Chirurgie stéréotaxique rongeurs et des améliorations pour la protection des animaux Résultat Behavioral Neuroscience

Note: Les techniques antiseptiques doivent être utilisés durant toute la procédure. Tous les instruments et les matériaux (coton-tige tampons de gaze, etc) qui sera utilisé pendant la chirurgie doivent être stérilisées à l'autoclave. Un masque chirurgical, bonnet de cheveux et gants stériles devraient être portés. La zone de travail et de l'appareil de stéréotaxie devraient être entièrement nettoyés et désinfectés avec une solution d'éthanol à 70%.

1. Pré-chirurgicales

1. Mettre en place l'appareil de stéréotaxie et tous les matériaux nécessaires. Pré-chauffer le coussin chauffant.
2. Placer la canule dans son support et vérifier si elle est droite.
3. Allumez le système de gaz - mélange de l'air ambiant et d'oxygène (30-35% du débit total devrait être l'oxygène).
4. Peser le rat et d'administrer l'anesthésie. Nous utilisons un mélange de kétamine (37,5 mg / kg) et dexmédétomidine (0,25 mg / kg) injectée par voie sous cutanée. Pour les protocoles d'anesthésie différents, voir Flecknell ⁴ et HellebrekerS et al. ^7.
5. Après le rat a perdu conscience, raser la zone de la tête va de l'oreille à juste entre les yeux avec un rasoir électrique.
6. Placez le rat sur le coussin chauffant, avec son nez en face du tuyau à air. Utiliser un oxymètre de s'assurer que le rat a un niveau d'oxygénation sanguine adéquate (ne doit pas descendre <90%). S'il vous plaît suivez les instructions du fabricant pour une utilisation correcte du matériel.
7. Appliquez la crème des yeux (Duratears Z, Alcon) sur les deux cornées pour éviter la déshydratation.
8. Vérifiez réflexes du rat (tail réflexe ou le pincement pincer réflexe, comme démontré dans Walantus et al. ⁸⁾ afin de s'assurer qu'il est correctement anesthésié. Si le rat continue de montrer des réflexes forte, la supplémentation d'anesthésie pourraient être nécessaires.
9. Si aucun réflexe de toe-pincement est montré, place le rat dans l'appareil de stéréotaxie, d'ajuster les barres d'oreille afin qu'il montre la lecture égale des deux côtés, et placer à nouveau le tuyau d'air en face de l'animalen le fixant avec la barre de nez. Vérifiez à nouveau si le rat montre un niveau d'oxygénation du sang de 90% ou plus. Sinon, ajustez soit la tuyauterie, la rapprochant de la truffe, ou augmenter le débit d'oxygène. Surveiller le niveau d'oxygénation du sang et le rythme cardiaque tout au long de la chirurgie.
10. Surveiller en permanence la température du rat avec un thermomètre rectal (de préférence relié à un coussin chauffant) et enregistrer les valeurs au début et à la fin de la chirurgie. Ajustez le coussin chauffant ou d'utiliser une couverture pour maintenir une température corporelle de 37,5 à 38,5 ° C.

2. Chirurgie

1. Injecter l'analgésique. Nous utilisons un seul péri-opératoire administration de carprofène (4,0 à 5,0 mg / kg, voie sous-cutanée). Pour différents protocoles antalgiques, voir Hellebrekers et al. ^7.
2. Nettoyez la zone rasée de til la peau du centre vers le périmètre cheveux trois fois avec un désinfectant (par exemple, la chlorhexidine 0,5%) et localement injecter un mélange de lidocaïne (20 mg / ml) et d'adrénaline (5 mg / ml) pour l'anesthésie locale et une vasoconstriction (pour éviter saignement excessif).
3. Faire une incision antéro-postérieure d'environ 2,5 cm sur la ligne médiane du cuir chevelu, allant entre les yeux jusqu'à l'arrière des oreilles. Utilisez 4-6 pinces bulldog pour pincer la peau et à garder l'incision ouverte. Retirez tout tissu conjonctif avec une spatule et / ou de coton tiges et nettoyer la zone afin d'exposer la surface du crâne.
4. Vérifier si la tête est au niveau: d'abord, trouvez Lambda et le lieu de la canule guide exactement au-dessus de cet emplacement, en touchant le crâne. Enregistrement des coordonnées dorso-ventrale. Ensuite, placez la canule guide exactement au-dessus Bregma, touchant le crâne, et enregistrer son dorso-ventrale de coordonnées. Ces deux coordonnées devraient être identiques. Si la différence est> 0,3 mm, ajuster la barre du nez pour la corriger.
5. MAke deux petits trous pour la fixation des vis du crâne à l'aide une perceuse à main stérilisés (une d'environ 5 mm en avant de l'emplacement canule dans l'un des hémisphères et l'autre postérieure de 5 mm à l'emplacement canule dans l'hémisphère controlatéral). Placez deux vis stérile dans ces trous jusqu'à ce qu'ils soient bien ancrés, sans être complètement insérée dans le crâne.
6. Avec la canule guide placé exactement au bregma, enregistrer les coordonnées antéro-postérieure et latérale. L'emplacement correct du guide canule de placement pour chaque région du cerveau peut être calculé en ajoutant ou en soustrayant de Bregma, avec l'aide d'un atlas stéréotaxique ^9-11.
7. Position de la canule guider dans son emplacement correct, légèrement toucher le crâne. Enregistrement des coordonnées dorso-ventrale. Pour la canule de placement bilatéral, trouver l'emplacement suivant canule dans l'autre hémisphère, et à nouveau enregistrer les coordonnées dorso-ventrale. Les deux coordonnées devraient être identiques (ou diffèrent <0,3 mm).
8. Marquez les emplacements canule sur le crâne avec un crayon stérile et, avec le foreur main, faire les trous bavure, la vérification de la taille et l'emplacement correct à l'aide de la canule guide. Une fois les trous sont faits, l'utilisation d'une aiguille stérile pour doucement poinçon les méninges pour permettre l'insertion sans obstruction de la canule.
9. Placer la canule dans le premier trou et l'abaisser avec soin jusqu'à ce qu'elle atteigne la coordonnée finale ventraux. Préparez le ciment dentaire et l'appliquer généreusement autour de la canule et un ou deux vis pour fixer la canule. Attendez jusqu'à ce que le ciment a séché complètement. Ensuite, retirez soigneusement le support canule en tournant la barre de haut dorso-ventrale.
10. Placez la deuxième canule dans le support et accédez à l'emplacement canule dans l'autre hémisphère. Placer la canule dans le trou et répétez l'étape précédente. Couvrir les vis et une grande surface des canules avec le ciment, et avant que le ciment est sec, enlever tout excédent de la peau.
11. Injecter chaud (~ 37 ° C) une solution saline stérile (~ 10 ml / kg, sc) pour assurer la réhydratation.
12. Après que le ciment est complètement sèche, retirez le support canule et placer une épingle stérile dans chaque canule pour empêcher l'obstruction.
13. Nettoyer la plaie avec une solution saline stérile et suturer le recto et le verso de la plaie.
14. Retirer l'animal de l'appareil de stéréotaxie, en remplacement de la tuyauterie de gaz à l'avant de son nez. Continuer à surveiller le niveau de saturation en oxygène et la température du corps.
15. Si un anesthésique injectable avec dexmédétomidine est utilisé, injecter son atipamézole antagoniste (0,25 mg / kg, sc) et attendre que l'animal se réveille (environ 5 minutes).
16. Placez le rat dans une cage de récupération. Pour éviter l'hypothermie, placez la cage dans un incubateur à 28 ° C ou sur un coussin chauffant dans un endroit où vous pouvez observer l'animal pendant au moins une heure, avant de le retourner à la salle de vivarium.

3. Soins post-chirurgicaux

1. Durant les 4 premiers jours après la chirurgie, surveiller le rétablissement du rat par la tenue des registres quotidiens de poids et d'autres observations concernant l'état de l'animal dans des registres de laboratoire ou "journaux bien-être animal».
2. Les animaux qui montrent des signes manifestes de la maladie, une infection de la plaie, perte de poids ou d'autres signes d'une attention particulière au bien-être réduite doivent subir: par exemple, une dose supplémentaire d'antalgiques afin de minimiser la douleur post-opératoire, un mélange de nourriture en poudre et l'eau en plus des standards chow pour stimuler l'appétit du rat, et / ou une injection sous-cutanée d'une solution saline pour soutenir la réhydratation.
3. Si le rat ne montre aucune amélioration après ces interventions, ou de la perte de poids est> 15% (par rapport à la chirurgie pré-poids), le sacrifice de l'animal avec une surdose d'anesthésique (humaine point final).
4. Les rats ont généralement besoin de récupérer pendant au moins 7 jours avant le début des expériences comportementales.

4. Les résultats représentatifs

Figure 1. Effet des modifications sur la non-chirurgicale taux de survie et de la perte de poids post-chirurgicale. (A.) Non-Taux de survie des rats opérés avec le protocole modifié par rapport à celle des rats opérés avec le protocole standard. Le taux de non-survie (médiane ± interquartile gammes) a été calculé comme le pourcentage de rats, par cohorte de 20 rats, qui n'ont pas survécu chirurgie. * P <0,05, test de Mann-Whitney U test de deux Virginie (n = 20 cohortes pour le protocole modifié et 24 cohortes pour le protocole standard). La perte de poids (B.) (moyenne ± SEM en tant que pourcentage de la pré-chirurgie de poids) pendant la première (Pod1), deuxième (POD2) et troisième (POD3) jour post-opératoire. * P <0,05, ** P <0,01, test t de Student (n = 60 par groupe).

Le but principal de cette vidéo de présentation est de familiariser les neuroscientifiques comportementaux avec les principes fondamentaux de la chirurgie stéréotaxique. Les chercheurs qui sont déjà de la chirurgie stéréotaxique pourraient également bénéficier de cette vidéo et d'examiner certains des raffinements de procédure pour l'utilisation dans leur propre laboratoire. Une connaissance de plus en plus sur l'optimisation des techniques chirurgicales ^1-3, le développement de nouveaux anesthésiques et des analgésiques pour une utilisation dans la médecine humaine et vétérinaire ^4,12, sensibilisation du public concernant les questions de bien-être animal et de la législation stricte (par exemple, la directive 2010 de l'Union européenne sur la l'utilisation des animaux de laboratoire ⁵⁾ nous a incité à mettre en œuvre de nouvelles procédures pour la supplémentation en oxygène et la surveillance continue de l'oxygénation du sang et des niveaux de fréquence cardiaque pendant la chirurgie. Nous avons observé, comme le montre d'un échantillon représentatif d'animaux, un taux de survie globale accrue et une perte de poids significativement réduit post-chirurgicale.Une telle perte de poids réduits post-chirurgicale pourrait refléter une moindre charge de la procédure chirurgicale sur l'animal et, par conséquent, entraîner un animal plus actif dans les suites immédiates de la chirurgie. Si elle a également des effets bénéfiques sur sa santé à long terme n'est pas clair. Cependant, une observation remarquable, c'est que l'approvisionnement en oxygène retirer temporairement conduit à une diminution marquée et fiable des niveaux de saturation en oxygène du sang, ce qui pourrait descendre encore en dessous de 50% (voir la présentation vidéo d'une des présentes démonstration). Il est concevable qu'une période prolongée de taux sanguins insuffisants de l'oxygène, éventuellement comme se produisant dans les animaux ne reçoivent aucune supplémentation en oxygène pendant la chirurgie, pourrait entraîner une hypoxie à long terme des conséquences comportementales et aussi un impact négatif sur le résultat et / ou la qualité de l'expérimentation du comportement. Nous ne savons pas si une telle dépression de l'approvisionnement en oxygène du sang pendant la chirurgie est spécifique au protocole anesthésique utilisé dans notre laboratoire (par exemple, un mélange de ketamiNE et dexmédétomidine) ou si elle est un phénomène plus général associés à des anesthésiques injectables. L'utilisation de l'anesthésie par inhalation, avec un mélange de l'air ambiant et d'oxygène, pourrait être une méthode alternative pour surmonter la dépression du taux d'oxygène sanguin.