Skeletmuskulatur Køn Dimorphism fra Proteomics

Dimova, K., Metskas, L. A., Kulp, M., Scordilis, S. P. Skeletal Muscle Gender Dimorphism from Proteomics. J. Vis. Exp. (58), e3536, doi:10.3791/3536 (2011).

Gross sammentrækning i skeletmuskulatur er primært bestemt af et relativt lille antal kontraktile proteiner, men dette væv er også bemærkelsesværdigt tilpasses til miljømæssige faktorer ¹ som hypertrofi ved modstand motion og atrofi af Brug. Det derved udstiller ombygninger og tilpasninger til stressorer (varme, iskæmi, tungmetaller, mv.) ^2,3. Skader kan opstå til muskel ved en muskel kræfter, mens forlænge, ​​den såkaldte excentrisk kontraktion ^4. Den kontraktile proteiner kan blive beskadiget i en sådan anstrengelser og skal repareres, nedbrudt og / eller genopbyggede, og disse funktioner er ikke en del af kontraktile proteiner, men af ​​andre meget mindre rigelige proteiner i cellen. For at afgøre, hvilken delmængde af proteiner er involveret i forbedring af denne type skade, skal en global proteomet være etableret forud for træningen ⁵ og derefter fulgte efter den øvelse at bestemme forskellenprotein udtryk og derved fremhæve kandidat proteiner i tilpasninger til skade og dens reparation. Endvidere har de fleste studier af skeletmuskulaturen blevet gennemført på den mandlige af arterne, og dermed måske ikke er repræsentativ for kvindelige muskel.

I denne artikel vil vi præsentere en metode til at udvinde proteiner reproducerbart fra mandlige og kvindelige muskler, og adskiller dem ved to-dimensionel gelelektroforese efterfulgt af høj opløsning digital billedbehandling ^6. Dette giver en protokol for spots (og efterfølgende identificeret proteiner), der viser en statistisk signifikant (p <0,05) to gange stige eller falde, vises eller forsvinde fra kontrol stat. Disse er så fjernet, fordøjet med trypsin og adskilt af højtryks-væskekromatografi koblet til et massespektrometer (LC / MS) for protein identifikation (LC / MS / MS) ^5. Denne metode (Figur 1) kan bruges på mange væv med lidt at ingen ændringer (lever, hjerne, høret osv..).

1. Prøveforberedelse

1. Brug frisk, flash-frosset eller RNAlater-behandlede væv fra mus som udgangsmateriale. Blot væk overskydende konserveringsmiddel med en Kimwipe før du fortsætter.
2. Fjern alle sener og fascia omkring musklen og hakkekød vævet med enkelt kantet barberblade i 2 min på kølet glasplader i et kølerum (4 ° C), indtil vævet er godt hakket eller pulver. Opsaml prøven i et tareret mikrofugerør og bestemme vægten af ​​væv. Brug ikke mere end 10 mg af det væv, som din udgangsmateriale.
3. Tilsæt 45 μL ekstraktionsbuffer (8 M urea, 50 mM DTT, 4% CHAPS, 0,2% carrier amfolytter 5 / 8, 0,0002% bromophenol blå) pr 1 mg hakket væv, ved stuetemperatur. Hvis volumen er større end 350 μL, tilføje 350 μL i første omgang og homogeniseres (trin 1,4), tilsæt derefter resten af ​​bufferen for at minimere sprøjt.
4. Homogeniseres vævet syv gange med en motoriseret pestle (Kontes Corp) i 15 sekunder ved4 ° C, med to minutters afkøling på is mellem hver homogenisering.
5. Centrifugér prøverne ved 15.600 xg i 30 minutter ved 4 ° C. Gem supernatanten og måle dens volumen. Cellen vragrester pelleteret kasseres.
6. Udfældes proteinerne i supernatanten med iskolde reagenskvalitet acetone (3 gange v: v ratio). Vortex rørene i 15 sekunder. Centrifuge til 15.600 xgi 10 sekunder for at danne pellets, og resuspender i ekstraktionsbuffer med Kontes motor og polypropylen omrøring stænger (BioSpec Prod)
7. Gentag trin 1.6.
8. Enten fortsætte med protein koncentration estimering af prøverne eller opbevare dem ved -20 ° C.

2. Proteinkoncentration estimering

Brug Lowry analysen ⁷ eller BCA assay ⁸ (Pierce) Målet for omkring 4,5 mg ml ^-1.

3. Isoelektrisk fokusering

1. Fjern en ReadyStrip IPG strimmel (11 cm, pH 5-8, Bio-Rad)fra -20 ° C og lad den ligevægt på RT i 10-15 min.
2. Vortex prøven og pipetten 600-800 mikrogram (samlet volumen 200 μL) protein prøve i en lige linje på bagsiden kanten af ​​en kanal i prøven rehydrering bakken, forlader omkring 1 cm i hver ende.
3. Brug pincet, skræl off plastlåg af den IPG strimlen - sørg for at håndtere kun ender af strimler og undgå enhver kontakt med gelen. Bemærk den basale ende af The Strip og placer det på venstre side af bakken. Placer IPG stribe gel-nedad oven på prøven, undgå fældefangst bobler nedenunder. Lad det rehydrere i en time.
4. Overlay med 2,5 ml mineralsk olie (BioRad). Dæk bakken med låget, og lad den rehydrere natten over ved stuetemperatur.
5. Placer en papir væge i begge ender af fokus bakken kanal og våd hver med 10 μL Millipore vand.
6. Tag IPG strimler og hold lodret i cirka 10 sekunder afløbet olien. Blot plast backing med en Kimwipe.
7. Placer IPG stribe gel nedad og med grundlæggende ende til venstre i fokus bakken. Dæk strimmel med 2,5 ml mineralsk olie.
8. Sæt bakken ind i PROTEAN IEF celle (Bio-Rad) og programmere en 3-trins-protokollen (Tabel 1) i tilfælde af misligholdelse celle temperatur på 20 ° C, en maksimal strøm på 50 μA / strimler, og ingen rehydrering tid.

   	Spænding	Tid	Volt-Hrs	Rampe
   Trin 1	250	20 min		Lineær
   Trin 2	8.000	2,5 t		Lineær
   Trin 3	8.000		40.000	Hurtig
   Samlet		6,5 t.	40.000

   Tabel 1. Tre-trins-protokollen af ​​PROTEAN IEF celle til 11 cm IPG strimler.

9. Tag IPG strimler ud af IEF celle ved hjælp af pincet. Blot plastik beklædning med en Kimwipe og placere IPG stribe gel side opad i en ren rehydrering bakke. Du kan dække rehydrering bakken og pak det med plastfolie og opbevares ved - 80 ° C eller fortsætte.

4. SDS-polyacrylamid gel elektroforese

1. Transfer The Strip (gel opad) ind i en 11 cm ligevægt bakke.
2. Tilsæt 4 mL reduktion buffer (6 M urea, 2% SDS, 0,05 M Tris / HCl pH 8,8, 20% glycerol, 2% DTT) til kanal og faa samme bånd til 10 min med let rystende.
3. Fjern reduktion buffer, tilsættes 4 mL alkylering buffer (6 M urea, 2% SDS, 0,05 M Tris / HCl pH 8,8, 20% glycerol, 2,5% iodoacetamide) og tempereres af The Strip i 10 minutter med mild omrystning.
4. Skyl IPG stribe ved at dyppe den striP-kort i 1 X SDS kører buffer (25 mM Tris, 192 mM glycin, 0,1% SDS, pH 8,2).
5. Læg strimlen gel side op på bagplade 11 cm Kriterium præfabrikerede 10,5% -14% Tris-HCl SDS polyacrylamid gel (Bio-Rad), og skub det forsigtigt ind, så den får fuld kontakt med SDS gel; Sørg for, at ingen bobler er fanget mellem de to gel overflader.
6. Overlay de IPG stribe med 1 mL smeltede agarose-løsning (0,5% agarose, 25 mM Tris, 192 mM glycin, 0,1% SDS, bromophenol blå) og lad agarose størkne i 5 minutter.
7. Load 5 mikroliter af protein markør 10-225 kDa (USB, P / N: 76.740) i det indre såvel som molekylvægt standarder.
8. Kør gel i SDS buffer (25 mM Tris, 192 mM glycin, 0,1% SDS, pH 8,2) ved 200 V ved stuetemperatur eller i et kølerum (4 ° C) ved hjælp af bromophenol blå farvestof foran migration til at overvåge elektroforese.
9. Fjern gel fra plastik støbt og plette natten ved at ryste forsigtigt i Coomassie Brilliant BlueR-250-farvning (45,5% methanol, 45,5% dH2O, 9,0% eddikesyre, 0,25% Coomassie Brilliant Blue R-250).
10. Ryst gelen i affarves 1 løsning (45,5% methanol, 45,5% dH ₂ O, 9,0% eddikesyre) to gange i 3 timer hver, og i affarves 2 (5% methanol, 90% dH ₂ O, 5% eddikesyre) natten over. Opbevar gel i 7% eddikesyre til analyse.

5. Gel billedbehandling og analyse

1. Tag billeder af geler bruge Mængde One-software program, der driver VersaDoc Imaging System (BioRad). Beskære billedet områder ens for alle geler i dit eksperiment.
2. Læg den beskårne billeder på PDQuest 8,0 software program til at oprette et eksperiment sæt. Følg Experiment opsætningsguiden til at definere parametrene for spot påvisning og spot matchende tværs af geler. Efterse og forfine stedet matchende resultater manuelt, hvis det er nødvendigt.
3. Udføre kvantitativ og statistisk analyse af gel til at opdage matchede protein spots med TWo-fold eller højere statistisk signifikante forskelle i udtryk mellem de to gel grupper. Opret en analyse, der med disse pletter af renter og skær dem ud fra en EXQuest stedet cutter (BioRad) for trypsin fordøjelse og LC-MS-baseret protein identifikation.

6. In-gel tryptic fordøjelse

For dette trin en modificeret Pierce In-Gel Tryptic Digest Kit (# 89871X, Pierce) protokol anvendes.

1. Tilsæt 200 μL af affarvning løsning (25 mM ammoniumbicarbonat, 50% acetonitril) til gel stik. Vortex og inkuber prøverne ved 37 ° C i 30 minutter med at ryste. Fjern forsigtigt og kassér løsning.
2. Gentag trin 6.1.
3. Tilsæt 30 μL af frisklavede reducere buffer (50 mM Tris [2-carboxyethyl] fosfin, 22,5 mM ammonium bikarbonat) til rør, der indeholder gelen stik og inkuberes ved 60 ° C i 10 minutter.
4. Lad prøver at afkøle, derefter fjernes og kasseres reducere bufferen.
5. Tilsæt 30 μL af alkylering buffer (100 mM iodoacetamide, 20 mM ammoniumbicarbonat, tilberedes umiddelbart før brug i folie-indpakkede rør. Inkubér prøverne i mørke ved stuetemperatur i 1 time.
6. Fjern og kassér alkylering buffer. Vask gelen stik ved at tilsætte 200 μL af affarvning løsning til hvert rør. Inkubér prøverne ved 37 ° C i 15 minutter.
7. Fjern og kassér affarvning løsning og gentage vask.
8. Tilsæt 50 μL af acetonitril til gel stik og inkuber dem i 10 minutter ved stuetemperatur for at give dem mulighed for at skrumpe tørre, og derefter forsigtigt fjerne acetonitril.
9. Gentag trin 6,8 gang mere. Gel stykker skal se hvide og små.
10. Lad gel brikker til tørre i en Centrivap Concentrator (Labconco, Model EX1245) i 10 minutter.
11. Swell gelen brikker ved at tilsætte 10 μL af aktivt trypsin opløsning (10 ng / mikroliter trypsin, 25 mM ammoniumbicarbonat). Inkubér ved stuetemperatur i 15 minutes.
12. Tilsæt 25 μL fordøjelsen buffer (25 mM ammonium bikarbonat) til rør. Inkubér prøverne ved stuetemperatur natten over med at ryste.
13. Sonikeres prøverne i 10 minutter (Branson, bad sonicator model 2510) og spin dem ned før du fjerner bundfald til et nyt rør. Gem supernatant.
14. For yderligere at udtrække peptider, der tilsættes 10 μL af 0,1% myresyre og inkuber i 5 minutter ved stuetemperatur med at ryste. Sonikeres prøverne i 10 minutter, indsamle supernatanten og kombinere med gemte supernatant i trin 6.13.

7. Mikroskala afsaltning af peptid ekstrakter

1. Fjern ammoniumbicarbonat og andre salte i peptid ekstrakter med hjælp fra PepClean C-18 Spin kolonner (ThermoFisher) overensstemmelse med producentens anvisninger.
2. Elueres peptider to gange med 20 μL 70% acetonitril, fordamper de prøver tørre ved centrifugering i Centrivap Concentrator for 1 time og resuspenderde peptider i 10 μL 0,1% myresyre til MS analyse.

8. Protein identifikation ved HPLC-koblet massespektrometri

1. Separat 5 mikroliter af peptidet blandingen på en HPLC (HPLC) over 40 minutter, ved hjælp af en lineær 2-50% acetonitril gradient med 0,2% myresyre på et Pepswift monolitisk PS-DVB kolonne (Dionex) koblet til en Nanospray jeg source på en ion trap massespektrometer (LCQ deca XP Max, Thermo Fisher Scientific) ved en flowhastighed på 400 nL / min ved spidsen.
2. Detect peptid MS1 signaler mellem 400 til 1400 m / z og give mulighed for de 3 mest intense ion toppe at være isoleret i MS2 sekventering af CID med dynamisk udstødelse.
3. For protein identifikation, analysere peptid resultater via en Sequest mus referencedatabase søgning (BioWorks software, Thermo-Fisher Scientific) med en statisk alkylerede cystein modifikation og dynamiske ændringer til fosforylering (serin, threonin, tyrosin), methylaning (histidin), oxidation (methionin), ADP-ribosylation (arginin), og N-terminal acetylering. Anvend konservative matchende kriterier (f.eks peptid tolerancen indstillet til 2 AMU og 1,00 fragment tolerance, proteiner indeholder mindst 2 peptider bestå en Xcorr vs Charge stat filter [z = 1 / x = 1,5, z = 2 / x = 2,00, z = 3 / x = 2.50, z = 4 / x = 3.00] og en sandsynlighed på p <0,05) ⁵ og manuelt inspicere MS spektre for sikker protein identifikation.

9. Repræsentative resultater:

Mandlige og kvindelige uudnyttede, blev murine skeletmuskulatur (biceps brachii), der udvindes og opdelt i en to-dimensionelle kort ^5, første niveau af musklen sammenlignende proteom (Figur 2). Når visualiseret ved hjælp af høj opløsning digital billedbehandling, cirka 800 protein spots blev opdaget i hver. Brug af mandlige proteomet kortet som et baseline, er det klart, at der er mange pletter, at ændringen i overflod i den kvindelige proteomet. Spottet intensiteter er foranstaltninger af ændringen i proteinet beløb (Figur 3). Identiteten af ​​de protein spots at ændre mere end to gange (op eller ned), og er statistisk signifikant (p <0,05) med en n = 5 mus, bestemt er ved aminosyresekvens analyse ved hjælp af væskekromatografi koblet massespektrometri. Disse resultater viser, at kvinder viser en overflod fald i sukker energi metabolisme enzymer og i kreatinkinase enzym (CK) isoformer, et andet energiforsyningssystem i musklerne. Både mennesker og dyr vist højere mandlige serum-CK-niveauet i hvile og efter træning, ^9,10, men serum-CK niveauerne ikke nødvendigvis korrelerer med mængden af myofibrillar forstyrrelser ^11,12. Dette køn dimorphism i den cellulære overflod af CK i murine biceps brachii musklen er en roman finding5 og kan besvare fysiologisk forskellige serum CK niveauer.

Tal:

g1.jpg "/>
Figur 1. En samlet skematisk af protokollen for sammenlignende proteomics. Protokollen er opdelt i tre grupper: prøveforberedelse; analysen, og protein identifikation. Enderne af hver af disse tre grupper af protokoller er også rimelig pause steder, selv om de bedste resultater er høstet, hvis det generelle protokollen er gennemført uden at stoppe.

Figur 2. Sammenligning af kvindelige murine biceps brachii protein spots i forhold til de identiske steder i mandlige biceps brachii (grønne cirkler o). Spots, at øget større end eller lig med to gange hos kvinder er cirklede røde (o), og dem, der faldt mindre end eller lig med to gange er cirklede blå (o).

Figur 3 Gel Spot Intensitet Analyse:. X-aksen, kvindeligpre-øvelse (kontrol, n = 5), Y-akse, kvindelige enkelt Bout 0 hr tidspunkt gruppen (n = 5). Regressionslinje: korrelationskoefficient = 0,919; hældning = 0,976; opsnappe = -0,0293. Pletter over den røde streg og under den blå linje ændre mere end + / - to gange.

LC / MS proteomics metode præsenteret her er en meget pålidelig og reproducerbar protokol for en hurtig analyse af det første niveau i skeletmuskulatur proteomet. Det giver mulighed for en rimelig hensigtsmæssig sammenligning af køn specificitet. Lav tæthed proteiner ville kræve en fraktionering af musklen prøve at fjerne så mange af de kontraktile proteiner som muligt, hvilket øger den lave overflod proteiner. Skræddersy proteomet profil kan opnås med forskellige pH-området IPG strimler og suppleanter procent gradient geler, hvis det ønskes. Mere følsomme fluorescerende pletter findes, men vi anbefaler, at hvert laboratorium bestemme lineariteten af ​​disse pletter i dit system. For en mere grundig analyse af protein udtryk for Dige-systemet (to-Dimensional In-gelelektroforese system, GE Healthcare Life Sciences) kan anvendes, men dette betyder tilføjer en grad af kompleksitet til metoden. Yderligere, kan protokollen heri beskrevne kan anvendes med de fleste dyrMal væv, som et genom er blevet sekventeret, samt de novo sekventering af et protein fra enhver kilde, så længe det kan løses på en to-dimensionel gel, da overlappende enzymatisk fragmenter kan genereres ved hjælp af høj renhed enzymer ud til trypsin. Prøver fra andre væv kilder kan kræve nogle ændringer i udvinding metode, især hvis udkig efter membranen og hydrofobe proteiner, dog har vi haft gode resultater ved hjælp af denne protokol med hjerte, lever, nyre og hjerne væv. Andre post-translationelle modifikationer kan opdages ved at ændre massespektret databasen søgekriterier. Alt i alt har vi fremlagt et rimeligt detaljeret indledende protokol for proteom profilanalyse.

Ingen interessekonflikter erklæret.

Vi takker Yutian Gan for brug af Figur 3. Dette arbejde blev støttet af National Science Foundation 0420971, den Smith College Blakeslee, Wilens og Holmes midler og Howard Hughes Medical Institute.

1. Fehrenbach, E. Cellular responses to environmental stress. In Mooren, F.C. & Völker, K., Eds., Molecular and Cellular Exercise Physiology. New York, Human Kinetics, 199-217 (2005).
2. Mooren, F.C. The Cell. In Mooren, F.C. & Völker, K., Eds., Molecular and Cellular Exercise Physiology. New York, Human Kinetics, 3-18 (2005).
3. Thompson, H.S., Clarkson, P.M., & Scordilis, S.P. The repeated bout effect and heat shock proteins: intra-muscular HSP27 and HSP70 expression following two bouts of eccentric exercise in humans. Acta. Physiol. Scand. 174, 47-56 (2002).
4. McHugh, M.P. Recent advances in the understanding of the repeated bout effect: the protective effect against muscle damage from a single bout of eccentric exercise. Scand. J. Med. Sci. Sports. 13, 88-97 (2003).
5. Metskas, L.A., Kulp, M., & Scordilis, S.P. Gender Dimorphism in the Exercise-Naïve Murine Skeletal Muscle Proteome. Cell Molec. Biol. Lett. 15, 507-516 (2010).
6. Lopez, J.L. Two-dimensional electrophoresis in proteome expression analysis. J. Chromatogr. B. 849, 190-202 (2007).
7. Lowry, O.H., Rosenburg, N.J., Farr, A.L., & Randall, R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193, 265-275 (1951).
8. Smith, P.K., Krohn, R.I., Hermanson, G.T., Mallia, A.K., Gartner, F.H., Provenzano, M.D., Fujimoto, E.K., Goeke, N.M., Olson, B.J., & Klenk, D.C. Measurement of Protein Using Bicinchoninic Acid. Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).
9. Norton, J.P., Clarkson, P.M., Graves, J.E., Litchfield, P.L. & Kirwan, J. Serum creatine kinase activity and body composition in males and females. Hum. Biol. 57, 591-598 (1985).
10. Amelink, G.J., Kamp, H.H. & Bär, P.R. Creatine kinase isoenzyme profiles after exercise in the rat: sex-linked differences in leakage of CK-MM. Pflügers. Arch. 412, 417-421 (1988).
11. Kendall, B. & Eston, R. Exercise-induced muscle damage and the potential protective role of estrogen. Sports Med. 32 (2), 103-123 (2002).
12. Tiidus, P.M. Can oestrogen influence skeletal muscle damage, inflammation, and repair? Br. J. Sports Med. 39, 251-253 (2005).

0 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.