Submit
Browse  

The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.

Recommend to Librarian

Automatic Translation

This translation into Hebrew was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Bioengineering

תדירות הדבקה Assay עבור באתרו קינטיקס ניתוח חוצה Junctional אינטראקציות מולקולריות על ממשק Cell-Cell

,

Biomedical Engineering Department, Georgia Institute of Technology

You must be subscribed to JoVE to access this content.

This article is a part of   JoVE Bioengineering. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.

Recommend JoVE to Your Librarian

Current Access Through Your IP Address

You do not have access to any JoVE content through your current IP address.

IP: 67.202.9.192, User IP: 67.202.9.192, User IP Hex: 1137314240

Current Access Through Your Registered Email Address

You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please or create an account with your institutional email address to access this content.

 

Video Article Chapters

Cite this Article: תדירות הדבקה Assay עבור באתרו קינטיקס ניתוח חוצה Junctional אינטראקציות מולקולריות על ממשק Cell-Cell

Zarnitsyna, V. I., Zhu, C. Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface. J. Vis. Exp. (57), e3519, doi:10.3791/3519 (2011).

Abstract: תדירות הדבקה Assay עבור באתרו קינטיקס ניתוח חוצה Junctional אינטראקציות מולקולריות על ממשק Cell-Cell

Assay הידבקות micropipette פותחה בשנת 1998 על מנת למדוד דו ממדי (2D) קולטן ליגנד קינטיקה מחייב 1. Assay משתמשת תא אנושי דם אדומים (RBC) כמו חיישן הידבקות התא הצגת אחד של מולקולות אינטראקציה. היא מעסיקה המיקרומניפולציה להביא את RBC במגע עם תא אחר המבטא את המולקולה אינטראקציה עם אחרים לאזור שבשליטת בדיוק הזמן כדי לאפשר היווצרות הקשר. האירוע הידבקות מזוהה כמו התארכות RBC על משיכת שני תאים בנפרד. על ידי שליטה על צפיפות של ligands משותקת על פני השטח RBC, ההסתברות של הידבקות נשמר בטווח אמצע בין 0 ל -1. ההסתברות הידבקות מוערך של תדירות האירועים הידבקות ברצף מחזורים חוזרים ונשנים ליצור קשר בין שני תאים לזמן קשר נתון. משנים את זמן מגע יוצר עקומת מחייב. התאמת מודל הסתברותי לתגובת קולטן ליגנד קינטיקה 1 ל מחייבעקומת מחזירה את הזיקה 2D and off-קצב.

Assay יאומת באמצעות אינטראקציות של רצפטורים Fcγ עם IgG Fc 1-6, selectins עם ligands glycoconjugate 6-9, 10-13 integrins עם ligands, homotypical cadherin מחייב 14, קולטן T התא coreceptor עם פפטיד הגדולות מתחמי histocompatibility 15 - 19.

בשיטה נעשה שימוש כדי לכמת תקנות קינטיקה 2D ידי גורמים biophysical, כגון הממברנה microtopology 5, קרום עוגן 2, אוריינטציה מולקולרית באורך 6, קשיחות המוביל 9, עקמומיות 20, 20 ו - כוח פגיעה, כמו גם גורמים ביוכימיים, כגון מאפננים של microenvironment cytoskeleton ואת הקרום שבו מולקולות אינטראקציה מתגוררים וארגון פני השטח של המולקולות הללו 15,17,19.

השיטה גם שימש to המחקר מחייב במקביל של קולטן ליגנד מינים כפול 3,4, ואת האינטראקציות trimolecular 19 באמצעות מודל שונה 21.

היתרון העיקרי של השיטה הוא שהיא מאפשרת מחקר של קולטני בסביבת קרום האם שלהם. התוצאות יכול להיות מאוד שונים מאלו שהושגו באמצעות קולטנים מטוהרים 17. זה גם מאפשר לימוד של קולטן ליגנד אינטראקציות זמנים המשנה השני עם רזולוציה הזמני הרבה מעבר שיטות ביוכימיות טיפוסיות.

כדי להמחיש את שיטת הדבקה micropipette תדר, אנו מראים מדידה קינטיקה של מולקולת הדבקה אינטר 1 (ICAM-1) על פונקציונליות RBCs מחייב β integrin L α 2 על נויטרופילים עם dimeric E-selectin בפתרון להפעיל α β L 2.

Protocol: תדירות הדבקה Assay עבור באתרו קינטיקס ניתוח חוצה Junctional אינטראקציות מולקולריות על ממשק Cell-Cell

1. RBCs בידוד מהדם כולו

  1. הכן EAS-45 פתרונות. לשקול את כל המרכיבים של טבלה ואני להמיס 100-200 מ"ל מים DI. מוסיפים מים כדי להפוך פתרון 1000ml ולהתאים את ה-pH 8.0. סינון aliquot על ידי 50 מ"ל. הקפאה ב -20 מעלות צלזיוס לאחסון.

הערה: שלב 1.2 צריכה להתבצע על ידי הכשרה מקצועית כגון רפואי כאחות, עם ראשי סקירה מוסדיים פרוטוקול שאושר.

  1. צייר 3-5 מ"ל של דם מהעורק cubital החציוני לתוך צינור המכיל 10 מ"ל EDTA בעדינות לערבב את הדם עם EDTA מיידי ויסודי כדי למנוע קרישת.
  2. תהליך דגימת דם בהקדם האפשרי. כל הצעדים הבאים, פרט צנטריפוגה צריך להיעשות מתחת למכסה המנוע כדי לשמור על הכנת סטרילית. מעבירים את הדם אל שפופרת 50 מ"ל צנטריפוגה, להוסיף 10 מ"ל של Histopaque קר ועקר 1077 ו צנטריפוגות עבור 5min @ 1000rpm, 4 ° C. חזור פעמיים.
  3. הוסף 10מ"ל קר סטרילי PBS, צנטריפוגה עבור 5min @ 1000rpm, 4 ° C. הסר את supernatant. חזור 4 פעמים (סה"כ 5 פעמים).
  4. לשטוף עם סטרילית EAS-45 (5min @ 1000rpm, 4 ° C) פעמיים. במהלך האחרון RBCs לעבור כביסה לתוך הצינור החדש 15 מ"ל סטרילי.
  5. Resuspend RBCs in10ml EAS-45.

2. RBCs biotinylation

  1. קחו את הצינור עם RBCs משלב 1. הסר את כל supernatant לאחר centrifuging עבור 5min @ 1000rpm, 4 ° C. שים 10μl של RBCs גלולה לכל אחד כמה צלוחיות ולהוסיף סכום המקביל ל PBS בקבוקון אחד (ר 'טבלה II למשל הכנה של שישה ריכוזים שונים RBCs biotinylation).
  2. בצע טרי Biotin-X-NHS/DMF 1:10, 1:100 דילולים על פי טבלה II.
  3. הוסף 10μl של חיץ borate 0.1M על כל בקבוקון.
  4. הוספת כמות מחושבת של פתרון ביוטין כדי בקבוקון אחד (ר 'טבלה II כדוגמה) ו מערבולת מיד.
  5. המקום כל בקבוקון RBCבתוך שפופרת 50 מ"ל חרוטי ו לדגור על הכתף במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. שטפו כל בקבוקון 3 פעמים עם 800μl של EAS-45 עבור 2min @ 2000rpm.
  7. הוסף 100μl של EAS-45 כדי בקבוקון כל החנות ב 4 ° C. ב 1μl כל הפתרון הסופי עכשיו צריך להיות ~ 1mln של RBCs.

3. Functionalizing * ביוטין צמודות ligands על RBCs

  1. הכן פתרון 2mg/ml streptavidin בהתאם להוראות היצרן. פתרון Aliqouted עשוי להיות מאוחסן ב -20 ° C.
  2. לערבב כמות שווה של RBCs משלב 2.7 (10μl) עם פתרון streptavidin, מערבולת מיד לדגור על הכתף במשך 30 דקות ב 4 ° C.
  3. לשטוף 3 פעמים עם 500μl של EAS-45 עבור 2min @ 2000rpm. הוסף 15μl EAS-45 / 1 BSA% לאחסון.
  4. לערבב כמות שווה של RBCs משלב 3.3 (10μl) עם פתרון ליגנד מערבולת 20μg/ml, מיד לדגור על הכתף במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. שטפו פעמיים עם 500μl של EAS-BSA 45 / 1% עבור 2min @ 2000rpm. הוסף 15μl של BSA EAS-45 / 1% לאחסון.

* אם החלבון שלך אין קישור ביוטין אתה יכול להשתמש באחד ערכות זמינים מסחרית עבור biotinylation חלבון (לדוגמא, Thermo Scientific # 21955 EZ-Link Micro-NHS PEG4-Biotinylation Kit) או להשתמש נוגדנים לכידת biotinylated כצעד ביניים, כפי שמוצג בסרטון.

4. כימות צפיפות הקולטן ליגנד

  1. דגירה ליגנד מצופה RBCs משלב 3 ו, שונה, בקבוקון קולטן נושאות תאים עם ריכוזים להרוות של מבז בהתאמה עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר. דגירה בתאים נפרדים צלוחיות עם אלוטיפ בהתאמה נוגדנים רלוונטי עבור שליטה. אם נוגדנים העיקרית אינם שכותרתו fluorescently, דגירה עם נוגדנים משני fluorescently-מצומדות בהתאם להוראות היצרן.
  2. ניתוח דגימות מוכן בשלב 4.1 ידי cytometery לזרום עם המקביל פלורסנט calibration חרוזים. חשב את צפיפות כפי שמוצג באיור. 1.

5. הכנה micropipette קאמרית תא

  1. משוך micropipettes משפופרות נימי באמצעות PN-30 microelectrode מגנטי "Narishige פולר זכוכית אופקי או סאטר מכשירים micropipette פולר.
  2. השתמש micromanipulator עם microforge להתאים את קצה micropipette משך לגודל הרצוי (בדרך כלל בקוטר הנדרש נע בין 1-5μm בהתאם לגודל של התאים לשמש במחקר).
  3. הכינו את חדר התא על ידי חיתוך כיסוי זכוכית מיקרוסקופ לגודל הרצוי. חותם את החדר באמצעות שמן מינרלי משני הצדדים כדי למנוע אידוי בינוני לשנות את osmolarity במהלך הניסוי.
  4. הוסף את התאים קולטן ו ליגנד נושאות לחדר.

6. תדירות micropipette הידבקות assay

  1. לשאוב את התאים על ידי אינטראקציה pipettes בהתאמה להשתמש במחשב מתוכנתים piezoelectr מתרגם IC לכונן RBC פנימה והחוצה של מגע עם התא השני עם שטח מגע זמן מבוקר. זיהוי אירועים הידבקות על ידי התבוננות התארכות RBC על ההפרדה התא.
  2. חזור על מחזור מגע-נסיגת 5-10 פעמים במשך זמן קשר נתון. שיא אירועי הידבקות נצפתה על ידי הוספת "1" עבור הידבקות או "0" עבור הידבקות לא בטור של הגיליון האלקטרוני Excel. ניתן להשתמש במכשיר הקלטה, למשל, מדיה דיגיטלית או וידיאו, על תמונות מיקרוסקופיות.
  3. הקלט את תדירות ההידבקות לעומת הזמן לפנות באמצעות עקומת לפחות שלושה זוגות תאים שונים עבור כל פעם לפנות לקבל מתכוון SEM.
  4. הקלט את עקומת מחייב ספציפי על השליטה באמצעות RBCs מצופה ligands רלוונטי (למשל BSA) ו / או חסימת הקולטנים ligands או באמצעות מבז הספציפיים שלהם המצור תפקודית. תדירות הדבקה ספציפיות בכל נקודת זמן קשר ניתן לחשב על ידי הסרת תדירות הדבקה ספציפי 1.
ove_title "> 7. ניתוח נתונים

  1. התאם את תדירות הדבקה ספציפיות P לעומת הזמן לפנות לא נתונים על ידי מודל הסתברותי (משוואה 1) המתאר את סדר השנייה קדימה מסדר ראשון, להפוך בשלב יחיד האינטראקציה בין מין אחד של קולטנים זן יחיד של ligands 1 :
    משוואה 1
    היכן K היא זיקה 2D מחייב יעיל, את k הוא מחוץ שיעור, מ r ו-m l הם הקולטן בהתאמה וצפיפות ליגנד נמדד בשלב 4, ו-c הוא שטח המגע. עקומת להתאמה יש שני פרמטרים, K c ו - k מעל, כמו C ו-K הם מגובבים יחדיו וקרא קולקטיבי זיקה 2D יעיל. המוצרים שלה עם קצב-off הוא יעיל ב-2D קצב: c = k על k ג K x משם.
    תדר ספציפי הידבקות P מחושב על ידי חיסור של שבר את הידבקות ספציפי (P ספציפי) של הידבקות הנמדד הכולל (P נמדד) 1,21:
    משוואה 2

8. נציג תוצאות:

איור 1
איור 1 קביעת β integrin L α 2 צפיפות באתר נויטרופילים. נויטרופילים הודגרו הראשון עם 1μg/ml של E-selectin-איג עבור 10min כדי להתאים את תנאי הניסוי השתמשו במספרים 3,4 או בלי E-selectin-איג, ולאחר מכן עם ריכוזים להרוות (10μg/ml) נגד PE-מצומדות אנושי CD11a מב (Clone HI111, ראו טבלה של ספציפיריאגנטים וציוד) או IgG1 עכבר רלוונטית שליטה, שטף, וניתח באופן מיידי. דוגמאות נקראו על cytometer LSR לזרום עם תקן BD חרוזים QuantiBRITE PE כיול. לוח מופעים היסטוגרמות הקרינה של חרוזים כיול (ורוד) יחד עם אלו של E-selectin-איג תאים שטופלו (צבע כחול) או מטופל (צבע ירוק). ספציפית מכתים CD11a MAB מוצג עקומות מוצק נוגדן רלוונטי אלוטיפ בהתאמה מכתים לשלוט מוצג עקומות מנוקד. תאים שטופלו ב-E-selectin איג (נוכחות בכל הצעדים כביסה במאגר FACS) לא השפיע על צפיפות CD11a כפי שנראה מן ההשוואה עם בתאים שלא טופלו. לוח ב 'מראה את תהליך כימות צפיפות. LOG10 חושבה על עוצמת פלורסנט אומר (FI) של כל ערך לשיא של ארבעה היסטוגרמות כיול חרוז מלוח (עיגולים ורוד) ובמשך הרבה מולקולות ספציפיות PE לכל חרוז (מהיצרן). רגרסיה ליניארית של LOG10 מולקולות PE לכל חרוז נגד LOG10 fluorescence היה זממו. עבור E-selectin תאים התייחסו FI LOG10 (y) ערכים שווים 3.99 (עיגול כחול מוצק) ו 2.23 (מעגל פתוח כחול) עבור MAB נוגדנים ספציפיים שליטה, respectivly. אנו לפתור את המשוואה עבור x ליניארי (הערכים הם זממו כעיגולים ירוק וכחול על לוח B) x = LOG10 PE / התא, כמו PE:. יחס MAB היה 01:01, המספר הכולל של β α L 2 על נויטרופילים היה מחושב 9587. צפיפות פני השטח היה מחושב להיות 43 מולקולות / 2 מיקרומטר, באמצעות 8.4μm כפי בקוטר 22 נויטרופילים. צפיפות של ICAM-1 נמדד באופן דומה על ידי cytometery זרימה באמצעות PE-אנטי אנושי CD54 MAB, אשר שווה 65 mol / 2 מיקרומטר.

איור 2
איור 2 micropipette שרטוטים המערכת. מערכת micropipette שלנו התאספו הבית מורכב משלושה תת: המשנה הדמיה כדי לאפשר אחת להתבונן, record ולנתח תנועות של התא micropipette-aspirated; המשנה המיקרומניפולציה לאפשר אחד בחר את התאים מתא לתא, לבין המשנה הלחץ כדי לאפשר אחד לשאוב את התאים לתוך micropipettes. היצירה המרכזית של המשנה הדמיה היא הפוכה מיקרוסקופ (אולימפוס IMT-2 IMT2) עם מטרה 100x טבילה שמן NA 1.25. התמונה נשלחת טייפ קלטת וידאו באמצעות מכשיר חיוב בני הזוג (CCD) המצלמה. טיימר וידאו מצמידים למערכת כדי לעקוב אחר פעם. כל micropipette ניתן להשפיע על ידי כונן מכני רכוב על המיקרוסקופ וממוקמים היטב עם micromanipulator שלוש ציר הידראולי. המניפולטורים מכונות מניופורט יכול לשמש גם כן. אחד מבעלי micropipette הוא רכוב על מתרגם פיזואלקטריים, הנהג של שבשליטת LabVIEW קוד מחשב (זמין על פי דרישה) ואת מתרגמת אותות דרך לוח DAQ דרך מגבר מתח (תוצרת בית) ל מפעיל piezo. זהllows אחד כדי להעביר את פיפטה במדויק repeatably במחזור בדיקת הידבקות. המשנה הסדרת הלחץ משמש לשליטה יניקה במהלך הניסוי. קו מחבר הידראולי בעל micropipette למאגר נוזלים. Positioner מכני מצוין מאפשר את הגובה של המאגר כדי לטפל בדיוק.

Micropipettes נוצרות באמצעות נקודת התכה KIMAX בורוסיליקט צינורות זכוכית נימי (בקוטר החיצוני של 1.0 ± 0.07 מ"מ קוטר פנימי של 0.7 ± 0.07 מ"מ. ראשית, micropipettes משפופרות נימי נמשכים באמצעות PN-30 microelectrode מגנטי "Narishige פולר זכוכית אופקי (סאטר מכשירים micropipette פולר הוא עוד אפשרות חולץ). מערכת שנית, Microforge (נבנה בבית) משמש כדי לחתוך את micropipettes לפתיחת הגודל הרצוי. הדגמים מסחרי של מערכות Microforge זמינים גם כן.

כדי למנוע רעידות של micropipettes במהלך הניסוי, microscאופ, יחד עם micromanipulators, הוא הניח על השולחן מתלי אוויר.

איור 3
איור 3 הפעלת תדר F הידבקות i עבור ספציפי (א) ולא ספציפי (ב) מחייב את 1s (אדום) 10s (כחול) פעמים חוזרות ונשנות של הקשר נמדדת במבחן מחזורי הדבקה בין RBCs מצופה ICAM-1 (א) או hIgG (B ) עם נויטרופילים אדם להביע integrin α β L 2. i = F (X 1 + X 2 + ... + X i) / i (1 ≤ i ≤ n), כאשר אני הוא המדד מחזור הבדיקה, X אני שווה "1" (הדבקה) או "0" (לא הדבקה). F n (n = 50) שימש האומדן הטוב ביותר עבור הסתברות הדבקה.

איור 4
איור 4 קינטיקה שלICAM-1 מחייב β נויטרופילים integrin L α 2 ( מרובע ). הסתברות הדבקה נמדד כפי שמוצג באיור 3 עבור שלושה זוגות התא בזמן כל קשר הוא בממוצע ו זממו לעומת זמן מגע. החדר היה בינוני עם HBSS 1mm כל Ca 2 + ו - Mg 2 + פלוס 1μg/ml של dimeric E-selectin-איג אל upregulate β α L 2 מחייב. כדי ללכוד ICAM-1-איג על RBCs, צעד ביניים נוסף דגירה RBCs עם נוגדן ללכוד 10μg/ml (biotinylated עזים אנטי אנושי נוגדנים Fc, eBioscience) לאחר שלב הדגירה streptavidin. כדי לשלוט על ספציפי שני תנאים מחייבים שונים שימשו: 1) RBCs מצופה נוגדן אנטי אנושי Fc ללכוד מודגרות עם לנוגדנים אנושיים במקום ICAM-1-איג (O) ו 2) נויטרופילים מחייב RBCs לא מצופה ללכוד נוגדנים (Δ). 10μg/ml לנוגדנים אנושיים נוספה המדיום כדי למזער את הכריכה של ה-Selectin-איג בתמיסה כדי ללכוד הנוגדן על פני השטח RBC. מחייב ספציפי כפי שנרשמו עקומת האדם לשלוט IgG שימש לקבל עקומת הסתברות הדבקה ספציפיות ( מרובע ) באמצעות Eq. 2. התאמת ההסתברות ספציפי הדבקה עקומה עם Eq. 1 (קו מוצק) חזר זיקה מחייבת יעיל K c = 1.4 • 10 μm4 -4 ו k את = 0.3 s -1.

מגיב MW (g / mol) ריכוז (מ"מ) סכום (ז)
אדנין 135.13 2 0.27
D-גלוקוז (דקסטרוז) 180.16 110 19.82
D-Mannitol 182.17 55 10.02
נתרן כלוריד (NaCl) 58.44 50 2.92
פוספט נתרן, Dibasic (Na HPO ) 141.95 20 2.84
L-גלוטמין 146.15 10 1.46

1. טבלת הכנה EAS-45 חיץ (1 ליטר).

25 מ"ג ביוטין-XHS ב 550 μl של DMF 0.1M פתרון ביוטין
דילול 1:10 של ביוטין 0.1 W / DMF 0.01M פתרון ביוטין
1:100 דילול של ביוטין 0.1 W / DMF 0.001M פתרון ביוטין

טבלה 2. הכנת הפתרון ביוטין.

ביוטין הריכוז הסופי (מיקרומטר) 4 10 20 50 100 160
RBCs גלולה מניות (μl) 10 10 10 10 10 10
1x PBS (μl) 179.2 178 176 179 178 176.8
0.1M borate חיץ (μl) 10 10 10 10 10 10
0.01M ביוטין פתרון (μl) 1 2 3.2
0.001M ביוטין פתרון (μl) 0.8 2 4

לוח 3. Biotinylation של RBCs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion: תדירות הדבקה Assay עבור באתרו קינטיקס ניתוח חוצה Junctional אינטראקציות מולקולריות על ממשק Cell-Cell

כדי להשתמש בהצלחה את הידבקות micropipette תדירות assay אחד צריך לשקול צעדים קריטיים מספר. ראשית, ודא כדי להקליט את האינטראקציה ספציפי למערכת קולטן ליגנד של עניין. מדידות בקרה ספציפי (ראה איור. 3, 4) להבטיח את הספציפיות. באופן אידיאלי, הסתברויות הדבקה ספציפי צריך להיות מתחת 0.05 עבור כל משך זמן המגע יש הבדל משמעותי בין ההסתברויות הדבקה ספציפיות ספציפי לכל נקודת זמן. שיטות שונות יכול לשמש כדי הזוג ligands אל פני השטח RBCs. זה היה הראו כי כלוריד כרום צימוד שיטה 17 נתן רמה גבוהה יותר של הכריכה ספציפי מאשר צימוד ביוטין-streptavidin.

שנית, הסתברות הדבקה לאינטראקציה ספציפי צריך להיות בטווח הבינוני. דרישה זו עלולה להיות נפגשו על ידי שינוי צפיפות של קולטנים ligands (או ligands רק על RBCs אם רצפטורים מבוטאים על התא constitutivelyשל צפיפות שקשה לשנות). לענין זה, כאשר בדיקות מערכת חדשה עם זיקה קולטן ליגנד ידוע מחייב, להכין מגוון של RBCs biotinylated (ראו טבלה III כדוגמה) כדי לבחון מגוון של צפיפויות ליגנד. ההסתברות היציב הדבקה צריך להיות לא יותר מ 0.8 בממוצע כמו תא אל תא קולטן וריאציה צפיפות בדרך כלל מביא את רמת ההדבקה של תאים מסוימים 1 אם הצפיפות ליגנד הממוצע הוא גבוה מדי. במהלך הבדיקה הראשונית הספציפיות, אם תאים מסוימים יש רמות ההידבקות של 0 או 1, צפיפות ליגנד צריך להיות מותאם. מדידות בקרה ספציפי בדרך כלל לעקוב אחר מדידות ספציפיות פה אחד היה רוצה שיהיה לי סיכוי הידבקות קרוב לאפס ככל האפשר.

שלישית, למצוא את הטווח הנכון עבור פעמים קשר. אם הזמן הוא קשר ארוך מספיק exp (- k את t) ​​טווח Eq. 1 הולכת לאפס את הזיקה 2D יעיל ניתן לחשב מרמת הרמהעקומת הידבקות 1:
משוואה 3
את שער k את קובעת את שלב המעבר או כמה מהר את עקומת הידבקות מגיע לרמה הרמה. כדי להעריך את שיעור מדויק דורש מדידות של מספר נקודות ברמה הרמה, כמו גם נקודות זמן מספיק בשלב המעבר. חשבונאות עבור שלושת השלבים הקריטיים המתוארים לעיל אחד לא מחייב להשיג עקומות דומה איור. 4.

המשימה שנותרה היא להשתמש קולטן ליגנד מחייב מודל קינטיקה לפרש את עקומת מחייב למדוד באופן ניסיוני כדי להעריך פרמטרים קינטיים 2D מבית הולם את התחזית המודל לנתונים. יצוין כי Eq. 1 מייצג המודל הפשוט ביותר של הסדר השני קדימה, מסדר ראשון, להפוך בשלב יחיד, קינטיקה הפיך בין קולטן ליגנד מין יחיד 1. תהליכים מורכבים יותר הקינטית תוארו, כולל הדואר מקרים של קולטן ליגנד מינים כפול 3,4, שני שלבים מחייב בלי 14 או 19 עם אינטראקציות trimolecular ו קינטיקה הידבקות מוגבלת על ידי מבנה האתר הפעיל במקום האג"ח קינטיקה 10. במקרים אלה, מודלים מתמטיים מעורב יותר נדרשים להתייחס ההסתברות הדבקה לעומת הזמן לפנות את עקומת קולטן ליגנד קינטיקה מחייב.

האינטרס מתמשכת של קינטיקה של אינטראקציה קולטן ליגנד נובעת ההשערה הבסיסית פרמטרים קינטיקה לשחק תפקיד בקביעת אירועים איתות הזרם בתוך התא. תדירות הדבקה micropipette assay המובא כאן באחת השיטות מעטים המאפשרים במדידות באתרו של דו ממדי (2D) קינטיקה מחייב. דו מימדי כלומר הן קולטנים ligands הם על משטחי תאים, באופן טבעי מתרחשת בתא תאים אינטראקציות רבות בתוך האורגניזם. שיעור קבועים 2D הקינטית של lig קולטןמחייב לספק מידע כיצד במהירות תאים נקשרים אחד לשני או המטריצה ​​תאיים, כמה זמן הם נשארים קשורים, ואיך אג"ח רבות יהוו. לשם השוואה, בשנת שיטת plasmon השטח (SPR) תהודה 23 אחד מולקולות אינטראקציה היא בשלב נוזלים, ולכן נקרא תלת ממדי (3D) מחייב. מכיוון שגם מולקולות אינטראקציה הם מטוהרים מבודד מהסביבה הסלולר, את הפרמטרים הקינטית שהושגו מדידה 3D יכולים להיות שונים באופן דרסטי מאלה שהושגו במדידות 2D אפילו צמד קולטן ליגנד זהה 17.

שיטת תדירות הדבקה מנתח קינטיקה 2D לחיות קרום התא, ובכך מספקת הזדמנות עבור אחד כדי לנתח את תקנות biophysical וביוכימיות של הסביבה התאית. אלה כוללים את קרום microtopology 5, עוגן קרום 2, אוריינטציה מולקולרית באורך 6, קשיחות המוביל 9 ו curvature 20, פגיעה בכוח 20, מאפננים של cytoskeleton וארגון הממברנה שבו מולקולות אינטראקציה מתגוררים 15,17.

מכיוון צולבות junctional קולטן ליגנד האינטראקציה דורשת מגע פיזי ישיר בין שני תאים ותוצאות הצמדה פיזית בין שני תאים, תגובה כימית קינטיקה של אינטראקציה מולקולרית ניתן לנתח על ידי assay מכני זה מעמיד את התאים קשר מחייב מזהה על ידי אפקט בכוח. למרות שאנו שהודגם תדירות הדבקה assay באמצעות micropipette-RBC aspirated כמו חיישן הידבקות, טכניקות כוח אחרים יכולים לשמש, כולל מיקרוסקופ כוח אטומי 24, כוח biomembrane בדיקה 8,17, פינצטה אופטית 25, ואת micropipette משולב שלוחה 26.

אחרים מבחני 2D מכנית מבוסס פותחו. אלה כוללים את assay תנודה תרמית 8, centrifugation assay 27,28, rosetting assay 29, ו - תא זרימה assay 30,31.

המגבלה של assay תדירות ההידבקות הוא הטבע איטית ועבודה אינטנסיבית של assay בשל מחזורי סדרתי חזר עם זוג אחד של תאים נבדק קשר אחד בכל פעם. זה הופך להיות קשה עבור קולטן ליגנד אינטראקציות עם off-שיעורי איטי בגלל פעמים לפנות זמן יידרש עבור עקומת מחייב להגיע היציב, ביצוע הניסוי ארוך inhibitively.

מתמר כוח נבנה על ידי RBC micropipette-aspirated מסוגל לאיתור piconewton ברמה כוחות, שהוא בסדר גודל נמוך יותר כוח הטיפוסי של קשר קולטן ליגנד noncovalent 1,32. עם זאת, קולטן ליגנד דיסוציאציה יכולה להתרחש גם באפס כוחות. כל הידבקות חלש שעובר מוביל מבלי שיבחינו כדי הערכה נמוכה מדי של הזיקה מחייב על שער 1.

Tהוא תדר שיטת הדבקה מניח כי כל מבחן הידבקות זהה ועצמאית מהאחרים. דרישה זו יכולה להיות הפרה כפי שראינו כמה מערכות 33, שם הדבקה הנוכחי להגדיל או להקטין את ההסתברות של הידבקות הבא. קוד Matlab לבדיקת אם הדרישה היא נפגשו רשמה רצף של אירועים הידבקות זמין לפי בקשה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures: תדירות הדבקה Assay עבור באתרו קינטיקס ניתוח חוצה Junctional אינטראקציות מולקולריות על ממשק Cell-Cell

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Acknowledgements: תדירות הדבקה Assay עבור באתרו קינטיקס ניתוח חוצה Junctional אינטראקציות מולקולריות על ממשק Cell-Cell

מחקר זה נתמך על ידי NIH מענקים R01HL091020, R01HL093723, R01AI077343 ו R01GM096187.

Materials: תדירות הדבקה Assay עבור באתרו קינטיקס ניתוח חוצה Junctional אינטראקציות מולקולריות על ממשק Cell-Cell

Name Company Catalog Number Comments
10x PBS BioWhittaker

17-517Q

 Dilute to 1x with deionized water prior to use
Vacutainer EDTA BD Biosciences 366643 RBCs isolation
10ML PK100
Histopaque 1077 Sigma-Aldrich 10771 RBCs isolation
Adenine Sigma-Aldrich A2786 EAS-45 preparation
D-glucose (dextrose) Sigma-Aldrich G7528 EAS-45 preparation
D-Mannitol Sigma-Aldrich 6360 EAS-45 preparation
Sodium Chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S7653 EAS-45 preparation
Sodium Phosphate, Dibasic (Na₂HPO₄) Fisher Scientific S374 EAS-45 preparation
L-glutamine Sigma-Aldrich G5763 EAS-45 preparation
Biotin-X-NHS Calbiochem 203188 RBCs biotinylation
Dimethylformamide (DMF) Thermo Fisher Scientific, Inc. 20673 RBCs biotinylation
Borate Buffer (0.1M) Electron Microscopy Sciences 11455-90 RBCs biotinylation
Streptavidin Thermo Fisher Scientific, Inc. 21125 Ligand functionalizing
BSA Sigma-Aldrich A0336 Ligand functionalizing
Quantibrite PE Beads BD Biosciences 340495 Density quantification
Flow cytometer BD Biosciences

BD LSR II

 Density quantification

Capillary Tube

0.7-1.0mm x 30"		 Kimble Chase 46485-1 Micropipette pulling
Mineral Oil Fisher Scientific BP2629-1 Chamber assembly
Microscope Cover Glass Fisher Scientific 12-544-G Chamber assembly

PE α-human CD11a

Clone HI 111 		eBioscience 12-0119-71 Reagent for Fig.1
PE anti-human CD54 eBioscience 12-0549 Reagent for Fig.1
Mouse IgG1 Isotype Control PE eBioscience 12-4714 Reagent for Fig.1
hydraulic micromanipulator Narishige International MO-303 Micropipette system
Mechanical manipulator Newport Corp. 461-xyz-m, SM-13, DM-13 Micropipette system
piez–lectric translator Physik Instruments P-840 Micropipette system
LabVIEW National Instruments Version 8.6 Micropipette system
DAQ board National Instruments USB-6008 Micropipette system
Optical table Kinetic Systems 5200 Series Micropipette system

References: תדירות הדבקה Assay עבור באתרו קינטיקס ניתוח חוצה Junctional אינטראקציות מולקולריות על ממשק Cell-Cell

  1. Chesla, S.E., Selvaraj, P., & Zhu, C. Measuring two-dimensional receptor-ligand binding kinetics by micropipette. Biophys. J. 75, 1553-1572 (1998).
  2. Chesla, S.E., Li, P., Nagarajan, S., Selvaraj, P., & Zhu, C. The membrane anchor influences ligand binding two-dimensional kinetic rates and three-dimensional affinity of FcgammaRIII (CD16). J. Biol. Chem. 275, 10235-10246 (2000).
  3. Williams, T.E., Nagarajan, S., Selvaraj, P., & Zhu, C. Concurrent and independent binding of Fcgamma receptors IIa and IIIb to surface-bound IgG. Biophys. J. 79, 1867-1875 (2000).
  4. Williams, T.E., Selvaraj, P., & Zhu, C. Concurrent binding to multiple ligands: kinetic rates of CD16b for membrane-bound IgG1 and IgG2. Biophys. J. 79, 1858-1866 (2000).
  5. Williams, T.E., Nagarajan, S., Selvaraj, P., & Zhu, C. Quantifying the impact of membrane microtopology on effective two-dimensional affinity. J. Biol. Chem. 276, 13283-13288 (2001).
  6. Huang, J., et al. Quantifying the effects of molecular orientation and length on two-dimensional receptor-ligand binding kinetics. J. Biol. Chem. 279, 44915-44923 (2004).
  7. Long, M., Zhao, H., Huang, K.S., & Zhu, C. Kinetic measurements of cell surface E-selectin/carbohydrate ligand interactions. Ann. Biomed. Eng. 29, 935-946 (2001).
  8. Chen, W., Evans, E.A., McEver, R.P., & Zhu, C. Monitoring receptor-ligand interactions between surfaces by thermal fluctuations. Biophys. J. 94, 694-701 (2008).
  9. Wu, L., et al. Impact of carrier stiffness and microtopology on two-dimensional kinetics of P-selectin and P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1) interactions. J. Biol. Chem. 282, 9846-9854 (2007).
  10. Waugh, R.E. & Lomakina, E.B. Active site formation, not bond kinetics, limits adhesion rate between human neutrophils and immobilized vascular cell adhesion molecule 1. Biophys. J. 96, 268-275 (2009).
  11. Zhang, F., et al. Two-dimensional kinetics regulation of alphaLbeta2-ICAM-1 interaction by conformational changes of the alphaL-inserted domain. J. Biol. Chem. 280, 42207-42218 (2005).
  12. Lomakina, E.B. & Waugh, R.E. Adhesion between human neutrophils and immobilized endothelial ligand vascular cell adhesion molecule 1: divalent ion effects. Biophys. J. 96, 276-284 (2009).
  13. Chen, W., Lou, J., & Zhu, C. Forcing switch from short- to intermediate- and long-lived states of the alphaA domain generates LFA-1/ICAM-1 catch bonds. J. Biol. Chem. 285, 35967-35978 (2010).
  14. Chien, Y.H., et al. Two stage cadherin kinetics require multiple extracellular domains but not the cytoplasmic region. J. Biol. Chem. 283, 1848-1856 (2008).
  15. Huang, J., Edwards, L.J., Evavold, B.D., & Zhu, C. Kinetics of MHC-CD8 interaction at the T cell membrane. J. Immunol. 179, 7653-7662 (2007).
  16. Wasserman, H.A., et al. MHC variant peptide-mediated anergy of encephalitogenic T cells requires SHP-1. J. Immunol. 181, 6843-6849 (2008).
  17. Huang, J., et al. The kinetics of two-dimensional TCR and pMHC interactions determine T-cell responsiveness. Nature. 464, 932-936(2010).
  18. Sabatino, J.J., Jr., Huang, J., Zhu, C., & Evavold, B.D. High prevalence of low affinity peptide-MHC II tetramer-negative effectors during polyclonal CD4+ T cell responses. J. Exp. Med. 208, 81-90 (2011).
  19. Jiang, N., et al. Two-stage cooperative T cell receptor-peptide major histocompatibility complex-CD8 trimolecular interactions amplify antigen discrimination. Immunity. 34, 13-23 (2011).
  20. Spillmann, C.M., Lomakina, E., & Waugh, R.E. Neutrophil adhesive contact dependence on impingement force. Biophys. J. 87, 4237-4245 (2004).
  21. Zhu, C. & Williams, T.E. Modeling concurrent binding of multiple molecular species in cell adhesion. Biophys. J. 79, 1850-1857 (2000).
  22. Downey, G.P., et al. Retention of leukocytes in capillaries: role of cell size and deformability. J. Appl. Physiol. 69, 1767-1778 (1990).
  23. Li, P., et al. Affinity and kinetic analysis of Fcgamma receptor IIIa (CD16a) binding to IgG ligands. J. Biol. Chem. 282, 6210-6221 (2007).
  24. Chen, W., Zarnitsyna, V.I., Sarangapani, K.K., Huang, J., & Zhu, C. Measuring Receptor-Ligand Binding Kinetics on Cell Surfaces: From Adhesion Frequency to Thermal Fluctuation Methods. Cell. Mol. Bioeng. 1, 276-288 (2008).
  25. Thoumine, O., Kocian, P., Kottelat, A., & Meister, J.J. Short-term binding of fibroblasts to fibronectin: optical tweezers experiments and probabilistic analysis. Eur. Biophys. J. 29, 398-408 (2000).
  26. Ounkomol, C., Xie, H., Dayton, P.A., & Heinrich, V. Versatile horizontal force probe for mechanical tests on pipette-held cells, particles, and membrane capsules. Biophys. J. 96, 1218-1231 (2009).
  27. Piper, J.W., Swerlick, R.A., & Zhu, C. Determining force dependence of two-dimensional receptor-ligand binding affinity by centrifugation. Biophys. J. 74, 492-513 (1998).
  28. Li, P., Selvaraj, P., & Zhu, C. Analysis of competition binding between soluble and membrane-bound ligands for cell surface receptors. Biophys. J. 77, 3394-3406 (1999).
  29. Long, M., et al. Probabilistic modeling of rosette formation. Biophys. J. 91, 352-363 (2006).
  30. Lou, J., et al. Flow-enhanced adhesion regulated by a selectin interdomain hinge. J. Cell. Biol. 174, 1107-1117 (2006).
  31. Yago, T., Zarnitsyna, V.I., Klopocki, A.G., McEver, R.P., & Zhu, C. Transport governs flow-enhanced cell tethering through L-selectin at threshold shear. Biophys. J. 92, 330-342 (2007).
  32. Evans, E., Berk, D., & Leung, A. Detachment of agglutinin-bonded red blood cells. I. Forces to rupture molecular-point attachments. Biophys. J. 59, 838-848 (1991).
  33. Zarnitsyna, V.I., et al. Memory in receptor-ligand-mediated cell adhesion. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 18037-18042 (2007).

Ask the Author: תדירות הדבקה Assay עבור באתרו קינטיקס ניתוח חוצה Junctional אינטראקציות מולקולריות על ממשק Cell-Cell

0 Comments

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Waiting
simple hit counter