Multiplexed Einzelmolekül-Kraftspektroskopie Proteolyse Messungen mit magnetischen Pinzette

1. Flow Cell Preparation

1. Deckgläser (# 1.5, 22x22 mm und 22x40 mm, VWR) werden gereinigt mittels Ultraschall.
   1. Fügen Sie die Deckgläser zu einem kleinen Glasbehälter halten können Deckgläser und Montage im Ultraschallbad (siehe Schritt 2).
   2. Füllen Sie den Behälter mit Isopropanol und beschallen in einem Ultraschallbad für 20 Minuten.
   3. Entsorgen Sie das Isopropanol und spülen Sie die Deckgläser mit reichlich deionisiertem Wasser durch einen Barnsted MilliQ Apparat oder ein ähnliches Gerät produziert. Füllen Sie den Behälter mit Wasser und beschallen für 20 Minuten.
   4. Nach der Beschallung, trocknen Sie die Deckgläser in einem Strom von gefilterter, staubfreier Luft. Verwenden Sie nur Deckgläser, die sauber erscheinen (dh keine Flecken).
   5. Sanft Flamme die Deckgläschen für einige Sekunden, um sie von den verbleibenden Staub und Feuchtigkeit zu reinigen: passieren die Deckgläser durch eine Gasflamme mit einem Bunsenbrenner hergestellt, dabei nicht auf das Deckglas durch übermäßige Hitze verformen. Dieser Schritt entfernt RestflächeVerunreinigungen.
2. Mit doppelseitigem Klebeband befestigen Sie die zwei Deckgläser zusammen. Schneiden des Bandes ~ 3 cm Länge und 0,3 cm in der Breite. Befestigen Sie das Band auf 22x40 mm Deckglas Verlassen eines 1,6 cm-Kanal in der Mitte. Verwenden Sie eine Pipettenspitze Drücken Sie vorsichtig auf das Deckglas, um sicherzustellen, dass das Band ordnungsgemäß eingehalten werden.

2. Magnetische Pinzette Einrichtung und Kalibrierung

1. Magnetische Pinzetten waren Setup mit permanenten Selten-Erd-Magneten wie zuvor beschrieben ^10,12. Ein Aluminium-L-Winkel wurde mit einem Durchmesser von 1 mm Pinhole konstruiert und montiert auf einer vertikalen z-Übersetzer (Thorlabs) zu modulieren, die Höhe der Pinzette. Zwei feste seltene-Erden-Magnete wurden an der Halterung auf beiden Seiten des Loches, um die magnetische Falle (1) zu schaffen befestigt.
2. DNA-Präparation: DNA aus Lambda-Phage an seinem 5 'und 3' Enden beschriftet mit Biotin und Digoxigenin (IDT DNA, San Diego, CA) wurde verwendet, um die MAG kalibrierenmagnetische Pinzette.
   1. Mix 50 ul 4 nM λ-DNA mit 2 ul von 40 nM Biotin konjugierte Oligonukleotid und Wärme bei 60 ° C für 10 Minuten. Dann langsam auf Raumtemperatur abkühlen über 1 Stunde.
   2. Add-DNA-Ligase nach Angaben des Herstellers und ligieren bei Raumtemperatur für 3 Stunden.
   3. In 2 ul von 400 nM Digoxigenin konjugiert Oligonukleotid und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 45 Minuten.
   4. In 1,5 ul von 10 mM ATP und weiterhin Ligation der Digoxigenin konjugierten Oligonukleotids an die λ-DNA für 3 Stunden.
   5. Entfernen der überschüssigen Oligonukleotiden und DNA-Ligase unter Verwendung von 100 kDa Spinfilter (Microcon Ultracell YM-100). Insgesamt wurden 1000-fach Puffer Austausch in TE-Puffer ist ausreichend, um die überschüssigen Oligos zu entfernen. Hinweis: Es ist wichtig, nicht zu Schleuderdrehzahlen> 500 xg verwenden, weil es zum Scheren der DNA führen wird.
   6. Untersuchen einer Probe der DNA über Elektrophorese auf einem 0,7% igen Agarosegel, um sicherzustellen, dass die DNA-is nicht denaturiert oder geschert.
   7. Messen Konzentration von DNA. Verwendung einer Nanodrop UV-Vis-Spektrometer (Thermo Scientific) wird empfohlen, da die zur Verfügung stehende Probenvolumen kann sehr klein sein.
3. Bereiten Messzellen, wie in Kapitel 1 beschrieben.
4. Für die Befestigung der DNA an die Messzelle, fügen Anti-Digoxigenin-Antikörper (Schaf-IgG, 1 pg mL ^-1; Roche Bioscience, Mannheim, Deutschland) und lassen Sie es auf der Glasoberfläche für 15 Minuten einzuhalten.
5. Passivieren der Oberfläche der Durchflusszelle um nicht-spezifische Anhaften von DNA durch Zugabe von 2 mg ml ^-1 BSA, 0,1% Tween-20 in 1 × PBS zu verhindern. Inkubieren bei Raumtemperatur für 45 Minuten.
6. Wiederholen Sie den Schritt 2.5.
7. In 50 pM von fuctionalized λ-DNA und lassen Sie sie auf das Deckglas für 15 Minuten zu befestigen.
8. Auswaschen der überschüssigen DNA mit 1x PBS.
9. Fügen Streptavidin-beschichteten superparamagnetischen Perlen (1 um Perlen = 2 pg mL ^-1; 2,8 um Perlen = 20 pg mL ^-1
10. Auswaschen der überschüssigen Beads mit 1x PBS.
11. Magnetische Pinzette Kalibrierung
    1. Bewegen Sie die Permanentmagnete in eine Position, die weit weg von der Probenoberfläche (> 15 mm) ist.
    2. Den vorbereiteten Flusszelle in das Mikroskop.
    3. Bewegen Sie die Permanentmagnete in Position über der Messzelle.
    4. Wählen Sie die Brennebene der λ-DNA-funktionalisierten Kügelchen durch die Konzentration auf den Beads entfernt von den beiden Glasflächen. Die richtige Brennebene ist, in welcher die gewünschten Kügelchen einen hellen Zentrum.
    5. Nehmen Sie ein Video von Perle Bewegung bei 80 Hz oder höher für 500 Bilder.
    6. Bewegen Sie den Magneten näher an der Probenoberfläche. Bei Entfernungen über 5 mm, in Schritten von 1 mm bewegen. Für Entfernungen zwischen 1 und 5 mm, in 0,5 mm Schritten zu bewegen. Bei Entfernungen von weniger als 1 mm, 0,25 mm-Schritten verschieben.
    7. Wiederholen Sie die Schritte 2.11.5 und 2.11.6 bei jeder neuen Position Magnet.
    8. Für jeden Datensatzgesetzt ist, verfolgen die Mitte der Kugeln mit Hilfe eines 2D-Gauß-Fit.
    9. Berechnen Sie die Kraft über Brownschen Schwankungen mit:

    
    wobei k _B die Boltzmann-T thermische Energie ist, L die Länge der λ-DNA, und <x ^2> ist die Varianz der Schwerpunktsposition.

    10. Bestätigen Sie die Richtigkeit der Kräfte, indem Sie die Kraft Berechnung über ein Leistungsspektrum Lorentz-Fit, um das Roll-Off-Frequenz zu finden. Angewandte Kraft auf den Roll-Off-Frequenz, die der Beziehung:

    
    Wobei f ₀ die Roll-Off-Frequenz ist, ist ein Radius der Wulst und μ ist die Viskosität der Flüssigkeit ^12.

3. Collagen Peptide Anbau an Durchflusszellen

Um ein konkretes Beispiel für die Anwendung unserer Methodik liefern, beschreiben wir neuere Arbeiten in unserem Labor, die die Proteolyse eines trimeren Kollagen Modell-Peptid charakterisiert. Wir gehen davon aus, dass dieser allgemeine Ansatz im Großen und Ganzen kann an andere Proteine ​​und Polynukleotide angewandt werden.

1. Die Kollagen-Modell Peptid aus einem N-terminalen His-6x-Tag zur Aufreinigung von einem 5x myc-Tag, (GPP) ₁₀ bis Tripelhelixbildung durchzusetzen, das Kollagen α1 gefolgt Reste 772-786 (GPQGIAGQRGVVGL), die die Bildung MMP- 1-Erkennungsstelle, die Foldon Sequenz (GSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL), und einem C-terminalen KKCK zu erleichtern Markierung mit Biotin-Maleimid. Foldon abgeleitet vom T4-Phagen-Protein Fibritin und stabilisiert Kollagen Modell Trimere, wenn entweder den N - oder C-Terminus ^13,14.
2. Die Kollagen-Peptid und MMP-1 Proteine ​​wurden exprimiert und gereinigt wie zuvor beschrieben ^4,15. </ Li>
3. In anti-myc (15 ug ml ^-1) in die Flußzelle und Inkubieren bei Raumtemperatur für 20 Minuten, um den anti-myc an die Oberfläche der Durchflusszelle zu befestigen.
4. Passivieren der Flußzelle, um die unspezifische Bindung von Proteinen unter Verwendung von 5 mg ml ^-1 BSA auf die gleiche Weise wie in Schritt 2.5 beschrieben zu verhindern.
5. In 150 pM Kollagen-Peptid und lassen Sie ihn an den Antikörper über das myc-Tag für 45 Minuten zu befestigen.
6. Auswaschen der überschüssigen Kollagen mit PBS-Puffer.
7. Fügen Streptavidin beschichteten superparamagnetischen Perlen (1 um Perlen = 2 pg mL ^-1 und 2,8 um Perlen = 20 pg mL ^-1) und es ihnen ermöglichen, auf die Kollagen-Moleküle für 45 Minuten zu befestigen. Die 1 um Kügelchen sollten auf die gewünschte Konzentration in PBS verdünnt werden. Die 3 um Perlen sollten aus der Lösung mit starken Magneten, dann in PBS resolubilisiert getrennt werden. Dieser Prozess sollte 3 Mal wiederholt werden. Wir haben festgestellt, dass dieser Schritt notwendig, GE istt 3 um die Beads an der Oberfläche immobilisierten Kollagen-Peptid zu binden.

4. Force-Proteolyse-Assay

1. Sobald die Flußzelle mit Kollagenpeptid und magnetische Kügelchen montiert, Bild die Durchflusszelle in der Magnetfalle unter niedrigen, ~ 1 pN Kraft. Nach unserer Erfahrung ist eine Subpopulation der Kügelchen manchmal schwach an der Oberfläche in einer nicht-spezifischen Art und Weise haftet. Die Anwendung der bescheidene Kraft sorgt dafür, dass diese Perlen freigesetzt werden.
2. In aktivierte Enzym in die Flußzelle. In diesem Fall MMP-1 wurde durch Zugabe von 3,5 mM APMA (4-aminophenylmercuric Acetat) und bei 37 ° C für 3 Stunden voraktiviert. Die Aktivierung wurde überprüft durch SDS-PAGE.
3. Sobald der Messzelle wird in den magnetischen Pinzette Apparat wieder eingeführt, ein Video überspannt ein paar Sichtfelder, was typischerweise zu mehreren hundert angeschlossenen Perlen. Dies wird t = 0 sein.
4. Wiederholen Sie den gleichen Prozess der Aufnahme mehrere Gesichtsfelder (während der Rückkehr to die gleichen Sichtfeld) in regelmäßigen Zeitpunkten, bis alle Perlen lösen oder keine weitere Proteolyse erkennbar ist.
5. Kinetische Daten-Analyse
   1. Anzahl der Kügelchen in den verschiedenen Bereichen der Ansicht zu verschiedenen Zeitpunkten und Mittelwertbildung ihnen. Normalisieren der Zahl der Raupen durch Teilen der durchschnittlichen Zahl der Raupen zu jedem Zeitpunkt durch die Anzahl der Kügelchen bei t = 0. Dies stellt sicher, dass wir die Preise der Proteolyse aus verschiedenen Experimenten zu vergleichen, weil die absolute Zahl der Perlen von Experiment zu Experiment unterschiedlich sein kann.
   2. Zeichnen des Verhältnisses als Funktion der Zeit. In diesem Fall passten wir es zu einem exponentiellen Abfall plus einem konstanten.

   
   wobei f (t) das Verhältnis der Perlen gebunden (oder Kollagenmoleküle unproteolyzed) ist, t die Zeit ist, a der Anteil der Perlen von einem Kollagen Haltegurt-befestigt ist, b die Abklingrate Konstante und cist der Anteil der Perlen, die nicht spezifisch gebunden sind.

   3. Das gleiche Experiment wird bei variierenden Kraft und MMP-1-Konzentrationen, um die Wirkung der Kraft auf Kollagen Proteolyse durch MMP-1 aufzuklären wiederholt.

5. Repräsentative Ergebnisse

Das obige Protokoll beschreibt eine neuartige Verwendung von magnetischen Pinzette (Abbildung 1) zur Untersuchung der Wirkung von Gewalt auf enzymatische Proteolyse. Wir kalibrieren die Pinzette für 1 um und 3 um Perlen sowohl mit dem Ausmaß der beobachteten Schwankungen und Brownsche Berechnung des Roll-off-Frequenz bei verschiedenen Magnet-Positionen (Abbildung 2). In den Experimenten Proteolyse Kraft, ist die Einrichtung ähnlich, außer dass die DNA wird mit Kollagen (Abbildungen 3, 4) ersetzt. Die normalisierte Zahl der Raupen verbleibenden kann als Funktion der Zeit, die Proteolyse Sätze (5) zu finden aufgetragen werden, und dieser Prozess kannwiederholt zum Variieren Enzymkonzentrationen und Kräfte.

Abbildung 1. Schematische Darstellung der magnetischen Falle Kalibrierungsprozess (nicht maßstabsgetreu). Zwei ständige Seltenerd-Magnete erzeugen ein Magnetfeld, das auf dem superparamagnetische Perle zieht. Übersetzen Sie den Magneten nach oben und unten passt die ausgeübte Kraft. Die Perlen werden abgebildet mit einem konventionellen Hellfeld-Mikroskop mit dem Licht, das durch eine Lochkamera zwischen den beiden Magneten Einschub:. Das Bild mit einem 40x Luft Ziels ergreifen. Die scharfen, runden Flecken an den Beads, die an dem Deckglas Oberfläche entsprechen. Die Out-of-focus freistehende Objekte sind Perlen.

2. Rollen des kalibrierten Kraft als Funktion des Magneten Abstand von der Probenoberfläche für 1 um (links) und 2,8 um (rechts) Kügelchens. Die Daten wurden auf die empirische Funktion passen , Wobei x der Abstand von dem Magneten. A = 31,8, b = 5.61, und c = 4,39 für die 1 um Perlen und a = 140, b = 3,10 und c = 1,86 für die Kügelchen 3 um. Diese Werte sind spezifisch für unser spezifisches Instrument und experimentelle Geometrie, und jedes Instrument einzeln kalibriert werden. Die Fehlerbalken stellen an jedem Punkt eine ~ 10% Variabilität aufgebrachte Kraft auf einem Wulst zu Wulst Basis aufgrund der Variabilität der Korngröße. Die Kraft ist proportional zu dem Volumen der Kügelchen und der Wulst Volumen variiert ~ 9% gegenüber dem mittleren (nach Angaben des Herstellers).

Abbildung 3. Force-Proteolyse-Assay-Setup (nicht maßstabsgetreu). Das Kollagen-Modell Trimer wird auf die Oberfläche des Deckglases über m angebrachtyc / anti-myc-Konjugation. Die Streptavidin-beschichteten superparamagnetischen Perlen sind mit den Kollagen Trimere über eine Biotin-Streptavidin Verknüpfung gebunden ist. Aktivierte MMP-1 schneidet das Kollagen im Laufe der Zeit, so dass die Perlen aus der Oberfläche herauszuziehen und weg von der Brennebene.

Abbildung 4. Schematische Karikatur der Proteolyse als Funktion der Zeit. Die Karikatur zeigt eine Stichprobe Sichtfeld im Laufe der Zeit als Proteolyse stattfindet. Im Laufe der Zeit abnehmen MMP-1 schneidet das Kollagen und die Perlen und die sich von der Brennebene unter dem Einfluss des Magnetfeldes.

Abbildung 5. Proteolyse sind abhängig von der angewandten Kraft ^16. Dargestellt sind Daten bei 1,0 pN (3 uM MMP-1, schwarz) gesammelt, 6,2 pN (3 uM MMP-1, rot) und 13 pN (0,2 uM MMP-1, MagierNTA). Die Preise der Proteolyse (Fit-Parameter) sind: 0,22 ± 0,02 min ^-1 (1 pN), 0,46 ± 0,09 min ^-1 (6,2 pN) und 2,08 ± 0,18 min ^-1 (13 pN). Der Anteil der Perlen bei lange Punkten (> 15 Minuten) unproteolyzed bleibt etwa konstant bei ~ 0,25 in verschiedenen Experimenten. Fehlerbalken der Poisson-Statistik spiegelt die Anzahl der Beobachtungen zu jedem Zeitpunkt entsprechen. Der Fehler zu jedem Zeitpunkt für n Perlen n ^1/2. Der Fehler in Anteil der Perlen angebracht wurde durch einen Fehler berechnet propagation.1 um Kügelchen für 1.0 und 6.2 pN pN Experimente und 2,8 um Kügelchen wurden für 13 pN Experimenten verwendet wurden.

Dieses Protokoll beschreibt eine neue Verwendung für ein einzelnes Molekül klassischen Technik. Magnetische Pinzetten erlauben mittel-bis High-Throughput-Assays einzelnes Molekül in einer kosteneffizienten Weise. Jedoch, wie alle experimentellen Techniken gibt es Herausforderungen und mögliche Fallstricke.

Grenzen der magnetischen Pinzette

Im Vergleich zu einer optischen Falle die räumliche und zeitliche Auflösung eines MT Vorrichtung niedrig ist. Darüber hinaus sind die Kräfte, durch die einfache MT hier beschriebenen generiert 30 pN oder weniger, deutlich weniger als Kräfte routinemäßig in der AFM-Experimente abgerufen. Diese Einschränkung kann eine Tugend sein: MT sind gut für die Anwendung sub-pN Kräfte geeignet.

Im Gegensatz zu einer optischen Falle oder AFM, herkömmlichen MT, wie die Vorrichtung hier nicht zu, dass die Manipulation einzelner Teilchen. Optische Fallen werden in der Regel verwendet, um Kraft parallel zu dem Deckglas gelten, während MT sind für vertikale Ziehen Experimente am besten geeignet ist. ElektromagnetiTic mt diese Einschränkungen, allerdings auf Kosten der Komplexität erhöhen.

Pinzette Kalibrierung

Sowohl die Brownsche Fluktuation und Leistungsspektrum für die Analyse Kraftkalibrierung haben ihre Grenzen. Wir fanden, dass die Brownsche Fluktuation Verfahren besonders empfindlich auf die Kamera Unschärfe ist. Da die Frame-Rate erhöht (Belichtungszeit verringert) die berechnete Kraft verringert. In der Praxis konnten wir den Frame-Rate, bis die Kräfte aus Brownschen Schwankungen berechnet vereinbart mit den Kräften berechnet das Leistungsspektrum innerhalb von 10%. Umgekehrt ist das Leistungsspektrum Analyse robuster gegen Kamera Unschärfe, aber etwas schwieriger zu implementieren. Wir empfehlen Durchführung beider Berechnungen für die Robustheit der Ergebnisse zu überprüfen.

Wir stellen fest, dass Unterschiede in Korngröße und magnetische Partikel Inhalte führen zu Schwankungen in der angewandten Kraft von ~ 10%. Dieser Effekt war nicht in unserem letzten Experiment wichtig seinweil wir im Durchschnitt über Hunderte von Perlen in jeder Messung. Allerdings könnte einzigartige Experimente Informationen von jedem angebundenen Wulst extrahieren potenziell erfordern eine genauere Kalibrierung.

Steuerelementen zum Single-Point-Anhänge zu gewährleisten

Erreichen bestimmter, orientierte, Single-Point-Anlagen ist häufig eine praktische Herausforderung im einzelnen Molekül Studien. Die folgenden Kontrollen bestätigt spezifische Bindung von Kollagen an Antikörper und Beads an Kollagen:

1. Hergestellt nur Perlen in eine Durchflußzelle mit BSA passiviert.
2. Hinzugefügt anti-myc, passiviert mit BSA und fügte dann hinzu Perlen.
3. Hinzugefügt anti-myc, mit BSA passiviert, fügte nicht biotinylierte Collagen und fügte dann hinzu Perlen.
4. Passiviert mit BSA, zugegeben nicht biotinylierte Collagen und fügte dann hinzu Perlen.
5. Passiviert mit BSA, fügte biotinylierte Collagen und fügte dann hinzu Perlen.
6. Hinzugefügt anti-myc, passiviert mit BSA, Biotin hinzugefügthydroxylierte Kollagen und fügte dann hinzu Perlen.

In Fällen, in 1-5, wobei einige Komponenten der Anlage Reihe absichtlich weggelassen wurde, wurden überall 0-4 Kügelchen gesehen an der Durchflusszelle pro Gesichtsfeld (80.000 um ^2). Nur bei 6, wobei alle Bindungseinheiten vorhanden sind, sahen wir ~ 30-60 2,8 um Perlen und 80-200 1 um Kügelchen an der Oberfläche. Die Proteolyse Kinetik beobachtet werden ausreichend durch eine einfache exponentielle plus einem konstanten Term, was stark darauf hindeutet, dass es nur eine geschwindigkeitsbestimmende Schritt, und daher wird nur eine einzige Leine passen. Die Konstante wahrscheinlich auf Perlen, die nicht spezifisch auf das Deckglas befestigt sind.

Wir berichten über die Konzentrationen von Antikörpern und Proteinen, die für unser Experiment funktioniert. Eine breite Palette von Konzentrationen für jede Komponente sollte geprüft werden, wenn die Entwicklung eines neuen Assays werden. BSA arbeitete auch als Oberflächenpassivierung Agent in unserem Experiment. Allerdings traf dieshod kann nicht unter allen Umständen zu arbeiten. Andere Protokolle zur Oberflächenpassivierung wurden auch mit Erfolg verwendet. Beispiele umfassen Polyethylenglykol funktionalisiertes Glas Schieber ^17, Lipiddoppelschichten ¹⁸ oder Casein als Blockierungsmittel.

Hinweise zur Datenanalyse

In Kraft Proteolyse Experimente, es gibt immer einige unspezifische Ablösung (insbesondere bei höheren Kräften ¹⁹⁾ durch Dissoziation von nicht-kovalenten (zB Biotin - Streptavidin) Wechselwirkungen. Wir berücksichtigen für dieses Phänomen durch Messen Proteolyse bei verschiedenen MMP-1-Konzentrationen, die mit keinem MMP-1, wie in Adhikari et. al. Mess-Proteolyse in verschiedenen MMP-1-Konzentrationen für alle Kräfte ermöglicht es uns, Michaelis-Menten-Kurven, wo verwendet, um die katalytische Effizienz k _cat / _K m des Enzyms berechnet werden, erzeugen. Alternativ, wenn verschiedene Konzentrationen des Enzyms nicht verwendet werden, empfehlen wir,eine Kontrollmessung ohne Enzym bei der gegebenen Kräfte zu subtrahieren die Rate der nicht-spezifischen Ablösen durchgeführt werden.

Potenzielle Anwendungen

Die magnetischen Pinzette decken einen weiten Kraftbereich. Die Kräfte ausgeübt werden kann abhängig von der Größe der Kügelchen. 1 um und 2,8 um Perlen überlappen zugänglich Kräfte, und nach unserer Erfahrung mit einer der Perlen an den Zwischen-Kräfte gut funktioniert.

Wir gehen davon aus, dass ähnliche experimentelle Ansätze können in das Studium breit anwendbare Kraft abhängige Proteolyse ^{4,20, 21} und Entfaltung Bindungswechselwirkungen ^22. Wir und andere haben festgestellt, dass ²³ der Radius der Beugungsringe für unscharfe Perlen einen empfindlichen Mittel zur Verfolgung der Position des Wulstes in Bezug auf das Deckglas ²³ sieht. Obwohl in der Regel nicht in dieser Weise verwendet, glauben wir, dass MT-Assays die Fähigkeit, im Nanometer-Präzision Maßnahmen bieten habenMessungen von Protein Strukturdynamik. Diese zusätzliche Information kann besonders wertvoll sein, im Rahmen der kraftabhängige Proteolyse oder Bindungsmessungen.