Vidhäftning Frekvens analys för In Situ Kinetik Analys av Cross-Junktional Molekylär växelverkan vid cell-cell Interface

1. RBC: er isolering från helblod

1. Förbered EAS-45-lösningar. Väg upp alla ingredienser från tabell I och lös upp i 100-200ml av DI-vatten. Tillsätt vatten till 1000 ml lösning och justera pH till 8,0. Filter och delmängd av 50ml. Frys vid -20 ° C för förvaring.

OBS: Steg 1,2 bör utföras av en utbildad läkare eller sjuksköterska som en sjuksköterska, med en granskningsnämnder godkänt protokoll.

2. Rita 3-5 ml blod från medianen kubiska venen i ett 10 ml rör med EDTA och blanda försiktigt blodet med EDTA omedelbart och noggrant för att undvika koagulering.
3. Process blodprov så snart som möjligt. Alla följande steg utom centrifugering bör ske under huven för att hålla beredningen steril. Överför blod till ett 50 ml centrifugrör, tillsätt 10 ml av kallt och sterilt Histopaque 1077 och centrifugera i 5min @ 1000rpm, 4 ° C. Upprepa två gånger.
4. Lägg till 10ml kallt och sterilt PBS, centrifugera i 5min @ 1000rpm, 4 ° C. Avlägsna supernatanten. Upprepa 4 gånger (totalt 5 gånger).
5. Tvätta med sterilt EAS-45 (5min @ 1000rpm, 4 ° C) två gånger. Under förra tvätt flytta de röda blodkropparna i en ny steril 15ml tub.
6. Resuspendera röda blodkropparna in10ml EAS-45.

2. Röda blodkropparna biotinylation

1. Ta tuben med röda blodkropparna från steg 1. Ta bort alla supernatant efter centrifugering för 5min @ 1000rpm, 4 ° C. Sätt 10μl av röda blodkroppar pellets vardera till flera flaskor och lägga motsvarande belopp av PBS till varje injektionsflaska (se tabell II till exempel förberedelser av sex olika röda blodkropparna biotinylation koncentrationer).
2. Gör färska Biotin-X-NHS/DMF 1:10, 1:100 spädningar enligt tabell II.
3. Tillsätt 10μl av 0,1 miljoner boratbuffert till varje flaska.
4. Tillsätt beräknad mängd biotin-lösning till varje injektionsflaska (se tabell II som exempel) och skaka omedelbart.
5. Placera varje RBC flaskainne i en 50 ml koniska rör och inkubera på rotator för 30min vid rumstemperatur.
6. Tvätta varje flaska 3 gånger med 800μl av EAS-45 för 2min @ 2000rpm.
7. Tillsätt 100μl av EAS-45 till varje flaska och förvara vid 4 ° C. I varje 1μl av den slutliga lösningen nu bör ~ 1mln av röda blodkroppar.

3. Functionalizing den biotin-länkade ligander * på de röda blodkropparna

1. Förbered 2mg/ml streptavidin lösningen enligt tillverkarens anvisningar. Aliqouted lösning kan förvaras vid -20 ° C.
2. Blanda lika mycket av de röda blodkropparna från steg 2,7 (10μl) med streptavidin lösning, virvel omedelbart och inkubera på rotator för 30min vid 4 ° C.
3. Tvätta tre gånger med 500μl av EAS-45 för 2min @ 2000rpm. Tillsätt 15μl EAS-45 / 1% BSA för förvaring.
4. Blanda lika mycket av de röda blodkropparna från steg 3,3 (10μl) med 20μg/ml ligand lösning, virvel omedelbart och inkubera på rotator för 30min vid rumstemperatur.
5. Tvätta två gånger med 500μl av EAS-45 / 1% BSA för 2min @ 2000rpm. Tillsätt 15μl av EAS-45 / 1% BSA för förvaring.

* Om din protein har inget biotin länk som du kan använda en av de kommersiellt tillgängliga kit för protein biotinylation (till exempel, Thermo Scientific # 21.955 EZ-Link Micro NHS-PEG4-Biotinylation Kit) eller använda biotinylerad fånga antikroppar som ett mellanliggande steg som visas i videon.

4. Kvantifiering av receptorn och liganden densiteter

1. Inkubera ligand-belagd röda blodkropparna från steg 3 och, i en annan flaska, receptor-bärande celler med mätta koncentrationer av respektive MAbs för 30min vid rumstemperatur. Inkubera i separata flaskor celler med irrelevanta isotyp matchade antikroppar för kontroll. Om den primära antikroppar inte är fluorescerande, inkubera med fluorescerande-konjugerade sekundära antikroppar enligt tillverkarens anvisningar.
2. Analysera prover bereddes i steg 4,1 per flöde cytometery med motsvarande fluorescerande calibration pärlor. Beräkna densitet enligt bild. 1.

5. Förberedelse för mikropipett och cell kammare

1. Dra mikropipetter från kapillärrör med PN-30 Narishige "Magnetiska Glas mikroelektrod Horisontell Puller eller Sutter Instrument Mikropipett avdragare.
2. Använd mikromanipulator med microforge att justera spets drog mikropipett till önskad storlek (vanligtvis den diameter som krävs varierar från 1-5μm beroende på storleken av de celler som skall användas i studien).
3. Förbered cellen kammaren genom att skära glas Mikroskop Täck till önskad storlek. Försegla kammaren med hjälp av mineraloljor från båda sidor att undvika medelstora avdunstning för att ändra osmolaritet under experimentet.
4. Lägg till receptorn och liganden-bärande celler till kammaren.

6. Mikropipett vidhäftning frekvens-analysen

1. Aspirera samverkande celler genom respektive pipetter och använda dator-programmerad piezoelectr IC översättare att driva RBC in och ut i kontakt med den andra cellen med kontrollerad kontaktyta och tid. Identifiera vidhäftning händelser genom att observera RBC töjning vid cellseparation.
2. Upprepa kontakt-dementi cykel 50-100 gånger för en given kontakttid. Spela in de observerade vidhäftning händelser genom att lägga till "1" för vidhäftning eller "0" för ingen vidhäftning i en kolumn i Excel-kalkylblad. Du kan använda en färdskrivare, t.ex. digitala media eller videoband, för den mikroskopiska bilder.
3. Spela vidhäftningen frekvens kontra kontakt tidskurvan med minst tre olika cell par för varje kontakt tid för att få ett medelvärde och SEM.
4. Anteckna icke-specifik bindning kurvan för kontroll med hjälp av de röda blodkropparna belagda med irrelevanta ligander (t.ex. BSA) och / eller blockerar ligander eller receptorer använder sina specifika funktionella blockad MAbs. Specifik adhesion frekvens vid varje kontakt tidpunkt kan beräknas genom borttagning av icke-specifik vidhäftning frekvens ^1.

1. Montera specifika vidhäftning frekvens P _en kontra kontakt tiden t data genom en probabilistisk modell (ekvation 1) som beskriver en andra ordningens framåt och första ordningens bakåt, ett steg interaktion mellan en enda art av receptorer och en enda art av ligander ¹ :
   
   där K _a är 2D effektiv bindningsaffiniteten, k _off off-ränta, m _r och m _l respektive receptorn och täthet ligand mäts i steg 4 och A _c är kontaktytan. Kurvan-Fit har två parametrar, A _C K _A och K _bort, som _C och K _en klumpas ihop och kallas kollektivt lika effektivt 2D samhörighet. Sin produkt med off-räntan är den effektiva 2D på kurs: A C K _på = A _C K _ett x k _off.
   De specifika vidhäftning frekvens P _en beräknas genom subtraktion av den ospecifika vidhäftning fraktion (P _ospecifik) från den uppmätta totala vidhäftning (P _uppmätt) ^1,21:
   

8. Representativa resultat:

Figur 1 Fastställande av integrin α _L β ₂ sajt täthet på neutrofiler. Neutrofiler var först inkuberas med 1μg/ml av E-selektin-Ig för 10min för att matcha experimentella skick används i figurerna 3,4 eller utan E-selektin-IG, och sedan med mätta koncentrationer (10μg/ml) av PE-konjugerat anti -mänskliga CD11a Mab (Klon HI111, se tabell av specifikareagenser och utrustning) eller irrelevanta mus IgG1 för kontroll, tvättade, och analyseras omedelbart. Prov lästes på BD LSR flödescytometer med standard QuantiBRITE PE kalibrering pärlor. Panelen A visar fluorescens histogram för kalibrering pärlor (rosa) tillsammans med de av E-selektin-Ig behandlad (blå färg) eller obehandlat celler (grön färg). Specifik CD11a mAb färgning visas i fasta kurvor och irrelevanta isotyp-matchad kontrollgrupp antikropp färgning visas i streckade kurvor. Celler som behandlats med E-selektin-IG (närvaro i samtliga tvätt steg och i FACS buffert) påverkade inte CD11a densitet sett från en jämförelse med obehandlade celler. Panel B visar processen av densitet kvantifiering. Log10 beräknades för medelvärdet fluorescerande intensitet (FI) för varje topp värdet av fyra kalibrering pärla histogram från panelen A (rosa cirklar) och för lotspecifika PE molekyler per pärla (från tillverkaren). En linjär regression av log10 PE-molekyler per pärla mot log10 fluorescENCE var plottade. För E-selektin behandlade cellerna log10-FI (y) värden lika 3,99 (blå solid cirkel) och 2,23 (blå öppen cirkel) för specifika mAb och kontroll antikropp, respectivly. Vi löste den linjära ekvationen för x (värden plottas som grönt och blått cirklar på panel B) x = log10 PE / cell och som PE:. MAb uppgick till 01:01 var det totala antalet α _L β ₂ på neutrofiler beräknas som 9587. Surface täthet beräknades till 43 molekyler / ìm ^2, med 8.4μm som neutrofila diametern ^22. Täthet av ICAM-1 var likartad mätning av flödet cytometery hjälp av PE-anti-human CD54 MAB, vilket motsvarade 65 mol / ìm ^2.

Figur 2 Mikropipett systemet scheman. Vårt mikropipett systemet var monterat i hus och består av tre delsystem: en avbildning delsystemet som tillåter en att observera, RECORD och analysera rörelser mikropipett-aspirerade cell, en mikromanipulation delsystem så att ett för att markera cellerna från cellen kammaren, och ett tryck delsystemet som tillåter en att aspirera celler i mikropipetter. Den centrala bit av imaging delsystemet inverterat mikroskop (Olympus IMT-2 IMT2) med en 100x oljeimmersion 1,25 NA mål. Bilden skickas till en videobandspelare via en avgift par enhet (CCD) kamera. En video timer är kopplad till systemet för att hålla reda på tiden. Varje mikropipett kan manipuleras av en mekanisk enhet monterad på mikroskop och fint placerad med en treaxlig hydraulisk mikromanipulator. Mekaniska manipulatorer från Newport skulle kunna användas också. En av mikropipett innehavare är monterad på en piezoelektrisk översättare, är föraren som kontrolleras av en dator LabView-kod (fås på begäran) och översätter signalen genom ett DAQ ombord via en spänning förstärkare (hemlagad) till piezo ställdon. Detta är enllows en att flytta pipett exakt och repeatably i en vidhäftning testcykeln. Trycket förordningen delsystem används för att styra sug under experimentet. En hydraulisk linje förbinder mikropipett innehavaren till en vätskebehållare. En fin mekanisk positioner gör att höjden på reservoaren för att vara exakt manipuleras.

Mikropipetter genereras med KIMAX smältpunkt borosilikatglas kapillärrör (med ytterdiameter på 1,0 ± 0,07 mm och en inre diameter av 0,7 ± 0,07 mm. För det första är de mikropipetter från kapillärrör dras med PN-30 Narishige "Magnetiska Glas mikroelektrod Horisontell Puller (Sutter Instrument Mikropipett Avdragare är ett annat avdragare tillval). andra Microforge systemet (inbyggd i huset) används för att klippa mikropipetter till önskad storlek öppning. kommersiella modeller av Microforge system finns också.

För att undvika vibrationer i mikropipetter under experimentet, det microscDrift tillsammans med micromanipulators, placeras på en luftfjädring bord.

Figur 3 Köra F vidhäftning frekvensen _i för specifika (A) och icke-specifik (B) bindande på 1s (röd) och 10s (blå) kontakten gånger mätt från upprepade cykler vidhäftningsprov mellan RBC: er belagt med ICAM-1 (A) eller hIgG (B ) med humana neutrofiler uttrycka integrin α _L β _2. F _i = (x ₁ + x ₂ + ... + X _i) / i (1 ≤ i ≤ n), där i är provcykeln index, X _i är lika med "1" (vidhäftning) eller "0" (ingen vidhäftning). F _{n (n} = 50) användes som den bästa skattningen för vidhäftning sannolikhet.

Figur 4 kinetikICAM-1 bindning till neutrofila integrin α _L β ₂ ( ). Vidhäftning sannolikhet mätt enligt Figur 3 i tre cell par vid varje kontakt Klockan är genomsnitt och ritas kontakttid. Kammaren medium var HBSS med 1mm varje av Ca ^{2 +} och Mg ^{2 +} plus 1μg/ml av dimeriskt E-selektin-IG till upregulate α _L β ₂ bindande. För att fånga ICAM-1-Ig på röda blodkroppar, ett mellansteg inkom inkubera röda blodkropparna med 10μg/ml fånga antikropp (biotinylerad get-anti-human Fc-antikroppar, eBioscience) efter streptavidin inkuberingssteget. Att kontrollera för icke-specifik bindning två olika förhållanden användes: 1) de röda blodkropparna belagda med anti-humant-Fc fånga antikroppar och inkuberas med humant IgG i stället för att ICAM-1-IG (O) och 2) neutrofiler binder till de röda blodkropparna inte överdragna med fånga antikroppar (Δ). 10μg/ml humant IgG var tillsättas medium för att minimera bindning av E-Selektin-IG i lösning till fånga antikropp på RBC ytan. Icke-specifik bindning bokförs som humant IgG reglerkurva användes för att få en viss kurva vidhäftning sannolikhet ( ) Med hjälp av Ekv. 2. Montering specifik vidhäftning sannolikhet kurva med Eq. 1 (heldragen linje) återvände effektivt affinitet A _C K _a = 1,4 • 10 ^-4 μm4 och k _off = 0,3 s ^-1.

Tabell 1. EAS-45 buffert förberedelse (1L).

Tabell 2. Beredning av biotin lösningen.

Tabell 3. Biotinylation av röda blodkroppar.

För att framgångsrikt använda mikropipett analysen vidhäftning frekvens man bör tänka på flera viktiga steg. Börja med att kontrollera att spela in den specifika interaktionen för receptor-ligand systemet av intresse. Ospecifik kontrollmätningar (jfr figur. 3, 4) se till att specificitet. Helst bör ospecifik vidhäftning sannolikheter ligga under 0,05 för samtliga löptider kontakttid och att ha en betydande skillnad mellan det specifika och ospecifika vidhäftning sannolikheter för varje tidpunkt. Olika metoder kan användas för att koppla ligander till röda blodkropparna ytan. Det visade sig att krom klorid kopplingen metod ¹⁷ gav en högre nivå av icke-specifik bindning än biotin-streptavidin koppling.

För det andra bör en vidhäftning sannolikheten för specifika interaktion i mitten sortimentet. Detta krav kan uppfyllas genom att variera densitet av receptorer och ligander (eller bara ligander på RBC om receptorer är konstitutivt uttryckta på cells densitet som är svår att ändra). För detta ändamål när du testar ett nytt system med okänd receptor-ligand affinitet, förbereda en rad biotinylerad röda blodkropparna (se tabell III som exempel) för att testa en mängd olika ligand densitet. Vid steady-state vidhäftning sannolikhet bör inte vara mer än 0,8 i genomsnitt som cell-till-cell receptor density variation vanligtvis ger vidhäftning nivån av vissa celler till 1 om den genomsnittliga liganden densitet är för hög. Under de inledande testerna för specificitet, om vissa celler har vidhäftning nivåer av 0 eller 1, måste liganden densitet justeras. Ospecifik kontrollmätningar följer oftast den specifika mätningar och här man skulle vilja ha vidhäftning sannolikhet så nära noll som möjligt.

Tredje, hitta rätt sortiment för kontakten gånger. Om kontakten är tillräckligt lång för exp (- k _off t) termen i ekv. 1 går till noll och den effektiva 2D affinitet kan beräknas från platån nivåav vidhäftning kurva ^1:

Den off-rate k avgör _från övergångsfasen eller hur snabbt vidhäftning kurvan når en platå nivå. Att uppskatta off-kurs noggrant kräver mätningar av flera punkter på en platå nivå samt tillräckligt med poäng tid i övergångsfasen. Redovisning för de tre kritiska stegen ovan en kommer att få bindande kurvor liknande figur. 4.

Den återstående uppgift är att använda en receptor-ligand bindning kinetik modell för att tolka experimentellt uppmätta bindande kurvan och uppskattning av 2D kinetiska parametrar från anpassning av modellen förutsägelse till uppgifterna. Det bör noteras att Eq. 1 representerar en enklaste modell för andra ordningens framåt, första ordningens bakåt, ett steg, reversibel kinetik mellan en enda receptor-ligand arter ^1. Mer komplexa kinetiska processer har beskrivits, bland annat: ee fall av dubbla receptor-ligand arter ^3,4, två steg bindande utan ¹⁴ eller ¹⁹ trimolecular interaktioner och kinetik vidhäftning begränsas av aktiva site bildning istället för obligationen kinetik ^10. I dessa fall är mer inblandade matematiska modeller som krävs för att relatera vidhäftning sannolikheten vs kontakttid kurvan och receptor-ligand bindning kinetik.

Den ihållande intresse för kinetiken av receptor-ligand växelverkan härstammar från den grundläggande hypotesen att kinetik parametrar spelar en roll för att bestämma nedströms signalering händelser inne i cellen. Den mikropipett vidhäftning frekvens-analysen som presenteras här är en av de mycket få metoder som gör att in situ mätningar av två-dimensionella (2D) bindande kinetik. Tvådimensionella innebär att både receptorer och ligander är på cellytan, som naturligt förekommer i många cell-cell interaktioner inne i organismen. 2D kinetiska hastighetskonstanter av receptor-LIGoch bindande ge information om hur snabbt celler binder till varandra eller till den extracellulära matrisen, hur länge de är bundna, och hur många band bildas. Som jämförelse, i Surface Plasmon Resonance (SPR)-metoden ²³ en av de samverkande molekyler är i flytande fas, därför kallas tredimensionella (3D) bindande. Eftersom båda samverkande molekyler är renade och isolerade från den cellulära miljön, kan den kinetiska parametrarna, som erhölls i 3D-mätning drastiskt annorlunda än de som erhållits i 2D mätningar även för samma receptor-ligand par ^17.

Vidhäftningen frekvens metod analyser 2D-kinetik på levande cellmembran och ger därmed en möjlighet för en att analysera de biofysiska och biokemiska föreskrifter från cellulära miljön. Dessa inkluderar membranet microtopology ^5, membran ankare ^2, molekylär inriktning och längd ^6, bärare stelhet ⁹ och CurvaTure ^20, impingement kraft ^20, och modulatorer av cytoskelettet och membran organisation där samverkande molekyler bor ^15,17.

Eftersom gränsöverskridande Junktional receptor-ligand interaktioner kräver direkt fysisk kontakt mellan två celler och resulterar i fysisk koppling mellan två celler, kan den kemiska reaktionen kinetik av molekylär interaktion analyseras av en mekanisk analys som sätter cellerna i kontakt och upptäcker bindande av effekten av våld. Även om vi exemplifierade analysen vidhäftning frekvensen med en mikropipett-sugs RBC som en vidhäftning sensor kan annan kraft tekniker användas, inklusive atomkraftsmikroskopi ^24, biomembrane kraft sond ^8,17, optisk pincett ^25, och den integrerade mikropipett och fribärande ^26.

Andra mekaniskt-baserad 2D-analyser har utvecklats. Dessa inkluderar den termiska fluktuationer analys ^8, centrifugeringseffektning analys ^27,28, rosetting analys ^29, och flöde kammare analys ^30,31.

Begränsningen av vidhäftning frekvens-analysen är den långsamma och arbetskrävande typ av analys på grund av de upprepade seriella cykler med ett enda par av celler testade en kontakt i taget. Det blir svårt för receptor-ligand interaktioner med långsamma utanför valutakurser, eftersom långa kontakta gånger skulle krävas för bindningen kurvan för att uppnå steady-state, vilket gör experimentet inhibitively lång.

Den kraftgivare konstruerats av en mikropipett-sugs RBC är kapabel för att upptäcka piconewton nivå krafter, som är en storleksordning lägre än den typiska styrkan i en noncovalent receptor-ligand obligation ^1,32. Men receptor-ligand dissociation kan uppstå även på noll krafter. Varje svag vidhäftning som går oupptäckt leder till en underskattning av affinitet och på-kurs ^1.

THan vidhäftning frekvens metod utgår från att varje vidhäftningsprov är identiskt och oberoende från de andra. Detta krav skulle kunna vara kränkt som visades för vissa system ^33, när aktuella vidhäftning ökar eller minskar sannolikheten för att nästa vidhäftning. Matlab-kod för att kontrollera om kravet är uppfyllt för den inspelade sekvensen av vidhäftning händelser som finns tillgänglig på begäran.