Modelado y de imagen de 3 dimensiones invasión celular colectiva

1. Etiquetado retroviral de células con proteínas fluorescentes

1. Células de la placa de embalaje retrovirales (por ejemplo, Phoenix) de un total de 0,25 x 10 ⁶ células por pocillo de una 6-y plato fetal al 10% de suero bovino (FBS) / DMEM.
2. Transfectar las células con el ADN retroviral 48 horas después, las células con Effectene de acuerdo a las instrucciones del fabricante.
3. Enjuague pocillos dos veces con medio de 24 horas después, a continuación, agregar 1,5 ml de 10% de SFB / DMEM por pozo.
4. Recoger virus en cultivo de tejidos empaquetados medio 48 horas más tarde con la pipeta y transferir a tubos de 2 ml microcentrífuga.
5. Centrifugar a 1600 rpm durante 5 minutos para que sedimenten las células.
6. Aspirar el sobrenadante a un tubo limpio y almacenar a -80 ° C.
7. Las células que se retroviralmente transducidas se colocan fuera de 1,5 x 10 ⁵ células por pocillo de una placa de 6 pocillos y se colocan en un incubador humidificado a 37 º C durante la noche.
8. Al día siguiente, retire el papel de las células y add 1 ml de caldo de virus suplementado con 4 polibreno l (2 mg / mL) a cada pocillo. Vuelva a colocar las placas en la incubadora.
9. Después de la incubación durante 5-6 horas, añadir 2 ml de 10% de SFB / DMEM a cada pocillo y las placas se sustituyen en 37 ° C durante la noche inbubator.
10. Al día siguiente, reemplazar los medios de comunicación y permiten que las células 24 horas antes de la adición de medios selectivos apropiados.
11. Cuando confluentes (que depende de la tasa de crecimiento de las células, y la eficiencia de la transducción retroviral, pero suele tardar entre 4-14 días), trypsinize células y tipo de células con fluorescencia no transducidas de referencia, recopilar y células de la piscina con fluorescencia mayor que los no-células transducidas y las alícuotas se congelan a -80 ° C para su uso futuro.

2. Inversa Matrigel ensayo de invasión

1. Poco a poco descongelar una alícuota de Matrigel completa (es decir, que contienen factores de crecimiento) en el hielo (Figura 1A).
2. Una vez descongelado, diluido 1:1 en Matrigel PBS enfriado con hielo (junto con otras adicionalestratamientos en la concentración de 2x en el PBS antes de la dilución; fig. 1B). Para que sea más fácil de manejar Matrigel antes de la polimerización, todos los recipientes de plástico (por ejemplo, consejos, tubos, etc) debe ser fría como el hielo.
3. Inserte el mayor número 8 micras de poro 6,5 mm de diámetro sin revestimiento transwells como se requiere en los pocillos de una placa de 24 y cultivo de tejidos, luego cuidadosamente Pipetear 100 L de la Matrigel diluido en los pocillos y se deja incubar durante ~ 30 minutos a 37 ° C para solidificar (fig. 1C).
4. Durante este tiempo, preparar uno o más fluorescente marcada con suspensiones celulares de entre 1 y 4 x 10 ⁵ células por ml, en función de la línea celular, de cada estado de pre-tratamiento (e. g. SiRNA, el tratamiento de drogas) en su crecimiento normal medio (Figura 1D).
5. Cuando el Matrigel se ha solidificado, invertir la transwells y Pipetear 100 L de la suspensión de células en la parte de abajo miran hacia arriba del filtro (Fig. 1E).
6. Con cuidado, cubrir el transwells con la base de un tejido de 24 pocillosplaca de cultivo, toma de contacto con cada gota de suspensión celular (Figura 1 F).
7. Se incuba la placa en el estado invertido durante 4 horas para permitir la unión de las células (Figura 1G).
8. Después de este tiempo, a su vez las placas con el lado derecho hacia arriba y lavar cada Transwell secuencial por inmersión en medio de 2 x 1 ml de suero libre (Figura 2A).
9. Deje el transwells en un tercer pozo que contiene alguna droga o tratamientos requeridos (Figura 2B).
10. Suavemente Pipetear 100 L de 10% de SFB / DMEM más quimioatrayente (e. g. FEAG a 25 ng / ml) en el Transwell en la parte superior de la Matrigel solidificado / mezcla de PBS, coloque la tapa e incubar durante 3-5 días a 37 º C con CO2 al _5% (Fig. 2C).

3. Tinción y visualización

1. Las células que expresan proteínas fluorescentes puede saltarse los pasos a continuación antes de la microscopía confocal
2. A la imagen no fluorescentes las células invasoras Matrigel, transwells lugar en fresco 24 platos bien y pipeta de 1 ml de 4 MCalceína AM solución mancha en la parte superior de cada plug Matrigel, permitiendo que se derrame por los costados y las manchas de la parte superior e inferior. Calceína AM (éster acetoximetil de calceína) es un tinte de células vivas que las manchas de las células de todo el verde y no requiere la fijación.
3. Incubar 1 hora a 37 ° C en _5% de CO2 atmósfera húmeda, en la que las células están totalmente manchados punto y listo para ser captado por microscopía confocal.
4. Por otra parte, no fluorescente las células invasoras Matrigel se fijaron y se tiñeron como se describe en 3.5 a 3.9.
5. Transferencia de cada Transwell a un nuevo máximo de 24 pocillos. Superposición de 1 ml de 4% para-formaldehyde/0.2% Triton X-100.
6. Incube a temperatura ambiente durante 0,5 horas.
7. Quitar fijador y lavar 3 veces con 1 ml de PBS.
8. Quitar ARN citoplásmico con 30 min de tratamiento con RNasa 100 ug / ml RNasa. Lavar dos veces con PBS.
9. Para la visualización de añadir 0,01 mg / ml de yoduro de propidio (PI) diluido en PBS y dejar a temperatura ambiente en el dark durante 0,5 horas. Lavar 3 veces con PBS. En esta etapa, PI manchas Transwell se puede mantener a temperatura ambiente en la oscuridad durante al menos 1 mes.
10. Métodos precisos de imagen por microscopía confocal son dependientes de los recursos disponibles. Utilizando un microscopio invertido confocal, Transwell lugar con una pequeña cantidad de PBS residual en cubreobjetos grande (asegurarse de que no hay burbujas) sobre los no-inmersión 20 X objetivo y la captura de secciones ópticas de 10-15 m desde el fondo del enchufe matrigel. Individuales rebanadas de ópticas se pueden utilizar para cuantificar el grado de invasión (Figura 3) o en la construcción de objetos en 3 dimensiones usando el software apropiado, como Volocity (Figura 3B).

4. Resultados representante

Un ejemplo de un Z-serie de cortes ópticos se muestra en la Figura 3. En este caso, las células fueron teñidas con calceína AM y el número de células invasoras desde el filtro se puede ver que disminuyen con la distancia. Cuantificación de lavasion se puede hacer mediante el análisis de la relación de calceína AM píxeles positivos a negativos píxeles en cada intervalo, o utilizando el método de fijación / tinción se detalla más arriba y contando núcleos PI positiva en cada posición. Una de las ventajas de calceína AM tinción es que las reconstrucciones en 3 dimensiones de la invasión de células se puede montar utilizando software como Volocity, dando una representación visual de la modalidad de la invasión (Figura 3B). Si las células son etiquetados por la expresión de proteínas fluorescentes, entonces las posiciones de cada celda de color pueden ser visualizados en tres dimensiones reconstrucciones, ya sea visto desde un lado (Figura 3C) o haciendo cortes a través de la reconstrucción (Figura 3D).

Figura 1. Esquema de los pasos involucrados en la creación de la invasión de ensayo inversa. A) Matrigel ECM descongeladas en hielo. B) Matrigel se diluye 1:1 con PBS que contenía los tratamientos de drogas en la concentración de dos veces al final. C) Inserciones Transwell se colocan en placas con pocillos múltiples, y Matrigel pipeta en cada uno. D) Las suspensiones celulares realizados en la concentración deseada. E) Una vez que el Matrigel se ha puesto, la placa se invierte y se retira, las células se colocan en el filtro inferior de las inserciones Transwell. F) En la posición invertida, la placa de paredes múltiples se coloca cuidadosamente sobre inserciones Transwell, haciendo contacto con la suspensión celular. G) Las células pueden adherirse al filtro durante 4 horas.

Figura 2. Continuación del esquema para el ensayo de invasión inversa. A) Una vez que las células se han adherido, sumerja cada Transwell en medio libre de suero dos veces para eliminar las células sueltas. B) Lugar lavado Transwell los medios de comunicación en un final bien contiene más tratamientos según sea necesario. C) los medios de comunicación que contiene quimioatrayente (por ejemplo, 10% de suero fetal bovino) con los tratamientos que requiere cuidado en capas en Matrigel.

Los ensayos de invasión Matrigel tradicionalmente han sido establecidos con células colocadas sobre una capa de proteína de matriz extracelular con quimiotáctica inducida por la movilidad hacia ya través de un filtro en la parte inferior. La invasión se calificó como una función de cuántas células se podía contar en la parte inferior del filtro. Aunque en la práctica hay poca diferencia con el ensayo "inversa" invasión se ha descrito anteriormente, hay mucha más información sobre el proceso de invasión que se puede determinar mediante la visualización de las células invasoras que se mueven arriba y a través de la Matrigel. Por ejemplo, además de ser capaz de visualizar las células etiquetadas de forma diferente de examinar los principales frente a las células después de la invasión colectiva (Figura 3C y 3D), usando este método permite que las células que se fija, permeabilized, teñido y fotografiado después de los niveles de proteína o la distribución subcelular . El poder de resolución de este método sería limitada por la intensidad de la señal de referencia de la fluorescenciant proteína que expresan las células y la sensibilidad de los aparatos de imagen, sobre todo si dos o más colores iban a ser fotografiado. Matrigel mezcla con tinte apagado (DQ) del colágeno (que es tan fuertemente conjugado con fluoresceína que la señal fluorescente se apaga hasta que la proteólisis separa fragmentos de colágeno lo que reduce la concentración de fluoresceína locales y permitir la fluorescencia) es otra aplicación multi-color de este método que permitir la visualización de la degradación de ECM con la invasión de las células. El uso de alto contenido de dispositivos equipados con proyección de imagen confocal y cámaras ambientales que permiten este procedimiento para ser transformado en un 4-d prueba real de la invasión, lo que también podrían ser canalizados con medidas adicionales, tales como la degradación de ECM. En combinación con la automatización, también sería posible diseñar a base de células de alto rendimiento ensayos que podrían ser utilizados para detectar las bibliotecas químicas para la novela de la invasión anti-blancos.

Una serie de factores SHía ser cuidadosamente controlado cuando se utiliza este ensayo de invasión inversa. La densidad celular puede afectar la eficacia aparente de la invasión, por lo que el mismo número de células se debe utilizar en cada réplica. Los tratamientos que alteran el número de células (e. g. Fármacos citotóxicos) pueden aparecer para cambiar la extensión de la invasión, pero también puede reflejar esta influencia la densidad celular. A pesar de las numerosas líneas celulares funcionan bien en este ensayo, no todos los invadir lo suficientemente bien como para ser útil, por lo que cada uno debe ser evaluado sobre una base caso por caso. El tiempo necesario para alcanzar un nivel de invasión adecuada para proporcionar una ventana buena señal debe ser determinada empíricamente para cada línea celular, la MDA MB 231 línea celular funciona bien menos 4 días después del inicio del ensayo, por ejemplo. Además, algunas de las condiciones sugeridas (por ejemplo, 8 micras de tamaño de poro para las inserciones Transwell) no pueden adaptarse a cada línea celular, y algunos de optimización puede ser necesaria. El valor añadido derivados de este método en comparación con el estándar Matrigel invasión m ensayoome que vale la pena establecer en cualquier laboratorio seriamente interesado en el estudio de los procesos implicados en 3-D invasión.