fluctuation Methods. Cell. Mol. Bioeng. 1, 276-288 (2008).
  25. Thoumine, O., Kocian, P., Kottelat, A., & Meister, J.J. Short-term binding of fibroblasts to fibronectin: optical tweezers experiments and probabilistic analysis. Eur. Biophys. J. 29, 398-408 (2000).
  26. Ounkomol, C., Xie, H., Dayton, P.A., & Heinrich, V. Versatile horizontal force probe for mechanical tests on pipette-held cells, particles, and membrane capsules. Biophys. J. 96, 1218-1231 (2009).
  27. Piper, J.W., Swerlick, R.A., & Zhu, C. Determining force dependence of two-dimensional receptor-ligand binding affinity by centrifugation. Biophys. J. 74, 492-513 (1998).
  28. Li, P., Selvaraj, P., & Zhu, C. Analysis of competition binding between soluble and membrane-bound ligands for cell surface receptors. Biophys. J. 77, 3394-3406 (1999).
  29. Long, M., et al. Probabilistic modeling of rosette formation. Biophys. J. 91, 352-363 (2006).
  30. Lou, J., et al. Flow-enhanced adhesion regulated by a selectin interdomain hinge. J. Cell. Biol. 174, 1107-1117 (2006).
  31. Yago, T., Zarnitsyna, V.I., Klopocki, A.G., McEver, R.P., & Zhu, C. Transport governs flow-enhanced cell tethering through L-selectin at threshold shear. Biophys. J. 92, 330-342 (2007).
  32. Evans, E., Berk, D., & Leung, A. Detachment of agglutinin-bonded red blood cells. I. Forces to rupture molecular-point attachments. Biophys. J. 59, 838-848 (1991).
  33. Zarnitsyna, V.I., et al. Memory in receptor-ligand-mediated cell adhesion. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 18037-18042 (2007).

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