Hechting Frequency Assay voor In Situ Kinetiek Analyse van de Cross-junctionele moleculaire interacties in de cel-cel-interface

1. RBC isolatie van de volbloed

1. Bereid EAS-45 oplossingen. Afweging van alle ingrediënten uit Tabel I en los op in 100-200ml van DI water. Voeg water toe om 1000ml oplossing te maken en de pH aan te passen aan 8,0. Filter en aliquot van 50ml. Invriezen bij -20 ° C voor opslag.

Opmerking: Stap 1.2 moet worden uitgevoerd door een opgeleide medische professional, zoals een verpleegkundige, met een Institutional Review Board goedgekeurde protocol.

2. Teken 3-5ml van bloed uit de mediaan cubitaal ader in een 10ml tube met EDTA en voorzichtig mengen onmiddellijk het bloed met EDTA en grondig om te voorkomen dat stolling.
3. Proces bloedmonster zo spoedig mogelijk. Al de volgende stappen, behalve centrifugeren moet worden gedaan onder de motorkap te houden de voorbereiding steriel. Overdracht van het bloed om een ​​50 ml centrifugebuis, voeg 10 ml koud en steriel Histopaque 1077 en centrifugeer 5 min @ 1000 tpm, 4 ° C. Tweemaal herhalen.
4. Voeg 10ml koud en steriel PBS, centrifuge voor 5min @ 1000 tpm, 4 ° C. Verwijder het supernatant. Herhaal dit vier maal (totaal 5 keer).
5. Wassen met steriele EAS-45 (5min @ 1000 tpm, 4 ° C) twee keer. Tijdens de laatste wassen zet RBC naar een nieuwe steriele 15 ml buis.
6. Resuspendeer RBC in10ml EAS-45.

2. RBC biotinylatie

1. Neem de tube met RBC vanaf stap 1. Verwijder alle supernatant na centrifugeren voor 5min @ 1000 tpm, 4 ° C. Doe 10μl van RBC pellet aan elk van de verschillende flesjes en voeg overeenkomstige hoeveelheid PBS aan elke injectieflacon (zie tabel II van bijvoorbeeld de voorbereiding van zes verschillende RBC biotinylering concentraties).
2. Het maken van verse Biotin-X-NHS/DMF 1:10, 1:100 verdunningen volgens tabel II.
3. Voeg 10μl van 0,1 M boraatbuffer aan elke flacon.
4. Voeg berekende hoeveelheid biotine oplossing voor elke flacon (zie tabel II als voorbeeld) en vortex onmiddellijk.
5. Plaats elke RBC flaconin een 50 ml conische buis en incubeer op rotator voor 30 minuten bij kamertemperatuur.
6. Was elke flacon 3 keer met 800μl van EAS-45 voor 2min @ 2000 tpm.
7. Voeg 100μl van EAS-45 aan elk flesje en bewaar bij 4 ° C. In elk 1μl van de uiteindelijke oplossing nu moet worden ~ 1mln van RBC.

3. Functionaliseren de biotine-linked liganden * op RBC

1. Bereid 2mg/ml streptavidine oplossing volgens instructies van de fabrikant. Aliqouted oplossing kan worden bewaard bij -20 ° C.
2. Meng een gelijke hoeveelheid van RBC uit stap 2.7 (10μl) met streptavidine-oplossing, vortex onmiddellijk op rotator voor 30 minuten incuberen bij 4 ° C.
3. Was drie keer met 500μl van EAS-45 voor 2min @ 2000 tpm. Voeg 15μl EAS-45 / 1% BSA voor opslag.
4. Meng gelijke hoeveelheid van RBC uit stap 3.3 (10μl) met een 20μg/ml ligand-oplossing, vortex onmiddellijk en incubeer op rotator voor 30 minuten bij kamertemperatuur.
5. Was twee keer met 500μl van EAS-45 / 1% BSA voor 2min @ 2000 tpm. Voeg 15μl van EAS-45 / 1% BSA voor opslag.

* Als uw eiwit heeft geen biotine link kunt u gebruik maken van een van de commercieel verkrijgbare kits voor eiwit biotinylatie (bijvoorbeeld, Thermo Scientific # 21955 EZ-Link Micro NHS-PEG4-biotinylatie Kit) of het gebruik gebiotinyleerde het vastleggen van antilichamen als een tussenstap zoals getoond in de video.

4. Kwantificering van de receptor en ligand dichtheden

1. Incubeer ligand-coated RBC uit stap 3 en, in een ander flesje, receptor-dragende cellen met verzadigende concentraties van de respectieve mAbs voor 30min bij kamertemperatuur. Incubeer in afzonderlijke flacons cellen met irrelevante isotype-gematchte antilichamen voor controle. Als de primaire antilichamen worden niet fluorescent gelabelde, incubeer met fluorescent-geconjugeerde secundaire antilichamen volgens de instructies van de fabrikant.
2. Analyseren van monsters bereid in stap 4.1 met flow cytometery met bijbehorende TL-calibration kralen. Bereken de dichtheden zoals getoond in Fig. 1.

5. Voorbereiding voor micropipet en cel kamer

1. Trek micropipetten uit capillaire buizen met behulp van PN-30 Magnetic Glass Narishige 'micro-elektrode Horizontale Puller of Sutter Instrumenten Micropipet Puller.
2. Gebruik micromanipulator met microforge aan het uiteinde van de getrokken micropipet aan te passen aan een gewenste grootte (meestal de gewenste diameter varieert van 1-5 urn afhankelijk van de grootte van de cellen om gebruikt te worden in de studie).
3. Bereid de cel kamer door te snijden microscoop Dekglas tot het gewenste formaat. Afdichting van de kamer gebruik van minerale olie aan beide kanten tot middelgrote verdamping te voorkomen om de osmolariteit veranderen tijdens het experiment.
4. Voeg de receptor-en ligand-dragende cellen naar de kamer.

6. Micropipet hechting frequentie test

1. Aspireren van de interactie cellen door respectieve pipetten en gebruiken de computer geprogrammeerde piezoelectr ic vertaler van de RBC in-en uitrijden van het contact met de andere cel met gecontroleerde contactoppervlak en tijd. Detect hechting gebeurtenissen door het observeren van RBC rek bij de cel scheiding.
2. Herhaal de contact-retractie cyclus 50-100 keer voor een bepaalde tijd contact. Noteer de waargenomen hechting gebeurtenissen door het toevoegen van "1" voor hechting of "0" voor geen hechting in een kolom van Excel-spreadsheet. U kunt gebruik maken van een opname-apparaat, bijvoorbeeld, digitale media of videoband, voor de microscopische beelden.
3. Noteer de hechting frequentie versus contact opnemen met de tijd curve met behulp van ten minste drie verschillende cel-paren voor elk contact de tijd om een ​​gemiddelde en SEM te verkrijgen.
4. Noteer de niet-specifieke binding curve voor de controle met behulp van rode bloedcellen bedekt met irrelevante liganden (bijv. BSA) en / of blokkeren van de liganden of receptoren met behulp van hun specifieke functionele blokkade mAb's. Specifieke hechting frequentie bij elk contact tijdstip kan worden berekend door verwijdering van de niet-specifieke aanhechting frequentie ^1.

1. Passen bij de specifieke hechting frequentie P versus _een contact tijd t gegevens door een probabilistische model (vergelijking 1) dat een tweede-orde naar voren en eerste-orde omgekeerd, single-step interactie tussen een enkele soort van receptoren en een enkele soort van liganden ¹ beschrijft :
   
   waar K _een is de 2D-effectieve bindingsaffiniteit, k is _uit de off-rate, m _r en _l m zijn de respectieve receptor en ligand dichtheden gemeten in stap 4, en A _c is het contactoppervlak. De curve-fit heeft twee parameters, A _c K _a en k _off, als een _C en K _een hoop worden gegooid bij elkaar en riep samen zo effectief 2D-affiniteit. Het product met de off-rate is het effectieve 2D on-tarief: A c k _op = A _c K _een x k _off.
   De specifieke hechting frequentie P _een wordt berekend door aftrek van de niet-specifieke aanhechting fractie _{(P-specifieke)} van de totale gemeten hechting (P _gemeten) ^1,21:
   

8. Representatieve resultaten:

Figuur 1 Bepaling van de integrine α _L β ₂ site dichtheid op neutrofielen. Neutrofielen werden eerst geïncubeerd met 1μg/ml van E-selectine-Ig voor 10min aan de experimentele conditie gebruikt worden in de figuren 3,4 of zonder E-selectine-Ig wedstrijd, en vervolgens met verzadigende concentraties (10μg/ml) van PE-geconjugeerd anti -menselijke CD11a mAb (kloon HI111, zie Tabel van specifiekereagentia en apparatuur) of irrelevant muis lgG1 voor controle, gewassen, en geanalyseerd onmiddellijk. Monsters werden gelezen op BD LSR flowcytometer met standaard QuantiBRITE PE-kalibratie kralen. Paneel A toont fluorescentie histogrammen van de kalibratie kralen (roze) samen met die van E-selectine-Ig behandeld (blauwe kleur) of onbehandelde cellen (groene kleur). Specifieke CD11a mAb kleuring is getekend in volle bochten en irrelevante isotype-gematchte controle antilichaam kleuring wordt weergegeven in stippellijnen. Cellen behandeld met E-selectine-Ig (aanwezigheid in alle wasstappen en in FACS buffer) had geen invloed op de CD11a dichtheid gezien vanaf de vergelijking met onbehandelde cellen. Paneel B toont het proces van dichtheid van kwantificering. Log10 werd berekend voor de gemiddelde fluorescentie-intensiteit (FI) van elke piek waarde van vier kalibratie kraal histogrammen uit Panel A (roze cirkels) en voor het perceel-specifieke PE moleculen per kraal (van de fabrikant). Een lineaire regressie van Log10 PE moleculen per kraal tegen Log10 fluoresclingen werd uitgezet. Voor E-selectine behandelde cellen de Log10 FI (y)-waarden gelijk zijn 3,99 (blauw rondje) en 2,23 (blauw open cirkel) voor specifieke mAb en controle antilichaam, voor respectievelijk. We losten de lineaire vergelijking voor x (waarden worden uitgezet als groene en blauwe cirkels op Paneel B) x = Log10 PE / cel en, zoals PE:. MAb-verhouding was 1:1, het totaal aantal α _L β ₂ op neutrofielen werd berekend als 9587. Oppervlaktedichtheid werd berekend op 43 moleculen / um ^2, met behulp van 8.4μm als de neutrofielen diameter ^22. Dichtheid van ICAM-1 werd eveneens gemeten met flow cytometery gebruik van PE-anti-humaan CD54 mAb, die 65 mol / um ² geëvenaard.

Figuur 2 Micropipet systeem schema's. Ons micropipet systeem werd geassembleerd in huis en bestaat uit drie subsystemen: een imaging subsysteem om een ​​te observeren, record en analyseren van de bewegingen van de micropipet-opgezogen cel; een micromanipulatie subsysteem om een ​​om de cellen uit de cel te selecteren kamer, en een druk subsysteem om een ​​om de cellen te zuigen in de micropipetten. Het centrale stuk van de beeldvorming subsysteem is omgekeerde microscoop (Olympus IMT-2 IMT2) met een 100x olie-immersie 1,25 NA doelstelling. Het beeld wordt naar een videorecorder door middel van een heffing paar apparaat (CCD) camera. Een video timer is gekoppeld aan het systeem voor het bijhouden van de tijd. Elke micropipet kan worden gemanipuleerd door een mechanische aandrijving gemonteerd op de microscoop en fijn geplaatst met een drie-assige hydraulische micromanipulator. Mechanische manipulatoren van Newport konden worden gebruikt. Een van de micropipet houders is gemonteerd op een piëzo-elektrische vertaler, is de chauffeur van die gecontroleerd wordt door een computer LabView code (beschikbaar op aanvraag) en het signaal vertaalt door middel van een DAQ bord via een spanning versterker (zelfgemaakte) naar de piezo actuator. Dit is eenllows een om de pipet te verplaatsen nauwkeurig en herhaalbaar in een hechting testcyclus. De drukregeling subsysteem wordt gebruikt om te zuigen controle tijdens het experiment. Een hydraulische lijn verbindt de micropipet houder een vloeistof reservoir. Een fijne mechanische klepstandsteller kan de hoogte van het reservoir om precies te zijn gemanipuleerd.

Micropipetten zijn gegenereerd met behulp van KIMAX smeltpunt borosilicaatglas capillaire buizen (met een buitendiameter van 1,0 ± 0,07 mm en een binnendiameter van 0,7 ± 0,07 mm. Ten eerste, de micropipetten van capillairen worden getrokken met behulp van de norm PN-30 Magnetic Glass Narishige 'micro-elektrode horizontaal Puller (Sutter Instruments Micropipet Puller is een andere trekker optie). Ten tweede, Microforge systeem (gebouwd in huis) wordt gebruikt om de micropipetten tot de gewenste grootte van de opening te snijden. Commerciële modellen van Microforge systemen zijn ook beschikbaar.

Voor trillingen van de micropipetten voorkomen dat tijdens het experiment, de Microscopa, samen met de micromanipulators, wordt geplaatst op een luchtvering tafel.

Figuur 3 Running hechting frequentie F _i voor specifieke (A) en niet-specifieke (B) binding op 1s (rood) en 10s (blauw) contact tijden gemeten vanaf herhaald hechting testcycli tussen RBC's bedekt met ICAM-1 (A) of Higg (B ) met menselijke neutrofielen uiten van integrine α _L β _2. F _i = (X ₁ + X ₂ + ... + X _i) / i (1 ≤ i ≤ n), waarbij i de testcyclus index, X _i is gelijk aan "1" (adhesie) of "0" (geen adhesie). F _n (n = 50) werd gebruikt als de beste schatting voor de hechting waarschijnlijkheid.

Figuur 4 De kinetiek vanICAM-1 binding aan neutrofielen integrine α _L β ₂ ( ). Gemeten hechting waarschijnlijkheid zoals getoond in figuur 3 voor de drie cellen paren op elk contact is gemiddeld en uitgezet tegen contact met de tijd. De kamer medium werd HBSS met 1 mM elk van Ca ^{2 +} en Mg ^{2 +} plus 1μg/ml van dimeer E-selectine-Ig aan α _L β upregulate ₂ bindend. Voor het vastleggen van ICAM-1-Ig op rode bloedcellen, een tussenstap werd toegevoegd aan RBC incuberen met 10μg/ml capture antilichaam (gebiotinyleerd geit-anti-humaan Fc antilichaam, eBioscience) na de streptavidine incubatie stap. Om te controleren voor niet-specifieke binding twee verschillende condities werden gebruikt: 1) RBC bekleed met de anti-mens-Fc capture antilichaam en geïncubeerd met humaan IgG in plaats van ICAM-1-Ig (O) en 2) neutrofielen binden aan RBC niet bedekt met de capture antilichaam (Δ). 10μg/ml menselijk IgG werd toegevoegd aan het medium te minimaliseren binding van E-Selectine-Ig in oplossing om de capture antilichaam op de RBC oppervlak. Niet-specifieke binding opgenomen als menselijk IgG regelcurve werd gebruikt om een ​​specifieke hechting kans curve te verkrijgen ( ) Met behulp van Eq. 2. Montage van de specifieke hechting kans curve met Eq. Een (vaste lijn) terug effectieve bindingsaffiniteit A _c K _a = 1,4 • 10 ^-4 μm4 en k _off = 0,3 s ^-1.

Tabel 1. EAS-45 buffer voorbereiding (1L).

Tabel 2. Voorbereiding van de biotine-oplossing.

Tabel 3. Biotinylering van RBC.

Met succes gebruik van de micropipet hechting frequentie test moet men overwegen een aantal kritische stappen. Controleer eerst of de specifieke interactie van de receptor-ligand systeem van belang vast te leggen. Niet-specifieke controle metingen (zie Fig. 3, 4) zorgen voor de specificiteit. Idealiter zou niet-specifieke aanhechting waarschijnlijkheden lager zijn dan 0,05 voor alle contact tijd duur en om een ​​significant verschil tussen de specifieke en niet-specifieke aanhechting kansen voor elk tijdstip te hebben. Verschillende methoden kunnen worden gebruikt om enkele van de liganden aan de RBC's oppervlak. Er werd aangetoond dat chroom chloride koppeling methode ¹⁷ een hoger niveau van niet-specifieke binding dan biotine-streptavidine koppeling gaf.

Ten tweede moet een hechting kans voor specifieke interactie in het midden bereik. Deze eis kan worden voldaan door het variëren van de dichtheid van receptoren en liganden (of alleen liganden op RBC als receptoren zijn constitutief tot expressie op cels de dichtheid van die moeilijk te veranderen). Voor dit doel, bij het testen van een nieuw systeem met onbekende receptor-ligand bindingsaffiniteit, bereiden een reeks van gebiotinyleerd RBC's (zie Tabel III als een voorbeeld) om een ​​verscheidenheid van ligand dichtheden te testen. De steady-state hechting waarschijnlijkheid moet niet meer dan 0,8 gemiddeld als cel-cel-receptor dichtheid variatie meestal brengt de hechting niveau van bepaalde cellen om een ​​als de gemiddelde ligand dichtheid is te hoog. Tijdens de eerste testen op specificiteit, als sommige cellen hebben hechting niveaus van 0 of 1, het ligand dichtheid moet worden aangepast. Niet-specifieke controle metingen meestal volgen de specifieke metingen en hier men zou willen om de hechting waarschijnlijkheid zo dicht mogelijk bij nul.

Ten derde, vindt het juiste bereik voor de contactpersoon tijden. Als het contact lang genoeg is de exp (- k _off t) term in Eq. 1 gaat naar nul en de effectieve 2D-affiniteit kan worden berekend vanaf het plateau niveauvan de hechting curve ^1:

De off-rate k bepaalt _uit de overgangsfase of hoe snel de hechting curve reikt tot een plateau niveau. Voor een schatting van het off-rate precies nodig metingen van een aantal punten op een plateau niveau als genoeg tijd punten in de overgangsfase. De verantwoording van de drie kritische hierboven beschreven stappen zal men verkrijgen binding bochten vergelijkbaar met Fig. 4.

De resterende taak is om een ​​receptor-ligand bindingskinetiek model te gebruiken om de experimenteel gemeten binding curve te interpreteren en om van 2D-kinetische parameters schatten uit het monteren van de voorspelling model aan de gegevens. Opgemerkt moet worden dat Eq. 1 staat voor een eenvoudigste model van de tweede-orde naar voren, de eerste orde omgekeerd, single-step, omkeerbare kinetiek tussen een receptor-ligand soorten ^1. Meer complexe kinetische processen zijn beschreven, met inbegrip van ee gevallen van dubbele receptor-ligand soorten ^3,4, twee-traps binding, zonder ¹⁴ of met ¹⁹ trimolecular interacties, en hechting kinetiek beperkt door de actieve site vorming in plaats van een obligatie-kinetiek ^10. In deze gevallen, meer betrokken zijn mathematische modellen nodig zijn om de hechting kans vs contact tijd curve en de receptor-ligand binding kinetiek betrekking hebben.

De aanhoudende belangstelling voor de kinetiek van receptor-ligand interactie komt voort uit de fundamentele hypothese dat kinetiek parameters een rol spelen bij het bepalen van de downstream signalering gebeurtenissen binnen de cel. De micropipet hechting frequentie test hier gepresenteerde is een van de weinige methoden die het mogelijk maken in situ metingen van de twee-dimensionale (2D) bindingskinetiek. Twee-dimensionale betekent dat beide receptoren en liganden zijn op het celoppervlak, zoals van nature in veel cel-cel interacties binnen in het organisme. De 2D-kinetische snelheidsconstanten van receptor-LIGen bindende informatie te verstrekken over hoe snel cellen binden aan elkaar of aan de extracellulaire matrix, hoe lang ze blijven gebonden, en hoeveel obligaties zullen vormen. Ter vergelijking, in de Surface Plasmon Resonance (SPR) methode ²³ een van de interagerende moleculen in de vloeistof fase, vandaar de naam driedimensionale (3D) bindend. Omdat beide interagerende moleculen worden gezuiverd en geïsoleerd van de cellulaire omgeving, kan de kinetische parameters verkregen in 3D-meting worden drastisch verschillen van die verkregen in 2D-metingen, zelfs voor dezelfde receptor-ligand paar ^17.

De hechting frequentie methode analyseert 2D-kinetiek op levende cel membraan en dus biedt de mogelijkheid voor een tot de biochemische en biofysische regelgeving van de cellulaire omgeving te analyseren. Deze omvatten het membraan microtopology ^5, membraan anker ^2, moleculaire oriëntatie en lengte ^6, carrier stijfheid ⁹ en Curvatuur ^20, impingement kracht ^20, en modulatoren van het cytoskelet en membraan organisatie waar de interagerende moleculen bevinden ^15,17.

Omdat de cross-junctions receptor-ligand interactie vereist direct fysiek contact tussen de twee cellen en resulteert in een fysieke koppeling tussen twee cellen, kan de chemische reactie kinetiek van moleculaire interactie geanalyseerd worden door een mechanische test die de cellen in contact brengt en detecteert binding door het effect van kracht. Hoewel we een voorbeeld van de hechting frequentie test met behulp van een micropipet-geaspireerde RBC als een hechting sensor, kunnen andere kracht technieken worden gebruikt, inclusief atomic force microscopie ^24, biomembraan kracht sonde ^8,17, optische pincet ^25, en de geïntegreerde micropipet en cantilever ^26.

Andere mechanisch-based 2D-testen zijn ontwikkeld. Deze omvatten de thermische fluctuatie assay ^8, centrifugaTION assay ^27,28, rosetting assay ^29, en flow kamer assay ^30,31.

De beperking van de hechting frequentie test is de trage en arbeidsintensieve karakter van de test te wijten aan de herhaalde serial cycli met een enkel paar van cellen getest een contact per keer. Het wordt moeilijk voor receptor-ligand interacties met trage off-koersen lange contact tijd nodig zou zijn voor de binding curve te bereiken steady-state, waardoor het experiment inhibitively lang.

De kracht transducer gebouwd door een micropipet-geaspireerde RBC is in staat om voor het detecteren van piconewton-level krachten, die een orde van grootte lager dan de typische kracht van een niet-covalente receptor-ligand binding ^1,32. Echter, receptor-ligand dissociatie kan ook optreden op nul krachten. Eventuele zwakke hechting die onopgemerkt leidt gaat naar een onderschatting van de bindingsaffiniteit en on-tarief ^1.

Thij hechting frequentie methode gaat ervan uit dat elke hechting test is identiek en onafhankelijk van de anderen. Deze eis zou kunnen worden geschonden zoals werd aangetoond voor sommige systemen ^33, waar de huidige hechting verhoogd of verlaagd de kans op de volgende hechting. De Matlab-code om te controleren of de eis wordt voldaan voor de opgenomen volgorde van de gebeurtenissen hechting is op aanvraag beschikbaar.