The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
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Women & Infants Hospital of Rhode Island, Alpert Medical School of Brown University
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Wang, Y., Huang, Z., Nayak, P. S., Sanchez-Esteban, J. An Experimental System to Study Mechanotransduction in Fetal Lung Cells. J. Vis. Exp. (60), e3543, doi:10.3791/3543 (2012).
यांत्रिक दोहराव साँस लेने जैसे आंदोलनों के द्वारा और द्रव बढ़ाव द्वारा utero में उत्पन्न बलों सामान्य फेफड़ों के विकास के लिए महत्वपूर्ण हैं. फेफड़ों के विकास का एक प्रमुख घटक वायुकोशीय प्रकार द्वितीय उपकला कोशिकाओं, फेफड़े surfactant की प्रमुख स्रोत का भेदभाव है. इन कोशिकाओं भी वायुकोशीय लुमेन, मेजबान रक्षा, और चोट की मरम्मत के तरल पदार्थ homeostasis में भाग लेते हैं. इसके अलावा, बाहर फेफड़ों पैरेन्काइमा कोशिकाओं को सीधे यांत्रिक वेंटीलेशन के दौरान किया जा सकता है जन्म के बाद अतिरंजित खिंचाव को अवगत कराया. हालांकि, सटीक आणविक और सेलुलर तंत्र है जिसके द्वारा फेफड़ों की कोशिकाओं को फेफड़ों के विकास को प्रभावित और फेफड़ों की चोट को बढ़ावा देने के यांत्रिक उत्तेजनाओं भावना पूरी तरह से समझ नहीं रहे हैं. यहाँ, हम एक सरल और उच्च शुद्धता प्रकार द्वितीय कोशिकाओं और fibroblasts कृंतक भ्रूण फेफड़ों से अलग विधि प्रदान करते हैं. फिर, हम इन विट्रो प्रणाली, Flexcell तनाव यूनिट में वर्णन है, भ्रूण कोशिकाओं को यांत्रिक उत्तेजना प्रदान करने के लिए, में यांत्रिक बलों का अनुकरणभ्रूण फेफड़ों के विकास या फेफड़ों की चोट. यह प्रायोगिक प्रणाली भ्रूण फेफड़ों खिंचाव उजागर कोशिकाओं में आणविक और सेलुलर तंत्र की जांच के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण प्रदान करता है. इस दृष्टिकोण का प्रयोग, हमारी प्रयोगशाला कई रिसेप्टर्स और संकेत प्रोटीन है कि भ्रूण फेफड़ों के विकास और फेफड़ों की चोट में mechanotransduction में भाग लेने की पहचान की है.
1. प्लेटों के ईसीएम प्रोटीन के साथ कोटिंग
2. भ्रूण कृंतक फेफड़ों प्रकार द्वितीय उपकला कोशिकाओं का अलगाव
अलगाव से पहले दिन विभिन्न आकार नायलॉन autoclaved और तैयार meshes के साथ स्क्रीन कप है.
3. भ्रूण कृंतक फेफड़ों fibroblasts का अलगाव
4. फेफड़ों की कोशिकाओं के यांत्रिक उत्तेजना प्रदान करने के लिए प्रयोगात्मक प्रणाली
5. प्रतिनिधि परिणाम
चित्रा 1 चित्रा 2 E18 भ्रूण माउस प्रकार द्वितीय कोशिकाओं के शो प्रतिनिधि चरण विपरीत तस्वीरें इस पांडुलिपि में वर्णित तकनीक का उपयोग अलग है.
चित्रा 3 दर्शाता है कि यांत्रिक तनाव भ्रूण प्रकार द्वितीय उपकला कोशिकाओं का उपयोग कर एक मार्कर के रूप में प्रोटीन - सी surfactant के भेदभाव को प्रेरित करता है.
चित्रा 1 प्रतिनिधि.resentative तस्वीर चरण विपरीत भ्रूण प्रकार द्वितीय कोशिकाओं के clumped उपस्थिति दिखाने के अलगाव के बाद लिया है.
चित्रा 2. E18 भ्रूण प्रकार द्वितीय उपकला कोशिकाओं के रूप में Bioflex laminin साथ लेपित प्लेट पर यहाँ और मढ़वाया वर्णित अलग थे. तस्वीर अगले दिन लिया गया था बाद गैर फैला कोशिकाओं paraformaldehyde में में तय किया गया. कक्षों की पवित्रता से 90 के लिए निर्धारित किया गया था ± उपकला कोशिका और सपा सी के लिए आकारिकी Immunostaining की सूक्ष्म विश्लेषण द्वारा 5%.
चित्रा 3 भ्रूण प्रकार द्वितीय उपकला कोशिकाओं. 40 चक्र / 16h के लिए मिनट में 5% चक्रीय तनाव से अवगत कराया गया एक) surfactant प्रोटीन सी (सपा सी) mRNA के दिखा रहा है कि तनाव प्रकार द्वितीय सेल भेदभाव विभिन्न substrates के ईसीएम का उपयोग कर लाती अभिव्यक्ति के उत्तरी धब्बा. . + / - लक्षण जोखिम या नहीं प्रतिनिधित्व करते हैंप्रशिक्षित क्रमशः. डेटा मतलब के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं + / - SEM, n = 3, * पी <0.05) बी प्रतिदीप्ति immunocytochemistry यांत्रिक तनाव को सपा सी भ्रूण प्रकार द्वितीय कोशिकाओं में प्रोटीन (हरा) स्तर उजागर या नहीं (नियंत्रण) का प्रदर्शन छवियों. यह नाभिक DAPI (नीला) के साथ counterstained गया. बार, तीन प्रयोगों से 10 माइक्रोन. सी) पश्चिमी धब्बा परिणाम है कि यांत्रिक खिंचाव दिखा सपा - सी प्रोटीन बढ़ जाती है. N = 3 * पी <0.05.
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इस पांडुलिपि में, हम एक भ्रूण प्रकार द्वितीय उपकला कोशिकाओं और fibroblasts अलग और यांत्रिक उत्तेजना Flexcell तनाव उपकरण का उपयोग करने के लिए उन्हें बेनकाब करने की विधि का वर्णन करता है. उपकला कोशिकाओं की भेदभाव 1,2 का आकलन और रिसेप्टर और संकेत खिंचाव 3-9 से सक्रिय रास्ते अध्ययन हम इस तकनीक का इस्तेमाल किया है. इसके अलावा, इस विधि को भी करने के लिए सेल यांत्रिक 10,11 चोट से प्रेरित प्रतिक्रियाओं की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Collagenase के साथ फेफड़े के ऊतकों की पाचन प्रक्रिया पर आधारित है. यह पाचन के बाद एक साथ पेड़ों का झुरमुट प्रकार द्वितीय कोशिकाओं की प्रवृत्ति का लाभ लेता है. इस तकनीक का प्रदर्शन करते हुए महत्वपूर्ण कदम नख़रेबाज़ ऊतक हैं अच्छी तरह से फेफड़े की पाचन और अच्छी तरह से धोने पर 30 और 15 माइक्रोन meshes के गैर फ़िल्टर कोशिकाओं को गैर उपकला कोशिकाओं का निस्पंदन सुविधा और इसलिए प्रकार द्वितीय कोशिकाओं का अधिक से अधिक शुद्धता को प्राप्त करने की सुविधा .
हमारी प्रयोगशाला मीटर का उपयोग करता हैembranes कोलेजन या laminin तहखाने झिल्ली के ईसीएम संरचना अनुकरण के साथ लेपित. हालांकि, जब कोशिकाओं को 20% के बढ़ाव को उजागर कर रहे हैं, कोशिकाओं सब्सट्रेट से खिंचाव के दौरान अलग और fibronectin एक वैकल्पिक सब्सट्रेट के रूप में विचार किया जाना चाहिए हो सकता है.
एक अन्य महत्वपूर्ण विचार के लिए 100% सेल monolayers के संगम खिंचाव से पहले दिया है कि इस सेल करने वाली सेल के बजाय सेल मैट्रिक्स संपर्क संपर्क को बढ़ावा देने और इसलिए हो सकता है कोशिकाओं को 'अर्थ' द्वारा स्थापित बढ़ाव का प्रतिशत नहीं हो सकता है, से बचने के लिए है प्रोटोकॉल.
Flexcell तनाव यूनिट एक निर्वात का उपयोग करता है एक लचीला नीचे संस्कृति थाली ख़राब है. निर्वात केंद्रीय सिलेंडर पद के आवेदन पर प्रत्येक झिल्ली फैला है, झिल्ली सतह भर में एक समान रेडियल और परिधीय तनाव पैदा और इसलिए vivo में स्थितियों में equibiaxial बढ़ाव, प्रदान करने के लिए इसी तरह (कार्टून, योजनाबद्ध सिंहावलोकन वीडियो देखने के लिए, अनुमति के साथ, डॉ. ए जे banes फ्लेक्ससेल इंटरनेशनल कॉर्पोरेशन, www.flexcellint.com). इस प्रणाली को निर्दिष्ट तनाव आहार द्वारा एक परिभाषित, नियंत्रित स्थिर या चक्रीय विरूपण प्रदान करता है. भ्रूण साँस लेने की गतिविधियों की नकल 40-60 चक्र / मिनट पर एक चक्रीय 2.5-5% खिंचाव के बीच खिंचाव आहार लागू किया जाता है. बढ़ाव के प्रतिशत पर समझौता नहीं है कि भ्रूण साँस लेने के दौरान भ्रूण फेफड़ों होश. कुछ लेखकों का मानना है कि 5% बढ़ाव उपयुक्त 12 है जबकि अन्य जांचकर्ताओं का कहना है कि 2.5% और vivo में 13,14 स्थितियों में की प्रतिनिधि है. करने के लिए लगातार बढ़ाव दबाव के अनुकरण के लिए, एक 2.5% निरंतर खिंचाव प्रोटोकॉल प्रयोग किया जाता है. फेफड़ों की चोट की नकल करने के लिए, 20% 40 चक्र / मिनट में चक्रीय खिंचाव प्रयोग किया जाता है. इस तकनीक के संभावित सीमाओं लोड हो रहा है पोस्ट करने के लिए परिधीय झिल्ली के क्षेत्र में वरीयता प्राप्त कोशिकाओं के विरूपण की वृद्धि शामिल हैं. एक और सीमा असमर्थता बढ़ाव से अधिक 15-20% प्रदान करने के लिए अगर एक उच्च चक्र दर प्रयोग किया जाता है (40 चक्र / मिनट के ऊपर है).
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ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
NIH अनुदान HD052670 द्वारा समर्थित है.
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Collagenase 1 | Sigma-Aldrich | C0130 | |
| Collagenase 1A | Sigma-Aldrich | C9891 | |
| Chicken serum | Sigma-Aldrich | C5405 | |
| Screen cups | Sigma-Aldrich | CD1-1KT | |
| Syringe filters | Fisher Scientific | 09-754-25 | |
| 100 micron nylon mesh | Small Parts, Inc. | CMN-100-D | |
| 30 micron mesh | Small Parts, Inc. | CMN-30-D | |
| 15 micron mesh | Dynamic Aqua-Supply Ltd. | NTX15 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Collagen-1 | Collagen Biomed | PC0701 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Vitronectin | Sigma-Aldrich | V-0132 | |
| Elastin | Sigma-Aldrich | E-6402 | |
| Bioflex plate | Flexcell International | BF-3001U | Uncoated |
| Flexcell Strain Unit | Flexcell International | FX-5000 |
