诱导培养的交感神经元的树突状增长

1。培养基的制备（C2的介质）

1. 中列出的顺序，添加以下，无菌的，一次性的500毫升三角瓶：

   量	元件	终浓度
   第190笔资料毫升	DMEM培养基（低糖）	N / A
   10毫升	脂肪酸免费BSA（DMEM培养液20mg/mL时）	50微克/毫升
   2.8毫升	L-谷氨酰胺	1.4毫米
   4毫升	胰岛素/转/硒（100X）	胰岛素10微克/毫升5.5微克/毫升转38.7纳米硒
   0.4毫升	神经生长因子（125微克/毫升）	100毫微克/毫升
   200毫升	火腿F-12	N / A

2. 涡流轻轻ţO混合，分装10毫升，每管17×100无菌单元帽管。
3. 贮存于-80°C间
4. 重要事项：
   • 立即在使用前要解冻的NGF。
   • 前aliquoting NGF原液，预涂内墙组织培养塑料与血清蛋白吸管以减少NGF的坚持塑料。最简单的方法是要吸取的DMEM培养液的混合物，含有牛血清白蛋白的几次。 NGF的管冲洗几次与培养液混合物。
   • 新增的F-12最后，因为自由半胱氨酸可能会破坏胰岛素的二硫键。
   • 不冻结在体积大于10毫升，因为投诉警察课₄晶体可能形成
   • 不要冻结解冻C2的介质的2倍以上。

2。玻片的制备

1. 我们已经发现只精致的德国盖玻片工作在本协议一致（见表1推荐的源目录编号）。
2. 聚四氟乙烯（PTFE或聚四氟乙烯）盖衬垫（费舍尔目录＃09-911-765），加入75-100毫升70％硝酸至300毫升的玻璃标本瓶。
3. 戴手套，下降一成硝酸溶液盖玻片。补充足够的盖玻片上的罐子底部厚厚的一层不超过2-3盖玻片。
4. 轻轻摇晃容器，在室温轨道摇床集不超过185 RPM为6-8小时，盖玻片。
5. 在通风柜工作，精心调迁酸和处置根据当地的法律法规。超纯组织培养级水冲洗一次盖玻片，再加入75-100毫升水的容器。的盖玻片可能被漂洗多次，如果水变得浑浊。轻轻摇晃在室温下一套不超过185转的轨道摇床过夜。
6. 重复共3天以上的硝酸/组织培养级水每天序列。
7. 倒出决赛组织培养级水和补充足够的丙酮，几乎涵盖的盖玻片。
8. 倒出丙酮和妥善处理。
9. 盖玻片转移到150毫米的玻璃培养皿。补充足够的丙酮，几乎涵盖盖玻片。确保在单层盘的盖玻片。
10. 允许丙酮在通风柜一夜之间蒸发。
11. 在180°C时为1.5小时消毒烘干烤箱烘烤盖玻片。

3。编制文化盖玻片

1. 解剖前的一天，加1盖玻片（如上所述准备）以及每24孔组织培养板使用无菌技术。每孔加入200μL无菌聚-D-赖氨酸溶液（100毫克/毫升在0.5 M Tris缓冲液，pH值8），并储存在4°C过夜板。
2. 一天的清扫，最好开始前的清扫，吸聚-D-赖氨酸的解决方案，并从每口井，每口井的5倍洗净用无菌组织培养级水。
3. 200μL低血糖的DMEM培养液添加到每个板块和商店在37°C间孵化。约1小时，前电镀细胞，去除低血糖的DMEM培养液，每孔加250μLC2的介质。商店板在37℃下5％的CO _2，直到细胞准备是镀金。

4。颈上神经节的解剖和隔离

1. 交感神经元的分离培养分离的颈上神经节从产前收获（上海建工）（胚胎19-21天）幼鼠通常准备，因为有较少的神经胶质细胞。然而，这个相同的协议，可以成功地用于产后早期（1〜3天）的幼鼠或围产期小鼠幼仔。
2. 安乐死通过CO ₂吸入孕鼠。剃腹部皮肤用70％乙醇。在无菌条件下取出子宫角和子宫角放置在无菌的150毫米培养皿。避免剥离期间损坏的肠子或其他内脏器官大坝。
3. 培养皿放置到冰锅麻醉胚胎幼仔，幼仔。解剖胚胎的子宫角和羊膜。切断脊髓肩下沿中线小狗安乐死的小狗。这也切断腔静脉，从而降低了颈动脉出血在解剖的SCG。子宫角的一次解剖，在无菌莱博维茨的L-15培养基辅以青霉素和链霉素（或任何空气缓冲介质）的地方胚胎。
4. 与Sylgard半满150毫米培养皿的胚胎放在自己的背上。使用无菌20号针头，针的胸部和头部，轻轻hyperextending脖子上，这有利于解剖的SCG。
5. 使沿颈部正中切口在揭示颌下腺的锁骨水平。取下腺体使用罚款钳（ñO。 4。 5杜蒙）暴露肌肉层。
6. 使用罚款钳切断胸锁乳突肌锁骨附近。然后轻轻抬起和肩胛舌骨肌切开气管旁。此肌肉非常薄，所以要避免切割得太深，以避免底层的颈动脉撕裂和SCG。一旦删除这些肌肉层，颈动脉和迷走神经的应该是清晰可见。
7. 在SCG位于颈动脉分叉以下。使用罚款钳（第4号或5号），钝性解剖颈动脉双方组织了揭露节。用细镊子2，把握颈动脉的正上方，下方的SCG延髓和尾两端，分别删除的颈动脉，躺在以上SCG节以及在SCG本身。结状神经节，位于沿着这个发展阶段的上海建工，很可能也将在这一步中删除。结状神经节可以identifie其圆形的形状和大迷走神经从投影。这在于沿颈内动脉的分支之一。相比之下，上海建工杏仁状，在于直接下颈动脉分叉。放入无菌的35毫米文化菜含有L - 15培养基和抗生素的解剖组织。从所有幼仔进展到下一个步骤之前，上海建工。
8. 用细镊子，轻轻分开颈动脉和删除的任何其他组织在解剖的上海建工（尤其是迷走神经结状神经节）。用细镊子从节胶囊。这大大降低了文化中的非神经细胞的数目。神经节转移到另一个无菌的35毫米的菜，含L-15中。
9. 游离在SCG，删除的L-15中型和替换（终浓度为1毫克/毫升）2毫升胶原酶/ Dispase酶中的钙和镁汉克的平衡盐溶液（终浓度为5毫克/毫升）。 incubaTE 37°C时为40分钟。
10. 在SCG转移到无菌的15毫升锥形离心管，使量高达10毫升的L-15与BSA（终浓度为1-2毫克/毫升）的补充。在室温下离心5分钟，在200×Ğ。弃上清，再一次用L-15的补充与BSA。
11. 第二次洗涤后，删除所有的L-15和悬浮节〜2毫升的C2培养基。磨碎的细胞，用火抛光尖端弯曲吸管，确保，移液器涂BSA/L15前研磨，以最大限度地减少细胞粘到玻璃。磨碎轻轻的3-4倍。让大的团块，解决约1分钟，细胞悬液转移到15毫升锥形管。添加更多的C2媒体余下的上海建工和磨碎。让团块定居后，将细胞悬液从第二研磨后的第一次研磨收集的。重复此过程数次，直到该节主要是游离。 ðiscard第四研磨后的任何剩余的团块。
12. 从一个一窝幼鼠（一般为12-16幼仔）为细胞分离，使培养基中的细胞悬液总量8-10毫升加入额外C2的介质。用吸管轻轻悬浮细胞，取出一个小等分，以确定细胞密度。调整量达到2倍的文化所需的细胞密度，然后，一定要保持悬浮，分装250毫升细胞悬液，每孔细胞的细胞悬液。对于枝晶生长形态的研究，我们通常在低密度板细胞在24孔板（〜5×10 ⁴细胞，每口井）。
13. 我们的实验室孵化SCG的文化在玻璃干燥器，而不是直接在_二氧化碳培养箱。我们这样做是因为无血清培养基中生长的交感神经元略高CO ₂浓度（约6.5％）执行。此外，我们不使用抗生素在OUR媒体似乎因为它抑制神经轴突生长和维持在干燥器的文化，如果它在发展文化的一个子集，以尽量减少污染扩散。使用这个系统，我们经常保持长达8个星期的上海建工文化。镀后，上海建工的文化放在瓷无菌水含在底部的玻璃干燥器干燥器板。约120毫升的CO ₂注入干燥器前封它关闭，并放入一个孵化器集整个干燥器35.5°C。

5。文化喂养和保养

1. 文化一般喂食，每周3次，电镀后24小时内发生的第一次媒体交流。使用无菌弯尖吸管，轻轻收回约一半，每口井的媒体。用干净的无菌弯尖吸管，更换新鲜的C2移除介质的体积。
2. 为了消除从文化的非神经细胞，抗有丝分裂剂细胞色素osine D-阿糖（Ara-c等，终浓度为1-2微米），通常被添加到在第一次媒体交流的培养基中，48小时（如，24小时后电镀）。这Ara-c等的浓度通常是足以消除所有非神经细胞。如果需要额外的ARA-C治疗，它的建议，这些被做了所有其他的喂养，以尽量减少对神经元的毒性作用。

6。诱导与基底膜或者BMP-7的枝晶生长

1. 诱导树突状增长，基底膜或BMP-7添加到文化非神经细胞已被淘汰后，在文化的ARA-C水平显着降低。通常情况下，我们添加基底膜或BMP-7 在体外培养基上的第5天，但可以通过基底膜或在任何时间点在体外添加BMP-7诱导树突状增长。基底膜或BMP-7添加到C2的媒介和文化送入如上所述。
2. 基底膜和BMP诱导的树突状增长是时间和浓度依赖性。极大的影响，基底膜被添加到C2在终浓度为50-75微克/毫升; BMP-7在终浓度为50毫微克/毫升的C2培养基。基底膜浓度大于100微克/毫升或BMP-7浓度大于100 ng / ml时已经注意到造成神经毒性。树突状进程（形态学标准确定），成为明显的基底膜或BMP-7的最大有效浓度初步接触后约48小时。诱导树突生长健壮，文化喂养与BMP-7包含在每次喂养的介质。已取得相同的结果，使用^20,21可比浓度骨形态发生蛋白2，4，5和6。

7。 BMP-7-诱导的树突状生长的免疫组织化学分析

1. 当树突状树枝状的期望的程度已经达到了，文化是固定的，用4％多聚甲醛在0.1 M磷酸缓冲。最好的固定是chieved由4％多聚甲醛代替井一半的中等和重复上述步骤3-5倍，超过10-15分钟。
2. 漂洗文化取代一半的4％多聚甲醛磷酸盐缓冲液（PBS）和重复这一步骤三次超过10 - 15分钟。
3. 删除所有的PBS在室温下5分钟通透细胞添加200微升0.1％的Triton的PBS X-100的每口井。
4. 删除愿望TRITON解决方案，并添加200μL，每口井的阻断缓冲液（PBS 3-5％BSA和1％山羊血清补充）。孵育室温为20-30分钟。
5. 取出阻塞的缓冲区，并在封闭液中添加的主要抗体，微管相关蛋白2（MAP2）在1:2000稀释 - 1:5000。过夜室温或4°C孵育1小时的文化
6. 删除主要的抗体溶液，洗超过15分钟的文化，在室温下用PBS三倍。
7. 在PBS稀释的第二抗体孵育培养补充室温在黑暗中，用1％的牛血清白蛋白在1-2小时。
8. 删除二级抗体溶液，并用PBS洗3次超过10-15分钟，在室温在黑暗中的文化。
9. 山玻璃盖玻片滑动细胞面朝下，在适当的pH值在水安装介质中二次抗体标记的荧光染料。在室温下保持的幻灯片，在一夜之间让安装介质干燥。商店幻灯片在4°C，直到成像。
10. 允许幻灯片前成像室温平衡。获得使用相衬显微镜萤光配备的荧光图像。通常情况下，整个一个单一的神经元的树突状乔木可以使用20X的目标和适当的过滤器捕获。

8。代表结果

脱离围产期RA上海建工交感神经元TS和生长在血清和神经节神经胶质细胞的情况下未能扩大MAP2的的阳性进程（图1），而是通常延长只有一个单一的轴突过程^14,15。 BMP-7（图1）或基底膜暴露诱导形成的树突^17,18形态学，生化和功能的标准，以满足众多的进程。基底膜或BMP-7枝促进活动是浓度和时间依赖性^17,18,20。最大的枝晶生长的观察，使用浓度的基底膜之间的50和75微克/毫升或BMP-7 30至100毫微克/毫升，半最大效应通常是在BMP-7〜2毫微克/毫升的浓度观察。然而，在枝晶生长的显着变化，可以检测BMP-7低浓度高达300皮克/毫升。树突状基底膜或BMP-7的反应是相对缓慢，与<50％的神经元，形成了暴露后24小时内第二个过程要么枝蔓-P romoting代理。然而，最初的BMP-7曝光后3天之内，几乎所有的神经元的响应，以最大限度地有效基底膜或BMP-7浓度。每个神经元的树突的数量继续增加BMP-7的连续曝光，大多数发生变化，在第一个10天的治疗。 4周后，BMP-7治疗神经元通常有6-8主树突，表现出二级，三级和树突分支甚至四级^17。树突状乔木的增加发生在轴突生长中的任何重大变化的情况下，可比树突状反应，可引起类似浓度骨形态发生蛋白2，4，5或6 ^20,21。树突生长也引起合作培养的交感神经元，与内源性神经节神经胶质细胞^15,22;然而，树突的反应是在这些条件下慢得多。

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图1。BMP-7促进培养的交感神经元的树突状增长 。非神经细胞的SCG的第2天48小时开始在体外的治疗与反分裂的文化被淘汰。 体外培养第5天开始，治疗要么控制介质（A）或补充BMP-7在50纳克/毫升（二）中等文化。在体外（骨形态发生蛋白治疗后5天）11天，文化与单克隆抗体免疫组化染色对微管相关蛋白，蛋白质主要存在于树突和神经元胞体。作为代表性的荧光显微照片显示，控制条件下生长的神经元缺乏树突MAP-2阳性树突过程（一）缺乏证明;相比之下，神经元暴露BMP-7（二）通常有几个锥形地图-2阳性树突。

这种模式的优点包括：（一）文化是一个没有其他细胞类型^17,23交感神经元的同质人口组成;（二）交感神经神经生长因子的要求建立的，它允许使用工作定义和界定媒体的各种媒介，与基板增长和维持交感神经元^23（三）在这些文化中的神经元统一回应基底膜，BMP-7和民进党的其他骨形态发生蛋白的树突促进活动60A亚科^17,18,20,21;及（d）基底膜或BMP诱导的树突形成细胞的存活或轴突生长^17,18变化的情况下发生的。这种模式使树突生长时被触发的实验控制，这使得它可能获得的神经元同步的人口在不同阶段的树突状增长，如，期间紧接小学dendr的树突的形成，itogenesis（初步形成初级树突）在树突状成熟的后期阶段。该模型的最显着的限制，包括RNA和蛋白质可以从一个单一的垃圾，这可能会限制生化研究，和一些困难，在操纵基因表达的典型解剖的数量有限。在基因表达在初级神经细胞培养技术的最新进展迅速克服后者的缺点。有成功应用脂质体给药系统，核转染，腺病毒载体培养的交感神经元的出版物报告。报道的转染效率相对较低（一般为10-20％，脂质体或核转染和病毒感染高达30-50％不等），这是基于对单个细胞分析，形态分析，如端点足够的，但可能许多生化终点的问题。

因素THAt可以干扰与BMP诱导培养的交感神经元的树突状增长，包括在一个非常高细胞密度培养的神经元和包括血清的培养基。而高密度衰减BMPs的是不知道的枝促进活动的原因，很可能，血清抑制这种活动，因为BMPs的如饥似渴地结合血清蛋白。有趣的是，血清本身具有弱枝促进活动中培养²⁴交感神经元，和我们的初步数据表明，这一活动是由介导的骨形态发生蛋白，这是目前在大多数如果不是所有的商业血清。骨形成蛋白是在基底膜也出席了会议，并有可能调解枝促进活动。第三个因素，可以影响BMPs的枝促进活动，是不恰当的处理和储存骨形态发生蛋白。不要存放在BMP储备溶液浓度低于0.1毫克/毫升。重要的是不要让BMP股票或工作的解决方案变得非常基本的，我们建议BUF用来稀释股票方案的联邦政府雇员退休制度的pH为4.5±0.05。混合所有的解决方案之前aliquoting大力但不那么积极，泡沫解决方案，只用聚丙烯管，因为BMPs的往往坚持到其他塑料。因为温度循环是足以摧毁BMP-7的活动，不要存放在有自动除霜功能的冷冻等分。强烈建议骨形态发生蛋白的解决方案被保存在-80°C和，冷冻解冻尽量减少（我们不冻结，解冻的2-3倍以上）。类似的预防措施，应在处理基底膜。此外，它建议，基底膜慢慢解冻4°C。基底膜不会诱发树突生长时，用于预涂基材镀神经元前;添加到培养基中建立了神经细胞培养¹⁸时，它是唯一有效的。