Multiplexed Single-molekyl kraft proteolyse målinger ved hjelp av Magnetic pinsett

1. Flow celleforberedelsen

1. Dekkglass (# 1.5, 22x22 mm og 22x40 mm, VWR) blir rengjort ved hjelp sonikator.
   1. Tilsett Dekkglass til et lite glass container kan holde Dekkglass og montering i sonicator (se trinn 2).
   2. Fyll beholderen med isopropanol og sonicate i et badekar sonicator i 20 minutter.
   3. Kast isopropanol og skyll Dekkglass med rikelige mengder deionisert vann som produseres av en Barnsted MilliQ apparat eller lignende innretning. Fyll beholderen med vann og sonicate i 20 minutter.
   4. Etter sonikator, tørk Dekkglass i en strøm av filtrert, støvfri luft. Bruk bare Dekkglass som vises ren (dvs. ingen flekker).
   5. Forsiktig flamme de Dekkglass i noen få sekunder for å rense dem for eventuelle gjenværende støv og fuktighet: bestå Dekkglass gjennom en gassflamme produsert med en gassbrenner, tar seg ikke å deformere dekkglass på grunn av overflødig varme. Dette trinnet fjerner rester av overflateforurensninger.
2. Bruk dobbeltsidig teip, fest to Dekkglass sammen. Kutt tapen ~ 3 cm i lengde, og 0,3 cm i bredden. Fest tapen på 22x40 mm dekkglass forlate en 1,6 cm kanal i midten. Bruk en pipette tips til forsiktig trykke ned på dekkglass for å sikre at tapen har skikkelig fulgt.

2. Magnetic pinsett Oppsett og kalibrering

1. Magnetiske pinsett ble oppsettet bruker permanente sjeldne jordarter magneter som beskrevet tidligere ^10,12. En aluminium L-braketten ble konstruert med en 1 mm diameter pinhole og montert på en vertikal z-oversetter (Thorlabs) å modulere høyden på pinsett. To permanente rare-earth magneter ble festet til braketten på hver side av pinhole å lage den magnetiske fellen (figur 1).
2. DNA forberedelse: DNA fra Lambda phage merket på sitt 5 'og 3' ender med biotin og digoxigenin (IDT DNA, San Diego, CA) ble brukt til å kalibrere magnetic pinsett.
   1. Bland 50 mL av 4 nM λ-DNA med 2 mL av 40 nM biotin konjugert oligonukleotid og varme ved 60 ° C i 10 minutter. Så sakte avkjøles i romtemperatur over 1 time.
   2. Legg DNA ligase i henhold til produsentens spesifikasjoner og ligate i romtemperatur i 3 timer.
   3. Tilsett 2 mL av 400 nM digoxigenin konjugert oligonukleotid og Inkuber ved romtemperatur i 45 minutter.
   4. Tilsett 1,5 mL av 10 mM ATP og fortsette ligation av digoxigenin konjugert oligonukleotid til λ-DNA i 3 timer.
   5. Fjern overflødig oligonukleotider og DNA ligase med 100 kDa spin filtre (Microcon Ultracell YM-100). I alt 1000 fold buffer utveksling i TE buffer er tilstrekkelig for å fjerne overflødig oligos. Merk: Det er viktig å ikke bruke sentrifugehastigheter> 500xG fordi det vil føre til klipping av DNA.
   6. Undersøke en prøve av DNA via elektroforese på en 0,7% agarose gel for å sikre at DNA ier ikke denaturert eller skåret.
   7. Mål konsentrasjonen av DNA. Bruken av en Nanodrop UV-Vis spektrometer (Thermo Scientific) anbefales fordi den tilgjengelige prøvevolum kan være svært liten.
3. Forbered flyt celler som beskrevet i punkt 1.
4. For å feste en DNA til strømningscellen, legg anti-digoxigenin antistoff (sau IgG, 1 mikrogram mL ^-1; Roche biovitenskap, Manheim, Tyskland) og la det følge glassflaten i 15 minutter.
5. Passivate overflaten av strømningscellen å hindre ikke-spesifikk stikker av DNA ved å legge til 2 mg ml ^-1 BSA, 0,1% Tween-20 i 1x PBS. Inkuber ved romtemperatur i 45 minutter.
6. Gjenta steg 2.5.
7. Tilsett 50 pM av fuctionalized λ-DNA og la feste til dekkglass i 15 minutter.
8. Vask vekk overflødig DNA med 1x PBS.
9. Legg streptavidin-belagte superparamagnetiske perler (1 mikrometer perler = 2 mikrogram mL ^-1; 2,8 mikrometer perler = 20 mg ml ^-1
10. Vask bort overskytende perler med 1x PBS.
11. Magnetic pinsett Kalibrering
    1. Flytt permanente magneter til en stilling som er langt borte fra prøven overflaten (> 15 mm).
    2. Plasser forberedt strømningscellen i mikroskop.
    3. Flytt de permanente magnetene i posisjon over strømningscellen.
    4. Velg fokalplanet av λ-DNA functionalized perler ved å fokusere på de perlene bort fra begge glassflater. Riktig fokusplanet er en der de ønskede perlene har en lys sentrum.
    5. Ta en video av perle bevegelse ved 80 Hz, eller større for 500 rammer.
    6. Flytt magneten nærmere prøven overflaten. For avstander utover 5 mm, flytter i trinn på 1 mm. For avstander mellom 1 og 5 mm, flytte på 0,5 mm trinn. For avstander mindre enn 1 mm, flytte på 0,25 mm trinn.
    7. Gjenta trinn 2.11.5 og 2.11.6 på hver ny magnet stilling.
    8. For hver datasatt, spore sentrum av perlene ved hjelp av en 2D Gaussian passform.
    9. Beregn kraften via Brownske svingninger ved hjelp av:

    
    hvor k _B T er Boltzmanns termisk energi, er L lengden av λ-DNA, og <x ^2> er variansen i Tyngdepunktet posisjon.

    10. Bekreft nøyaktigheten av styrkene ved å sjekke kraften beregningen via en strøm spektrum Lorentzian passform for å finne den rolloff frekvens. Anvendt kraft er knyttet til rolloff frekvensen av forholdet:

    
    Hvor ƒ ₀ er rolloff frekvens, er en perle radius, og μ er den flytende viskositet ^12.

3. Kollagen Peptide Vedlegg til Flow Cells

For å gi et konkret eksempel for anvendelsen av vår metodikk, beskriver vi nylig arbeidet i vårt laboratorium som preger proteolyse av en trimeric kollagen modell peptid. Vi forventer at denne generelle tilnærmingen kan være bredt anvendt til andre proteiner og polynucleotides.

1. Kollagen Modellen peptid består av en N-terminal 6x His-tag for rensing, etterfulgt av en 5x myc tag, (GPP) ₁₀ å håndheve triple helix formasjon, kollagen α1 rester 772-786 (GPQGIAGQRGVVGL), som danner MMP- en anerkjennelse nettstedet, foldon sekvens (GSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL), og en C-terminal KKCK å forenkle merking med biotin-maleimide. Foldon stammer fra T4-phage protein fibritin, og stabiliserer kollagen modell trimers når smeltet på enten N - eller C-terminus ^13,14.
2. Kollagen peptid og MMP-1 proteiner ble uttrykt og renset som beskrevet tidligere ^4,15. </ Li>
3. Legg anti-myc (15 mikrogram ml ^-1) til strømningscellen og Inkuber ved romtemperatur i 20 minutter slik at anti-myc å feste til overflaten av strømningscellen.
4. Passivate strømningscellen å hindre ikke-spesifikk vedlegg av proteiner med 5 mg ml ^-1 BSA på samme måte som beskrevet i trinn 2.5.
5. Tilsett 150 pM kollagen peptid og la det feste til antistoffet via myc tag i 45 minutter.
6. Vask bort overskytende kollagen bruke PBS-buffer.
7. Legg streptavidin belagt superparamagnetiske perler (1 mikrometer perler = 2 mg ml ^-1 og 2,8 mikrometer perler = 20 mikrogram ml ^-1) og tillate dem å feste til kollagen molekylene i 45 minutter. De 1 mikrometer perler bør fortynnes til ønsket konsentrasjon i PBS. De 3 mikrometer perler bør skilles fra løsningen ved hjelp av sterke magneter, så resolubilized i PBS. Denne prosessen bør gjentas 3 ganger. Vi la merke til at dette trinnet er viktig å get de 3 mikrometer perler å binde seg til overflaten-immobilisert kollagen peptid.

4. Force proteolyse Assay

1. Når strømningscellen monteres med kollagen peptid og magnetiske perler, bilde strømningscellen i det magnetiske fellen under lavt, ~ en PN kraft. Etter vår erfaring er en undergruppe av perlene noen ganger svakt levd opp til overflaten i en ikke-spesifikk måte. Anvendelsen av beskjedne kraft sikrer at disse perlene er frigjort.
2. Legg aktivert enzym til strømningscellen. I dette tilfellet MMP-1 ble pre-aktivert ved å legge 3,5 mm APMA (4-Aminophenylmercuric acetate) og inkuberes ved 37 ° C i 3 timer. Aktiveringen ble verifisert ved hjelp av SDS-PAGE.
3. Så snart strømningscellen gjeninnføres i det magnetiske pinsett apparat, spille inn en video som spenner over noen synsfelt, typisk som gir flere hundre vedlagte perler. Dette vil være t = 0.
4. Gjenta den samme prosessen med å samle flere synsfelt (mens tilbake to det samme synsfeltet) ved jevne tidspunkter, til alle perlene løsne eller ingen ytterligere proteolyse er merkbar.
5. Kinetic dataanalyse
   1. Telle perlene i de ulike feltene synspunkter på forskjellige tidspunkt og gjennomsnittlig dem. Normaliser antall perler ved å dele det gjennomsnittlige antall perler på hvert tidspunkt med antall perler ved t = 0. Dette sikrer at vi kan sammenligne priser på proteolyse fra ulike eksperimenter, fordi det absolutte antall perler vil variere fra eksperiment til eksperiment.
   2. Plott forholdet som en funksjon av tid. I dette tilfellet monteres vi det til en eksponentiell pluss en konstant.

   
   hvor ƒ (t) er forholdet mellom perlene vedlagt (eller kollagen molekyler unproteolyzed), er t tiden, er en brøkdel av perler festet med en kollagen tjore, er b forfallet hastighetskonstanten, og cer andelen av perler som er festet ikke-spesifikt.

   3. Det samme eksperimentet gjentas med varierende styrke og MMP-1 konsentrasjoner å belyse effekten av kraft på collagen proteolyse av MMP-1.

5. Representative Resultater

Ovennevnte protokollen beskriver en roman bruk av magnetiske pinsett (Figur 1) for å studere effekten av kraft på enzymatisk proteolyse. Vi kalibrert pinsetten for 1 mikrometer og 3 mikrometer perler med både omfanget av de observerte Brownske svingningene og beregning av roll-off frekvens på varierende magnet posisjoner (Figur 2). I kraft proteolyse eksperimenter, er oppsettet likt bortsett fra at DNA blir erstattet med kollagen (figur 3, 4). Den normaliserte antall perler gjenværende kan plottes som funksjon av tid til å finne de proteolyse prisene (figur 5), og denne prosessen kan væregjentas for varierende enzym konsentrasjon og krefter.

Figur 1. Skjematisk av den magnetiske fellen kalibreringsprosessen (ikke å skalere). To permanente sjeldne jordarter magneter skape et magnetfelt som trekker på superparamagnetiske perle. Oversette magnet opp og ned justerer anvendt kraft. Perlene er avbildet med en konvensjonell lys-feltet mikroskop med lyset som passerer gjennom et pinhole mellom de to magnetene Innfelt:. Bilde tatt med en 40x luft objektiv. De skarpe, runde flekker tilsvarer perlene er festet til dekkglass overflaten. De out-of-fokus objekter er frittliggende perler.

Figur 2. Plott av den kalibrerte kraft som funksjon av magnet avstand fra prøven overflaten for 1 mikrometer (til venstre) og 2,8 mikrometer (høyre) perles. Data ble passe til den empiriske funksjon , Der x er avstanden fra magneten. En = 31,8, b = 5,61 og c = 4,39 for de 1 mikrometer perler og en = 140, b = 3,10 og c = 1,86 for de 3 mikrometer perlene. Disse verdiene er spesifikke for vår bestemt instrument og eksperimentell geometri, og hvert instrument bør kalibreres individuelt. De feilfelt ved hvert punkt representerer en ~ 10% variasjon i anvendt kraft på en perle til perle basis, på grunn av variasjon i perle størrelse. Kraften er proporsjonal med volumet av perlene, og perle volum varierer ~ 9% over gjennomsnittet (i henhold til produsentens spesifikasjoner).

Figur 3. Force proteolyse analysen oppsett (Ikke til skala). Kollagen Modellen trimer er festet til overflaten av dekkglass via mYC / anti-myc konjugering. De streptavidin-belagte superparamagnetiske perler er festet til kollagen trimers via en biotin-streptavidin linkage. Aktivert MMP-1 kutt kollagen over tid, forårsaker perlene å løsne fra overflaten og bevege seg bort fra fokalplanet.

Figur 4. Skjematisk tegning av proteolyse som en funksjon av tid. Tegneserien viser et eksempel synsfelt over tid som proteolyse oppstår. Over tid, MMP-1 kutt kollagen og perlene løsne og flytte bort fra fokalplanet under påvirkning av det magnetiske feltet.

Figur 5. Proteolyse priser avhenge anvendt kraft ^16. Vist er data innsamlet ved 1,0 PN (3 mM MMP-1, svart), 6,2 PN (3 mM MMP-1, rød) og 13 PN (0,2 mM MMP-1; mageNTA). Satsene for proteolyse (Fit parametre) er: 0,22 ± 0,02 min ^-1 (1 PN), 0.46 ± 0.09 min ^-1 (6,2 PN), og 2,08 ± 0,18 min ^-1 (13 PN). Fraksjonen av perler unproteolyzed på lange tidspunkter (> 15 minutter) forblir omtrent konstant på ~ 0.25 på tvers av ulike eksperimenter. Feilfelt tilsvare Poisson statistikken reflekterer antall observasjoner ved hvert tidspunkt. Feilen ved hvert tidspunkt for n perler er n ^1/2. Feilen i brøkdelen av perler festet ble beregnet ved feil propagation.1 mikrometer perler ble brukt for 1,0 PN og 6.2 PN eksperimenter og 2,8 mikrometer perler ble brukt for 13 PN eksperimenter.

Denne protokollen beskriver en ny bruk for en klassisk enkelt molekyl teknikk. Magnetiske pinsett tillate middels til høy gjennomstrømming ett molekyl essay i en kostnadseffektiv måte. Men som alle eksperimentelle teknikker det er utfordringer og potensielle fallgruver.

Begrensninger av magnetiske pinsett

Sammenlignet med en optisk felle den romlige og tidsmessige oppløsningen på en MT apparat er lav. Videre kreftene som genereres av den enkle MT beskrevet her, er 30 PN eller mindre, betydelig mindre enn kreftene rutinemessig besøkt i AFM eksperimenter. Denne begrensningen kan være en dyd: MT er godt egnet for bruk sub-PN krefter.

I motsetning til en optisk felle eller AFM, konvensjonell MT, som apparat her, ikke tillater manipulering av individuelle partikler. Optiske fellene er vanligvis brukt til å søke makt parallelt med dekkglass, mens MT er best egnet for vertikale trekker eksperimenter. Electromagnetic MT løse disse begrensningene, men på bekostning av økt kompleksitet.

Pinsett Kalibrering

Både Brownske svingninger og makt spektrum analyse for kraft kalibrering har sine begrensninger. Vi fant ut at Brownske svingninger metoden er spesielt følsomme for uskarphet. Som bildefrekvens økes (eksponeringstiden redusert) beregnet styrken redusert. I praksis, økte vi bildefrekvens inntil kreftene beregnet fra Brownske svingninger enig med de kreftene beregnet ved hjelp av strøm spekteret innenfor 10%. Motsatt er kraften spektrumanalyse mer robust mot uskarphet, men litt vanskeligere å gjennomføre. Vi anbefaler å utføre begge beregninger for å kontrollere robustheten av resultatene.

Vi merker oss at variasjoner i perle størrelse og magnetiske partikler resultat i variasjoner i anvendt kraft ~ 10%. Denne effekten var ikke viktig i vår nære eksperiment væreforårsake vi gjennomsnitt over hundrevis av perler i hver måling. Imidlertid kunne eksperimenter som henter unik informasjon fra hver tethered perle potensielt kreve en mer nøyaktig kalibrering metode.

Kontroller for å sikre ett punkt vedlegg

Oppnå spesifikke, orientert, single-point vedlegg er ofte en praktisk utfordring i ett molekyl studier. Følgende kontroller bekreftet spesifikk feste av kollagen til antistoff, og perler til kollagen:

1. Lagt bare perler til en flyt celle kromatisert med BSA.
2. Lagt anti-myc, passivisert med BSA og deretter lagt perler.
3. Lagt anti-myc, passivisert med BSA, lagt non-biotinylated kollagen og deretter lagt perler.
4. Passivisert med BSA, lagt non-biotinylated kollagen og deretter lagt perler.
5. Passivisert med BSA, lagt biotinylated kollagen og deretter lagt perler.
6. Lagt anti-myc, passivisert med BSA, lagt biotinylated kollagen og deretter lagt perler.

I tilfeller 1-5, hvor noen del av vedlegget serien ble bevisst utelatt, ble alt fra 0 til 4 perler sett festet til strømningscellen per synsfelt (80 000 mikrometer ^2). Bare i tilfelle 6, hvor alle vedlegg moieties er tilstede, så vi ~~~HEAD=NNS 30-60 2,8 mikrometer perler og 80-200 1 mikrometer perler festet til overflaten. De proteolyse kinetikk observert er tilstrekkelig plass av en enkelt eksponentiell pluss en konstant sikt, noe som tyder på at det bare er en hastighetsbegrensende trinn, og dermed bare én tjore. Konstantleddet gjenspeiler sannsynlig perler som er ikke-spesifikt knyttet til dekkglass.

Vi rapporterer konsentrasjonene av antistoff og protein som fungerte for vårt eksperiment. Et bredt spekter av konsentrasjoner for hver komponent, bør undersøkes ved utvikling av en ny analyse. BSA fungerte bra som en overflate passivisering agent i vårt eksperiment. Imidlertid møtte denneHod virker kanskje ikke i alle situasjoner. Andre protokoller for overflate passivisering har også blitt brukt med suksess. Eksempler inkluderer polyetylenglykol functionalized glassplater ^17, støttes lipid bilayers ^18, eller kasein som en blokkerende agent.

Merknader om dataanalyse

I kraft proteolyse eksperimenter, er det alltid noen ikke-spesifikk avløsning (særlig ved høyere krefter ¹⁹⁾ på grunn av dissosiasjon av ikke-kovalente (f.eks biotin - streptavidin) interaksjoner. Vi står for dette fenomenet ved å måle proteolyse på ulike MMP-1 konsentrasjoner, herunder no MMP-1, som beskrevet i Adhikari et. al. Måling proteolyse på ulike MMP-1 konsentrasjoner for alle krefter tillater oss å generere Michaelis-Menten kurver, der brukes til å beregne katalytiske effektivitet k _cat / K _M av enzymet. Alternativt, hvis ulike konsentrasjoner av enzymet ikke er brukt, anbefaler vi aten kontroll måling gjøres uten enzym ved de gitte kreftene for å trekke ut frekvensen av ikke-spesifikk løsrivelse.

Potensielle anvendelser

De magnetiske pinsett dekker et bredt spekter kraft. De kreftene som kan utøves avhenger av størrelsen på perlene. 1 mikrometer og 2,8 mikrometer perler overlapper i tilgjengelige styrker, og i vår erfaring, enten ved hjelp av perlene ved mellomliggende kreftene fungerer godt.

Vi forventer at liknende eksperimentelle tilnærminger kan være bredt aktuelt å studere kraft avhengige proteolyse ^4,20, utfolder ²¹ og forpliktende samhandling ^22. Vi og andre ²³ har bemerket at radius av diffraksjon ringer for ute av fokus perler gir en sensitiv måte for sporer posisjonen av perlen i forhold til dekkglass ^23. Selv vanligvis ikke brukes på denne måten, mener vi at MT-analysene har kapasitet til å gi nanometer-presisjon tiltakmålinger av protein strukturelle dynamikk. Denne tilleggsinformasjonen kan være spesielt verdifulle i forbindelse med force-avhengige proteolyse eller bindende mål.