마그네틱 족집게를 사용하여 다중 단일 분자 강제 Proteolysis 측정

1. 흐름 셀 준비

1. Coverslips은 (# 1.5, 22x22 mm와 22x40 mm, VWR) sonication을 사용하여 청소합니다.
   1. coverslips를 개최하고 (단계 2 참조) sonicator에서 피팅 가능한 작은 유리 용기에 coverslips을 추가합니다.
   2. 이소프로판올과 용기를 기입하고 20 분 동안 목욕 sonicator에 sonicate.
   3. 이소프로판올을 취소하고 Barnsted MilliQ 장치 또는 이와 유사한 장치에 의해 생산된 탈이온수의 풍부한 수량과 coverslips를 헹굴. 물로 용기를 기입하고 20 분 동안 sonicate.
   4. sonication 후, 여과, 먼지없는 공기의 흐름에 coverslips을 건조. (예 : 없음 얼룩) 깨끗한에만 표시 coverslips를 사용하십시오.
   5. 천천히 불꽃이 몇 초간 coverslips는 남아있는 먼지와 습기 그들을 청소하는 방법 : 초과 열로 인해 coverslip을 워프하지 돌보는, 분젠 버너로 생산된 가스 불꽃을 통해 coverslips를 전달합니다. 이 단계는 잔여 표면을 제거오염 물질.
2. 양면 스카치 테이프를 이용하여 함께 두 coverslips 첨부합니다. 테이프를 자르고 ~ 길이 3cm, 폭 0.3 cm. 중간에 1.6 cm 채널을두고 22x40 밀리미터 coverslip에 테이프를 부착합니다. 부드럽게 테이프가 제대로 준수되었는지 coverslip에 아래로 누르십시오 피펫 팁을 사용합니다.

2. 마그네틱 족집게 설정 및 교정

1. 마그네틱 핀셋은 이전에 ^10,12 설명된대로 영구 희토류 자석을 사용하여 설치했다. 알루미늄 L-브래킷은 1 밀리미터 직경 핀홀과 건설과 수직 Z-번역사 (Thorlabs) 족집게의 높이를 조절하기 위해 장착되었다. 두 개의 영구 희토류 자석은 자석 트랩 (그림 1)을 만드는 핀홀의 양쪽에 받침대가 붙어 있었다.
2. DNA의 준비 : 그 5 '및 3'에서 분류 람다의 파지의 DNA는 비오틴과 digoxigenin (IDT의 DNA, 샌디에고, CA)와 엔드 탄환을 보정하기 위해 사용되었다netic 핀셋.
   1. 10 분 60 복합 oligonucleotide와 열 ° C를 비오틴 40 nm의 2 μL와 4 nm의 λ-DNA의 50 μL를 섞습니다. 일시간 이상 상온에서 다음 천천히 좋아.
   2. 제조 업체의 사양에 따라의 DNA ligase를 추가하고 3 시간 동안 실온에서 ligate.
   3. 45 분 동안 상온에서 400 나노미터 digoxigenin 복합 oligonucleotide과 부화 2 μL를 추가합니다.
   4. 10 밀리미터 ATP의 1.5 μL을 넣고 3 시간 동안 λ-DNA에 dig​​oxigenin 복합 oligonucleotide의 결합을 계속합니다.
   5. 100 kDa의 스핀 필터 (Microcon Ultracell YM-100)를 사용하여 초과 oligonucleotides 그리고 DNA ligase를 제거합니다. TE 버퍼에 1,000 배 버퍼 교류의 총 초과 oligos를 제거하는 적절한 것입니다. 참고 : DNA의 전단으로 이어질 것이기 때문에 그것은 회전 속도> 500xG을 사용하지 않는 것이 중요합니다.
   6. 그 DNA는 내가 보장하기 위해 0.7 % 아가로 오스 겔 전기 영동에 관한 통해 DNA 샘플을 검사s의 변성이나 빠졌어 않습니다.
   7. DNA의 농도를 측정합니다. 사용 가능한 샘플 볼륨이 매우 작은이 될 수 있으므로 Nanodrop UV-VIS 분광계 (써모 과학)의 사용을 권장합니다.
3. 섹션 1에서 설명한대로 흐름 세포를 준비합니다.
4. 흐름 세포로 DNA의 첨부 파일, 안티 digoxigenin 항체를 추가 (양 IgG, 1 μg ML ^-1; 로슈 Bioscience, Manheim, 독일)와 그것이 15 분 동안 유리 표면에 충실하실 수 있습니다.
5. 1X PBS로 200 밀리그램 ML ^-1 BSA, 0.1 % 십대 초반-20을 추가하여 DNA의 불특정 버티는 것을 막기 위해 흐름 세포의 표면을 Passivate. 45 분 동안 상온에서 품어.
6. 단계 2.5 반복합니다.
7. λ-DNA fuctionalized 50 PM을 추가하고 15 분 동안 coverslip에 첨부할 수 있습니다.
8. 1X PBS로 여분의 DNA를 멀리 씻는다.
9. 2.8 μm의 비즈 = 20 μg ML ^-1, streptavidin - 코팅 superparamagnetic 비즈 (1 μm의 비즈 = 2 μg ML ^{-1 추가}
10. 1X PBS로 초과 구슬 멀리 씻는다.
11. 마그네틱 족집게 교정
    1. 멀리 시료 표면 (> 15mm)로부터 위치로 영구 자석을 이동합니다.
    2. 현미경에서 준비한 흐름 전지를 놓습니다.
    3. 흐름 셀 위에 위치로 영구 자석을 이동합니다.
    4. 멀리 유리 표면 모두에서 비즈에 초점을 맞춤으로써 λ-DNA가 작용 구슬의 초점 평면을 선택합니다. 정확한 초점 비행기는 원하는 구슬이 밝은 센터를 보유하고있는 것입니다.
    5. 500 프레임 80 Hz에서 또는 그 이상의 구슬의 운동 비디오를 가져가라.
    6. 가까이 샘플 표면에 자석을 이동합니다. 5mm 넘어 거리, 1 밀리미터 단위로 이동합니다. 1과 5mm 사이의 거리, 0.5 mm 단위로 이동합니다. 1mm 미만 거리, 0.25 밀리미터 단위로 이동합니다.
    7. 각각의 새로운 자석 위치에 단계 2.11.5 및 2.11.6를 반복합니다.
    8. 각 데이터에 대한설정 2D 가우스 발작을 사용하는 구슬의 중심을 추적합니다.
    9. 사용하는 브라운 변동 통해 힘을 계산 :

    
    K _B T는 볼츠만 열에너지이고, L은 λ-DNA의 길이이며, <x ^2> 중심 위치에 분산이다.

    10. rolloff 주파수를 찾기 위해 파워 스펙트럼 Lorentzian 끼워 맞춤을 통해 힘을 계산을 선택하여 세력의 정확성을 확인합니다. 응용 세력 관계에 의해 rolloff 주파수 관련이 :

    
    ƒ에 ₀ rolloff 주파수는 어디,이 구슬 반경이며, μ는 유체 점도 ^12.

3. 흐름 셀로 콜라겐 펩타이드 첨부

우리의 방법론의 적용에 대한 구체적인 예제를 제공하기 위해, 우리는 trimeric 콜라겐 모델 펩티드의 proteolysis를 특징 짓는 저희 연구실의 최근의 작업을 설명합니다. 우리는이 일반적인 접근 방식이 크게 다른 단백질과 polynucleotides에 적용할 수있다는 것을 기대하고 있습니다.

1. 콜라겐 모델 펩티드는 삼중 나선 형성을 집행하는 ₁₀ 5 배 myc 태그 (GPP), 콜라겐 뒤에 정화를위한 N-터미널 6x 그의 태그로 구성되어 형성 α1 잔류물 772-786 (GPQGIAGQRGVVGL), MMP를 한 인식 사이트 foldon 시퀀스 (GSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL) 및 C-터미널 KKCK은 비오틴-maleimide으로 레이블링 촉진합니다. Foldon는 T4-파지 단백질 fibritin에서 유래하고, N 중 하나에 융합되면 콜라겐 모델 trimers을 안정화 - 또는 C-말단 ^13,14.
2. 이전 ^4,15 설명한 것처럼 콜라겐 펩타이드 및 MMP-1 단백질은 표현과 정화되었다. <이/ 리>
3. 안티 myc은 흐름 세포의 표면에 부착하도록 안티 - myc (15 μg ML ^-1) 20 분 동안 상온에서 흐름 전지 및 부화 추가합니다.
4. 2.5 단계에서 설명한 것과 같은 방법으로 5 밀리그램 ML ^-1 BSA를 사용하여 단백질의 불특정 첨부 파일을 방지하기 위해 유동 셀을 Passivate.
5. 150시 콜라겐 펩타이드를 추가하고 45 분 동안 myc 태그를 통해 항체에 연결하실 수 있습니다.
6. PBS 버퍼를 사용하여 과도한 콜라겐 멀리 씻는다.
7. streptavidin 코팅 superparamagnetic 비즈 (1 μm의 비즈 = 2 μg ML ^-1과 2.8 μm의 구슬 = 20 μg ML ^-1)들을 45 분 동안 콜라겐 분자에 첨부할 수 있습니다. 추가 1 μm의 비즈는 PBS에서 원하는 농도로 희석해야한다. 3 μm의 비즈 그런 다음 PBS에서 resolubilized 강한 자석을 사용하여 솔루션에서 분리해야합니다. 이 과정은 3 회 반복한다. 우리는이 단계가 GE에 필수적 것으로 나타났습니다t 3 μm의 비즈는 표면 고정화 콜라겐 펩타이드에 바인딩합니다.

4. 강제 Proteolysis 분석

1. 일단 흐름 세포는 낮은, ~ 1 PN 포스 밑에 자석 트랩의 영상 흐름 세포, 콜라겐 펩타이드 및 자기 구슬과 함께 조립하고 있습니다. 우리의 경험에서, 구슬 subpopulation 때로는 약하게 아닌 특정 방식으로 표면을 준수하고 있습니다. 겸손한 무력 신청이 구슬은 해방임을 보장합니다.
2. 흐름 세포에 활성 효소를 추가합니다. 이 경우 MMP-1은 3.5 밀리미터 APMA (4 aminophenylmercuric 아세테이트)를 추가하고 3 시간 동안 37 ° C에서 incubated하여 미리 활성화되었다. 정품 인증은 SDS-PAGE를 사용하여 검증되었다.
3. 곧 유동 세포가 자기 족집게 장치에 다시 도입되면로서, 일반적으로 수백 첨부된 구슬을하였으며,보기의 몇 가지 분야를 스팬 동영상을 기록합니다. 이것은 t = 0이 될 것입니다.
4. T를 반환하면서 뷰의 여러 분야를 기록하는 것과 같은 과정을 (반복모든 분리 구슬이나 더 이상 proteolysis가 뚜렷한입니다 때까지, 정기적인 시간 지점에서보기의 동일한 필드) O.
5. 운동 데이터 분석
   1. 다른 시간 시점에서보기의 다양한 분야에 비즈를 카운트하고 평균. t = 0에서 구슬의 수를 각 시간 지점에서 구슬의 평균 수를 나누어 구슬의 개수를 정상화. 이것은 구슬의 절대 숫자는 실험에서 실험으로 다를 수 있기 때문에 우리는 서로 다른 실험의 proteolysis의 속도를 비교할 수 있도록합니다.
   2. 시간의 함수로 비율로 잡아. 이 경우, 우리는 부패 지수 플러스 상수에 장착.

   
   ƒ (T)는 (또는 콜라겐 분자가 unproteolyzed) 첨부 구슬의 비율이고, t는 시간이며,이 콜라겐 밧줄로 연결된 구슬의 분율이고, B는 부패 속도가 상수이며, C비 구체적으로 연결된 구슬의 분율입니다.

   3. 같은 실험은 MMP-1에 의해 콜라겐 proteolysis에 대한 무력의 효과를 명료하게하다 강제와 MMP-1 농도 변화에 반복됩니다.

5. 대표 결과

위의 프로토콜은 효소 proteolysis에 대한 무력의 효과를 연구를위한 마그네틱 핀셋 (그림 1)의 소설 사용을 설명합니다. 우리는 관찰된 브라운 변동의 크기와 다양한 자석의 위치 (그림 2)에서 롤 - 오프 주파수의 계산 모두를 사용하여 1 μm의 3 μm의 구슬을위한 핀셋을 보정. 힘 proteolysis 실험에서는 설치 프로그램이 DNA가 콜라겐 (그림 3, 4)로 대체되는 제외하고 비슷합니다. 남아있는 구슬의 정규화된 숫자 proteolysis 속도 (그림 5)을 찾을 시간의 함수로 꾸몄다 수 있으며,이 프로세스가 될 수 있습니다효소 농도와 세력 변화를 위해 반복했다.

그림 1. 자기 트랩 교정 프로세스의 도식 (확장되지 않음). 두 개의 영구 드문 지구 자석이 superparamagnetic 구슬을 끌어 자기장을 만듭니다. 위아래로 자석을 번역하는 것은 적용 력을 조정합니다. 구슬은 두 자석 사이에 핀홀을 통해 빛을 전달과 함께 종래의 밝은-필드 현미경을 사용하여 몇 군데 있습니다 삽입된 페이지 :. 이미지 40x 공기 목적으로 찍은. 날카롭고 둥근 반점이 coverslip 표면에 부착된 비즈 일치합니다. 밖에서 초점 개체는 단독 구슬입니다.

그림 2. 1 μm의 (왼쪽)와 2.8 μm의 (오른쪽) 비드를위한 시료 표면의 자석 거리의 함수로 보정 부대의 음모의. 데이터는 경험적 함수에 적합했다 어디에 x는 자석의 거리입니다. = 31.8, B = 5.61, 및 C 1 μm의 비즈와 용 = 4.39 = 140, B 3 μm의 비즈를위한 = 3.10와 c = 1.86. 이 값은 특정한 악기와 실험적인 기하학에 특정한 있으며, 각각의 악기는 개별적으로 보정해야합니다. 각 지점에 오차 막대는 구슬 크기의 다양성으로 인해 구슬 기준으로 비드에 대한 적용 력에 ~ 10 %의 변화를 나타냅니다. 적용 힘은 구슬의 볼륨에 비례하고, 구슬 볼륨 (제조 업체 사양에 따라) 평균 이상 ~ 9 %를 다릅니다.

그림 3. 강제 proteolysis 분석 설정 (없음 규모). 콜라겐 모델 trimer는 m 통해 coverslip의 표면에 붙어있다YC / 안티 myc 활용. streptavidin-코팅 superparamagnetic 비즈는 비오틴 - streptavidin 연계를 통해 콜라겐 trimers에 첨부됩니다. 활성 MMP-1 베인 시간이 지남에 따라 콜라겐, 구슬이 표면에서 분리하고 초점 평면에서 멀리 이동하는 원인.

그림 4. 시간의 함수로 proteolysis의 도식 만화. 만화는 proteolysis 같은 시간에 따른보기의 샘플 필드가 발생 보여줍니다. 시간이 지남에 MMP-1 상처 콜라겐과 비즈는 분리와 자기장의 영향하에 초점 평면에서 떨어져 이동합니다.

그림 5. Proteolysis 요금이 적용된 힘 ¹⁶ 다릅니다. , 6.2 PN (3 μm의 MMP-1, 적색)와 13 PN (0.2 μm의 MMP-1, 마술사, 표시 1.0 PN (블랙 3 μm의 MMP-1)에서 수집된 자료입니다nta). proteolysis의 속도 (적합한 매개 변수)는 다음과 같습니다 0.22 ± 0.02 분 ^-1 (1 PN), 0.46 ± 0.09 분 ^-1 (6.2 PN), 그리고 2.08 ± 0.18 분 ^-1 (13 PN). 오랫동안 포인트 (> 15 분)에서 unproteolyzed 구슬의 분율은 다른 실험을 걸쳐 ~ 0.25의 약 일정하게 유지됩니다. 오차 막대는 각 시점에서 관찰의 수를 반영 Poisson 통계에 대응. N 개의 구슬 각 시점에서 오류가 N ^{2분의 1입니다.} 첨부된 구슬의 분율에 오류가 propagation.1 ​​μm의 비즈가 1.0 PN과 6.2 PN 실험 및 2.8 μm의 비즈 13 PN 실험에 사용되었다 위해 사용되었습니다 오류에 의해 계산되었다.

이 프로토콜은 고전적인 단일 분자 기술을위한 새로운 사용을 설명합니다. 마그네틱 핀셋은 비용 효율적인 방법으로 높은 처리량 단일 분자 assays에 대한 중간 수 있습니다. 그러나 모든 실험 기법처럼 도전과 잠재적인 함정이 있습니다.

마그네틱 핀셋의 한계

광학 트랩에 비해 MT 장치의 공간과 시간적 해상도가 낮습니다. 또한, 여기에 설명된 간단한 MT에 의해 생성된 세력은 정기적 AFM 실험에 액세스할 세력보다 훨씬 적은 30 PN 이하입니다. 이 제한은 미덕이 될 수있다 : MT가 잘 서브 PN 힘을 적용에 적합합니다.

그러한 이곳 장치와 같은 광학 트랩이나 AFM, 기존의 MT와 달리, 개별 입자의 조작을 허용하지 않습니다. 광학 트랩은 보통 MT를 수직으로 세울 실험에 가장 적합한하는 동안, coverslip 평행 력을 적용하는 데 사용됩니다. Electromagne안면 경련 MT 증가 복잡성 비용 있지만, 이러한 한계를 해결합니다.

트위터 교정

강제로 교정 브라운 변동 및 파워 스펙트럼 분석을 모두 자신의 제한이 있습니다. 우리는 브라운 변동이 방법은 카메라 블러에 특히 민감 것으로 나타났습니다. 프레임 속도가 증가 바와 같이 (노출 시간이 감소) 계산 력이 감소했다. 브라운 변동으로부터 계산 세력은 10 % 이내 파워 스펙트럼에 따라 계산 세력 동의하기 전까지 실제로, 우리는 프레임 속도를 증가했다. 반대로, 파워 스펙트럼 분석은 카메라 블러에 대해보다 강력한지만 구현할 약간 더 어렵습니다. 우리는 결과의 견고를 확인하기 위해 두 계산을 수행하는 것이 좋습니다.

우리는 구슬 크기와 ~ 10 %로 적용 력의 변화에​​ 자성 입자의 콘텐츠 결과에서 해당 유사 콘텐츠를 기록해 둡니다. 이 효과는 최근 실험에 중요하지각 측정의 구슬 수백여 우리가 평균 거든. 그러나 각 곁에 비드의 고유 정보를 추출 실험은 잠재적으로보다 정확한 교정 방법을 요구할 수 있습니다.

단일 지점에서 첨부 파일을 보장하기위한 제어

구체적 지향, 단일 포인트 첨부 파일을 달성하는 것은 종종 단일 분자 연구에 실질적인 도전입니다. 다음 컨트롤은 항체에 콜라겐의 특정 첨부 파일을 확인하고, 콜라겐의 구슬 :

1. BSA와 passivated 흐름 세포에만 구슬을 추가했습니다.
2. 안티 - myc, BSA와 passivated 후 추가 구슬을 추가했습니다.
3. 안티 - myc 추가, BSA와 passivated 아닌 biotinylated 콜라겐을 추가하고 구슬을 추가했습니다.
4. BSA와 Passivated 아닌 biotinylated 콜라겐 후 추가 구슬을 추가했습니다.
5. BSA와 Passivated, biotinylated 콜라겐 후 추가 구슬을 추가했습니다.
6. 안티 - myc 추가, BSA와 passivated, 비오틴은 추가ylated 콜라겐 후 추가 구슬.

경우에 첨부 시리즈의 일부 구성 요소가 의도적으로 생략되었습니다 1-5는, 어디서나 0-4 구슬이보기 (80000 μm의 ^2)의 분야마다 흐름 세포에 붙어 보였다. 오직 모든 첨부 moieties이있는 경우를 6 년, 우리는 ~ 30-60 2.8 μm의 구슬과 표면에 붙어 80-200 1 μm의 구슬을 봤죠. proteolysis의 운동이 적절 하나 지수 플러스 강력하게 단계를 제한하는 유일한 속도, 그리고 따라서 오직 하나의 밧줄이있다는 것을 암시 지속 기간에 의해 맞는 관찰했다. 지속 기간은 가능성이 아닌 구체적 coverslip에 붙어있는 구슬을 반영합니다.

우리는 실험을 위해 일한 항체 및 단백질의 농도를보고합니다. 새로운 분석을 개발할 때 각 구성 요소에 대한 농도의 넓은 범위 검사해야합니다. BSA는 우리의 실험에서 표면 패시베이션 에이전트로서 일했습니다. 그러나이 만났다석탄통는 모든 상황에서 작동하지 않을 수 있습니다. 표면 패시베이션 위해 다른 프로토콜도 사용되었습니다 성공. 예로는 폴리에틸렌 글리콜 기능화 유리 슬라이드 ^17, 차단 대리인으로 지원 지질 bilayers ^18, 또는 카제인을 포함합니다.

데이터 분석에 관한 사항

상호 작용 - 강제 proteolysis 실험에서 비 공유 결합 (streptavidin 예 비오틴)의 분리로 인해 일부가 아닌 구체적인 초연은 (특히 높은 세력 ^19에서) 항상있다. 우리는 Adhikari 동부 표준시에 설명된 어떠한 MMP-1을 포함하지 다양한 MMP-1 농도,에서 proteolysis를 측정하여이 현상에 달한다. 모든 세력에 대해 여러 MMP-1 농도의 알. 측정 proteolysis 우리 촉매 효율 K _고양이 / 효소 K _M을 계산하는 데 사용됩니다 Michaelis-Menten 곡선을 생성하실 수 있습니다. 효소의 다양한 농도를 사용하지 않은 경우 또는, 우리는 것이 좋습니다제어 측정이 아닌 특정 손상 속도를 빼야하는 특정 세력이없이 효소와 함께 할 수.

잠재적인 응용 프로그램

자기 족집게는 다양한 힘을 범위를 포괄합니다. 진력 수있는 세력은 구슬의 크기에 따라 달라집니다. 1 μm의 및 2.8 μm의 비즈는 중간 세력의 구슬 중 하나를 사용하여 액세스할 세력에, 그리고 우리의 경험에 겹쳐 잘 작동합니다.

우리는 유사 실험적인 접근법은 ²¹ 바인딩 상호 작용 ²² 펼쳐, 포스 종속 proteolysis ^4,20를 연구에 광범위하게 적용할 수있을 것으로 예상됩니다. 우리와 다른 ²³ 초점 구슬 밖으로위한 회절 고리의 반경이 coverslip ²³ 비드 상대의 위치를 추적하는 민감한 수단을 제공하는 지적했습니다. 일반적으로 이런 방식으로 사용되지 않지만, 우리는 MT의 assays는 나노미터 초정밀 meas를 제공할 능력을 가지고 있다고 생각단백질 구조 역학 urements. 이 추가 정보는 힘 - 의존 proteolysis 또는 구속 측정의 맥락에서 특히 도움이 될 수 있습니다.