Skeletal Muscle Kjønn Dimorphism fra Proteomikk

Dimova, K., Metskas, L. A., Kulp, M., Scordilis, S. P. Skeletal Muscle Gender Dimorphism from Proteomics. J. Vis. Exp. (58), e3536, doi:10.3791/3536 (2011).

Brutto sammentrekning i skjelettmuskulatur bestemmes i hovedsak av et relativt lite antall kontraktile proteiner, men dette vevet er også bemerkelsesverdig tilpasningsdyktig til miljøfaktorer ^en som hypertrofi av styrketrening og atrofi av stillstand. Det dermed utstillinger ombygging og tilpasninger til stressors (varme, iskemi, tungmetaller, osv..) ^2,3. Skader kan oppstå til muskel ved en muskel utøve kraft mens forlengelse, den såkalte eksentriske sammentrekning ^fire. Den kontraktile proteiner kan bli skadet i slike anstrengelser og må repareres, degradert og / eller resynthesized; disse funksjonene er ikke en del av kontraktile proteiner, men av andre langt mindre rikelig proteiner i cellen. Å fastslå hva undergruppe av proteiner er involvert i forbedring av denne type skade, må en global proteom være etablert før trening ⁵ og deretter fulgt etter øvelsen å bestemme differensialprotein uttrykk og dermed fremheve kandidat proteiner i tilpasninger til skaden og dens reparasjon. Videre har de fleste studier av skjelettmuskulatur vært gjennomført på den mannlige av arter og dermed kan ikke være representativt for kvinnelige muskler.

I denne artikkelen presenterer vi en metode for utvinning av proteiner reproduserbart fra mannlige og kvinnelige muskler, og skille dem ved to-dimensjonal gel elektroforese etterfulgt av høyoppløselig digital bildebehandling ^6. Dette gir en protokoll for flekker (og senere identifisert proteiner) som viser en statistisk signifikant (p <0,05) to-fold økning eller nedgang, vises eller forsvinner fra kontroll staten. Disse blir deretter excised, fordøyd med trypsin og atskilt av høytrykks-væskekromatografi koblet til et massespektrometer (LC / MS) for protein identifikasjon (LC / MS / MS) ^5. Denne metodikken (Figur 1) kan brukes på mange vev med liten eller ingen modifikasjon (lever, hjerne, hørt etc.).

1. Prøvepreparering

1. Bruk fersk, flash-frosset eller RNAlater-behandlede vev fra mus som utgangspunkt materiale. Blot bort overflødig konserveringsmiddel med Kimwipe før du fortsetter.
2. Fjern alle sener og konseptet rundt muskel og kjøttdeigen vevet med singel edged barberblad for 2 min på kjølte glassplater i et kaldt rom (4 ° C) til vevet er vel hakket eller pulver. Samle prøven i en pre-veid microfuge tube og bestemme vekten av vev. Bruk ikke mer enn 10 mg av vevet som utgangsmaterialet.
3. Legg til 45 mL utvinning buffer (8 M urea, 50 mM DTT, 4% CHAPS, 0,2% carrier ampholytes 5 / 8, 0,0002% Bromophenol blå) per 1 mg hakket vev, ved romtemperatur. Dersom volumet er større enn 350 mL, tilsett 350 mL først og homogenisere (trinn 1.4), og deretter legge resten av buffer for å minimere sprut.
4. Homogenisere vevet syv ganger med en motorisert stampe (Kontes Corp) i 15 sekunder ved4 ° C, med to minutter kjøling på isen mellom hver homogenisering.
5. Sentrifuger prøver på 15 600 xg i 30 minutter ved 4 ° C. Lagre supernatanten og måle dens volum. Cellen rusk pellet forkastes.
6. Bunnfall proteinene i supernatanten med iskalde reagens-grade aceton (3 ganger v: v ratio). Vortex rørene i 15 sekunder. Sentrifuger i 15 600 xg i 10 sekunder for å danne pellets, og resuspender i utvinning buffer med Kontes motor og polypropylen omrøring stenger (BioSpec Prod)
7. Gjenta steg 1.6.
8. Enten fortsette med protein konsentrasjon estimering av prøvene eller lagre dem ved -20 ° C.

2. Protein konsentrasjon estimering

Bruk Lowry analysen ⁷ eller BCA analysen ⁸ (Pierce); mål for om lag 4,5 mg ml ^-1.

3. Isoelektrisk fokusering

1. Fjerne en ReadyStrip IPG stripe (11 cm, pH 5-8, Bio-Rad)fra -20 ° C og la den til stabilisering ved romtemperatur i 10-15 min.
2. Vortex prøven og pipette 600-800 mikrogram (totalt volum 200 mL) av protein prøve i en rett linje på baksiden kanten av en kanal i prøven rehydrering skuffen, etterlot ca 1 cm i hver ende.
3. Bruk pinsett, skrelle av plast dekselet på IPG stripe - sørg for å håndtere bare endene av bånd og unngå enhver kontakt med gel. Merk grunnleggende slutten av stripen og plasser den på venstre side av skuffen. Plasser IPG stripe gel side ned på toppen av prøven, unngå fangst bobler under. La den rehydrere i én time.
4. Overlegg med 2,5 mL mineralolje (BioRad). Dekk brettet med lokk, og la rehydrere over natten i romtemperatur.
5. Plasser et papir veke i begge ender av fokus skuffen kanal og våt hver med 10 mL Millipore vann.
6. Ta ut IPG stripe og hold vertikalt i ca 10 sekunder avløpet oljen. Blot plast backing med Kimwipe.
7. Plasser IPG stripe gel side ned og med grunnleggende enden til venstre i fokus skuffen. Dekk stripen med 2,5 mL mineralolje.
8. Sett skuffen inn i PROTEAN IEF celle (Bio-Rad) og programmere en tre-trinns-protokollen (Tabell 1) ved standard celle temperatur på 20 ° C, en maksimal strøm på 50 μA / stripe, og ingen rehydrering tid.

   	Spenning	Tid	Volt-Hrs	Ramp
   Trinn 1	250	20 min		Lineær
   Trinn 2	8000	2,5 t		Lineær
   Trinn 3	8000		40000	Rapid
   Total		6,5 t	40000

   Tabell 1. Tretrinns protokollen PROTEAN IEF celle for 11 cm IPG striper.

9. Ta IPG striper ut av IEF celle ved hjelp av tang. Blot plast støtten med en Kimwipe og plasser IPG stripe gel side opp i en ren rehydrering skuff. Du kan dekke rehydrering skuffen og pakk den med plast og oppbevar ved - 80 ° C eller fortsette.

Fire. SDS polyakrylamid gel elektroforese

1. Overfør stripen (gel side opp) inn i en 11 cm vektutjevning skuffen.
2. Tilsett 4 mL reduksjon buffer (6 M urea, 2% SDS, 0,05 M Tris / HCl pH 8,8, 20% glyserol, 2% DTT) til kanalen og likevekt stripen for 10 min med mild risting.
3. Fjern reduksjon buffer, tilsett 4 mL alkylering buffer (6 M urea, 2% SDS, 0,05 M Tris / HCl pH 8,8, 20% glyserol, 2,5% iodoacetamide) og likevekt stripen i 10 minutter med mild risting.
4. Skyll IPG stripe ved å dyppe den strip kort i 1 X SDS kjører buffer (25 mM Tris, 192 mM glysin, 0,1% SDS, 8,2 pH).
5. Legg stripe gel side opp på bakplaten av de 11 cm Criterion pre-cast 10,5% -14% Tris-HCl SDS polyakrylamid gel (Bio-Rad) og skyv det forsiktig i slik at den får full kontakt med SDS gel; sørge for at ingen bobler er fanget mellom de to gel flater.
6. Overlapper IPG stripe med 1 mL av smeltet agarose løsning (0,5% agarose, 25 mM Tris, 192 mM glysin, 0,1% SDS, Bromophenol blå) og la agarose stivne i 5 minutter.
7. Load 5 mL av protein markør 10-225 kDa (USB, P / N: 76740) i singel samt molekylvekt standarder.
8. Kjør gel i SDS buffer (25 mM Tris, 192 mM glysin, 0,1% SDS, 8,2 pH) på 200 V ved romtemperatur eller i et kaldt rom (4 ° C) ved hjelp av Bromophenol blått fargestoff front migrasjon å overvåke elektroforese.
9. Fjern gel fra plasten kastet og beis over natten ved å riste forsiktig i Coomassie Brilliant BlueR-250 flekken (45,5% metanol, 45,5% dH2O, 9,0% eddiksyre, 0,25% Coomassie Brilliant Blue R-250).
10. Rist gel i Destain en løsning (45,5% metanol, 45,5% dH ₂ O, 9,0% eddiksyre) to ganger i 3 timer hver, og i Destain 2 (5% metanol, 90% dH ₂ O, 5% eddiksyre) over natten. Oppbevar gel på 7% eddiksyre for analyse.

5. Gel bildebehandling og analyse

1. Ta bilder av gels bruker Antall Ett program som driver VersaDoc Imaging System (BioRad). Beskjære bildet områder jevnt for alle gels i eksperimentet.
2. Legg beskjæres bildene på PDQuest 8.0 programvaren for å lage et eksperiment sett. Følg Experiment installasjonsveiviseren å definere parametrene for stedet deteksjon og spot matching på tvers av geler. Inspiser og foredle stedet matchende resultater manuelt hvis nødvendig.
3. Utføre kvantitative og statistiske analyser av gels å oppdage matchet protein spots med two-fold eller høyere statistisk signifikante forskjeller i uttrykk mellom de to gel gruppene. Lag en analyse satt med disse flekkene av interesse og kutte dem ut ved hjelp av en EXQuest sted cutter (BioRad) for trypsin fordøyelsen og LC-MS-baserte protein identifikasjon.

Seks. I-gel tryptic fordøyelsen

For dette trinnet en modifisert Pierce In-Gel Tryptic Digest Kit (# 89871X, Pierce) protokollen brukes.

1. Tilsett 200 mL av destaining løsning (25 mM ammonium bikarbonat, 50% acetonitril) til gel plugger. Vortex og inkuber prøvene ved 37 ° C i 30 minutter med risting. Fjern forsiktig og kast løsningen.
2. Gjenta steg 6.1.
3. Tilsett 30 mL av nylagde redusere buffer (50 mM Tris [2-carboxyethyl] fosfin, 22,5 mM ammonium bikarbonat) til rørene som inneholder gel pluggene og Inkuber ved 60 ° C i 10 minutter.
4. La prøver å avkjøles, og fjern og kast reduserer bufferen.
5. Tilsett 30 mL av alkylering buffer (100 mM iodoacetamide, 20 mM ammonium bikarbonat, tilberedes umiddelbart før bruk i folie-innpakket rør. Inkuber prøvene i mørke ved romtemperatur i 1 time.
6. Fjern og kast alkylering buffer. Vask gel pluggene ved å tilsette 200 mL av destaining løsning til hvert rør. Inkuber prøvene ved 37 ° C i 15 minutter.
7. Fjern og kast destaining løsningen og gjenta vask.
8. Tilsett 50 mL av acetonitril til gel plugger og inkuber dem i 10 minutter ved romtemperatur å tillate dem å krympe tørre, deretter forsiktig fjerne acetonitril.
9. Gjenta steg 6,8 igjen. Gel bitene bør se hvite og små.
10. La gel brikkene til å tørke på et Centrivap Concentrator (Labconco, Modell EX1245) i 10 minutter.
11. Swell gelen stykker av tilsette 10 mL av aktivert trypsin løsning (10 ng / mL trypsin, 25 mM ammonium bikarbonat). Inkuber ved romtemperatur i 15 minutes.
12. Tilsett 25 mL fordøyelsen buffer (25 mM ammonium bikarbonat) til rørene. Inkuber prøvene ved romtemperatur over natten med risting.
13. Sonicate prøvene i 10 minutter (Branson, bad sonicator modell 2510) og spinne dem ned før du fjerner supernatanten til et nytt rør. Lagre supernatanten.
14. For ytterligere å trekke peptider, tilsett 10 mL på 0,1% maursyre og inkuberes i 5 minutter ved romtemperatur med risting. Sonicate prøvene i 10 minutter, samle supernatanten og kombinere med lagrede supernatant i trinn 6.13.

7. Mikroskala avsalting av peptid ekstrakter

1. Fjern ammonium bikarbonat og andre salter i peptid ekstrakter med hjelp av PepClean C-18 Spin kolonner (ThermoFisher) i henhold til produsentens instruksjoner.
2. Eluer peptider to ganger med 20 mL 70% acetonitril, fordamper prøvene tørre ved sentrifugering i Centrivap Concentrator for 1 time og resuspenderpeptider i 10 mL 0,1% maursyre for MS analyse.

8. Protein identifikasjon ved HPLC-coupled massespektrometri

1. Separate 5 mL av peptid blandingen på en høy ytelse væske Chromatograph (HPLC) over 40 minutter, ved hjelp av en lineær 20-50% acetonitril gradient med 0,2% maursyre på en Pepswift monolittiske PS-DVB kolonnen (Dionex) koblet til en Nanospray jeg kilden på en ion felle massespektrometer (LCQ Deca XP Max, Thermo Fisher Scientific) ved en vannmengde på 400 nL / min på tuppen.
2. Detect peptid MS1 signaler mellom 400-1400 m / z og la for de tre mest intense ion toppene å være isolert for MS2 sekvensering av CID med dynamisk eksklusjon.
3. For protein identifikasjon, analysere peptid resultatene via en Sequest mus referansedatabase søk (BioWorks programvare, Thermo-Fisher Scientific) med en statisk alkylated cystein modifisering og dynamisk modifikasjoner for fosforylering (serin, treonin, tyrosin), methylasjon (histidin), oksidasjon (metionin), ADP-ribosylation (arginin), og N-terminal acetylering. Påfør konservative matchende kriterier (f.eks peptid toleranse satt til 2 AMU og 1,00 fragment toleranse, proteiner inneholde minst 2 peptider bestå en Xcorr vs Charge State filter [z = 1 / x = 1,5, z = 2 / x = 2,00, z = 3 / x = 2,50, z = 4 / x = 3.00] og en sannsynlighet for p <0,05) ⁵ og manuelt inspisere MS spektra for trygg protein identifikasjon.

9. Representant Resultater:

Mannlige og kvinnelige unexercised ble murine skjelettmuskler (biceps brachii) ekstrahert og delt inn i en to-dimensjonal ^fem kart, det første nivået av muskelen sammenlignende proteomet (figur 2). Når visualiseres ved hjelp av høy oppløsning digital bildebehandling, ca 800 protein spots ble oppdaget i hver. Bruke mannlige proteomet kartet som en baseline, er det klart at det er mange steder at endring i overflod i den kvinnelige proteomet. Stedet intensitet er tiltak av endringen i protein mengder (figur 3). Den identiteter av proteinet flekker som forandrer mer enn to ganger (opp eller ned) og er statistisk signifikant (p <0,05) med en n = 5 mus, er bestemt av aminosyre sekvens analyse ved hjelp av væskekromatografi-kombinert massespektrometri. Disse resultatene viser at kvinner demonstrerer en overflod reduksjon i sukker energistoffskiftet enzymer og kreatin kinase enzym (CK) isoformer, en annen energiforsyning system i musklene. Både mennesker og dyr viser høyere mannlige serum CK ved hvile og etter trening ^9,10, men serum CK-nivåene ikke nødvendigvis korrelerer med mengden av myofibrillar avbrudd ^11,12. Dette kjønn dimorphism i den cellulære overflod av CK i murine biceps brachii muskelen er en roman finding5 og kan svare på fysiologisk forskjellige serum CK nivåer.

Tall:

g1.jpg "/>
Figur 1. En samlet skjematisk av protokollen for sammenlignende proteomikk. Protokollen er delt inn i tre grupper: prøveopparbeidelse, analyse av prøver, og, protein identifikasjon. Endene av hver av disse tre gruppene av protokoller er også rimelig pause steder, selv om de beste resultatene er høstet hvis den generelle protokollen er gjennomført uten å stoppe.

Figur 2. Sammenligning av kvinnelige murine biceps brachii protein spots i forhold til samme stedene i mannlige biceps brachii (grønne sirkler o). Spots at økt større enn eller lik to ganger hos kvinner er innringet rød (o) og de som redusert mindre enn eller lik to-fold er sirklet blå (o).

Figur 3 Gel Spot Intensitet Analyse:. X-aksen, kvinnepre-øvelse (kontroll, n = 5), Y-aksen, kvinnelige enkelt bout 0 hr tidspunkt gruppe (n = 5). Regresjonslinjen: korrelasjonskoeffisient = 0,919; skråningen = 0,976; avskjære = -0,0293. Spots over den røde linjen og under den blå linjen endre mer enn + / - to ganger.

LC / MS proteomikk metoden som presenteres her er en mest pålitelige og reproduserbare protokoll for en rask analyse av det første nivået av skjelettmuskulatur proteomet. Det gir mulighet for en rimelig hensiktsmessig sammenligning av kjønn spesifisitet. Lav overflod proteiner ville kreve en fraksjonering av muskelen prøve å fjerne så mange av de kontraktile proteiner som mulig, og dermed øke den lave overflod proteiner. Skreddersy proteomet profilen kan oppnås med ulik pH-område IPG striper og alternativ prosentvis stigning gels hvis ønskelig. Mer sensitive fluorescerende flekker eksisterer, men vi anbefaler at hvert laboratorium bestemmer lineariteten av disse flekkene i systemet. For en mer grundig analyse av protein uttrykket Dige system (to-Dimensional In-Gel elektroforese system, GE Healthcare og biovitenskap) kan brukes, men dette legger et nivå av kompleksitet til metodikk. Videre kan protokollen her beskrevet brukes med de fleste animal vev som et genom er sekvensert, samt de novo sekvensering av et protein fra en kilde, så lenge det kan løses på en to-dimensjonal gel, siden overlappende enzymatisk fragmentene kan være generert ved hjelp av høy renhet enzymer i tillegg til trypsin. Prøver fra andre vev kilder kan kreve noen endringer i utvinning metodikk, særlig hvis leter etter membran og hydrofobe proteiner, har vi imidlertid hatt gode resultater ved hjelp av denne protokollen med hjerte, lever, nyre og hjerne vev. Andre posttranslasjonelle modifikasjoner kan oppdages ved å endre massen spekteret databasen søkekriterier. I sum har vi presentert et rimelig detaljert første protokollen for proteom profilering analyse.

Ingen interessekonflikter erklært.

Vi takker Yutian Gan for bruk av figur 3. Dette arbeidet ble støttet av National Science Foundation 0420971, Smith College Blakeslee, Wilens og Holmes midler, og Howard Hughes Medical Institute.

1. Fehrenbach, E. Cellular responses to environmental stress. In Mooren, F.C. & Völker, K., Eds., Molecular and Cellular Exercise Physiology. New York, Human Kinetics, 199-217 (2005).
2. Mooren, F.C. The Cell. In Mooren, F.C. & Völker, K., Eds., Molecular and Cellular Exercise Physiology. New York, Human Kinetics, 3-18 (2005).
3. Thompson, H.S., Clarkson, P.M., & Scordilis, S.P. The repeated bout effect and heat shock proteins: intra-muscular HSP27 and HSP70 expression following two bouts of eccentric exercise in humans. Acta. Physiol. Scand. 174, 47-56 (2002).
4. McHugh, M.P. Recent advances in the understanding of the repeated bout effect: the protective effect against muscle damage from a single bout of eccentric exercise. Scand. J. Med. Sci. Sports. 13, 88-97 (2003).
5. Metskas, L.A., Kulp, M., & Scordilis, S.P. Gender Dimorphism in the Exercise-Naïve Murine Skeletal Muscle Proteome. Cell Molec. Biol. Lett. 15, 507-516 (2010).
6. Lopez, J.L. Two-dimensional electrophoresis in proteome expression analysis. J. Chromatogr. B. 849, 190-202 (2007).
7. Lowry, O.H., Rosenburg, N.J., Farr, A.L., & Randall, R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193, 265-275 (1951).
8. Smith, P.K., Krohn, R.I., Hermanson, G.T., Mallia, A.K., Gartner, F.H., Provenzano, M.D., Fujimoto, E.K., Goeke, N.M., Olson, B.J., & Klenk, D.C. Measurement of Protein Using Bicinchoninic Acid. Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).
9. Norton, J.P., Clarkson, P.M., Graves, J.E., Litchfield, P.L. & Kirwan, J. Serum creatine kinase activity and body composition in males and females. Hum. Biol. 57, 591-598 (1985).
10. Amelink, G.J., Kamp, H.H. & Bär, P.R. Creatine kinase isoenzyme profiles after exercise in the rat: sex-linked differences in leakage of CK-MM. Pflügers. Arch. 412, 417-421 (1988).
11. Kendall, B. & Eston, R. Exercise-induced muscle damage and the potential protective role of estrogen. Sports Med. 32 (2), 103-123 (2002).
12. Tiidus, P.M. Can oestrogen influence skeletal muscle damage, inflammation, and repair? Br. J. Sports Med. 39, 251-253 (2005).

0 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.