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 JoVE Immunology and Infection

Diagnostic de la tuberculose pulmonaire avec le Xpert MTB / RIF test

1, 2

1Institute for Infectious Diseases, University of Bern, 2MCL Laboratories Inc.

 

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Cite this Article: Diagnostic de la tuberculose pulmonaire avec le Xpert MTB / RIF test

Bodmer, T., Ströhle, A. Diagnosing Pulmonary Tuberculosis with the Xpert MTB/RIF Test. J. Vis. Exp. (62), e3547, doi:10.3791/3547 (2012).

Abstract: Diagnostic de la tuberculose pulmonaire avec le Xpert MTB / RIF test

La tuberculose (TB) due à Mycobacterium tuberculosis (MTB) demeure un problème majeur de santé publique: l'infection touche jusqu'à un tiers de la population mondiale 1, et près de deux millions de personnes sont tuées par la tuberculose chaque année 2 L'accès universel à haute qualité. , centrée sur le patient un traitement pour tous les patients tuberculeux est souligné par la Stratégie OMS Halte à la tuberculose. 3 La détection rapide des VTT dans les échantillons respiratoires et les traitements médicamenteux en fonction des résultats des tests de résistance des médicaments fiables sont une condition préalable à la mise en œuvre réussie de cette stratégie. Cependant, dans de nombreux domaines du monde, diagnostic de la tuberculose repose toujours sur insensibles, mal standardisés des méthodes de microscopie des expectorations. Dépistage de la tuberculose inefficace et l'émergence et la transmission de souches de M. tuberculosis résistantes aux médicaments de plus en plus en péril les activités mondiales de lutte antituberculeuse. 2

Un diagnostic efficace de la tuberculose pulmonaire nécessite la disponibilité - à l'échelle mondiale - du standardized, faciles à utiliser, robuste et des outils de diagnostic qui permettent la détection directe à la fois du complexe M. tuberculosis et la résistance aux antibiotiques clés, tels que la rifampicine (RIF). Ce dernier résultat peut servir de marqueur pour multirésistante VTT (MDR TB) et a été signalée dans> 95% des isolats de TB-MR. 4, 5 La disponibilité rapide des résultats de test fiables est susceptible de se traduisent directement par la gestion des patients de son des décisions qui, en fin de compte, permet de guérir le patient et briser la chaîne de transmission de la tuberculose dans la communauté. 2

Cepheid (Sunnyvale, CA, USA) Xpert MTB / RIF dosage 6, 7 répond aux exigences décrites ci-dessus d'une manière remarquable. Il s'agit d'un test d'amplification nucléique acides pour 1) la détection de l'ADN complexe M. tuberculosis dans les crachats ou dans les sédiments de crachats concentrés, et 2) la détection du Rif associées à la résistance des mutations du gène rpoB 8 Il est conçu pour une utilisation avec Cepheid GeneXpert Dx. e systèmeau intègre et automatise le traitement des échantillons, l'amplification d'acide nucléique, et la détection des séquences cibles en utilisant PCR en temps réel et de la transcriptase inverse PCR. Le système se compose d'un instrument, un ordinateur personnel, lecteur de codes barres, et le logiciel préchargé pour l'exécution des tests et l'affichage des résultats. 9 Il emploie à usage unique jetables Xpert MTB / RIF cartouches qui contiennent des réactifs de PCR et d'accueillir le procédé PCR. Parce que les cartouches sont autonomes, la contamination croisée entre les échantillons est éliminée. 6 actuelles nucléiques méthodes d'amplification des acides utilisés pour détecter VTT sont complexes, de main-d'œuvre, et techniquement exigeant. Le Xpert MTB / RIF test a le potentiel d'apporter standardisé, sensible et très spécifique des tests de diagnostic pour la tuberculose et la résistance aux médicaments à l'universel l'accès au point de milieux de soins 3, à condition qu'ils soient en mesure de se le permettre. Afin de faciliter l'accès, la Fondation pour l'innovation en matière de Nouveaux Diagnostics (FIND) a négocié signifiréductions de prix dévers. Les prix actuels TROUVEZ-négociés, ainsi que la liste des pays éligibles pour les rabais, sont disponibles sur le Web 10.

Protocol: Diagnostic de la tuberculose pulmonaire avec le Xpert MTB / RIF test

Standard 2 des Normes internationales pour la tuberculose Etats soins que tous les patients suspects de tuberculose pulmonaire doivent soumettre au moins deux échantillons d'expectoration pour examen bactériologique. Lorsque cela est possible, au moins un début de matinée échantillon doit être obtenu, comme des crachats recueillis à cette époque a le rendement le plus élevé. 11 Le Xpert MTB / RIF dosage peut être appliquée à des échantillons de crachats ou dans les sédiments de crachats concentrés préparés à partir de crachats induits ou expectoré qui sont . soit bacilles acido-résistants (BAAR) à frottis positif ou négatif de 6, 12, 13 L'essai est conçu pour être utilisé avec des échantillons provenant de patients pour lesquels il est de suspicion clinique de tuberculose pulmonaire qui ont: 1) pas reçu un traitement anti-tuberculeux, 2 ) avait moins de 7 jours de traitement, ou 3) n'ont pas reçu un traitement dans les 60 derniers jours. Notez qu'il ne doit pas être utilisé pour surveiller les effets de 7 pharmacothérapie parce que l'ADN bactérien peut persister après le traitement antimicrobien.

1. Les échantillons expectorations

Note: Le processus que comme de nombreux spécimens à la fois, car il ya GeneXpert système DX modules disponibles pour exécuter le test!

  1. Étiquetez chaque Xpert MTB / RIF cartouche avec l'ID de l'échantillon correspondant.
  2. Transférer 1,0 ml expectoré crachats à une conique, avec bouchon à vis tube à l'aide d'une pipette de transfert stérile. En variante, le spécimen peut être traité dans l'original étanche récipient de collecte des expectorations.
  3. Ajouter 2,0 ml de réactif Xpert échantillon MTB / RIF (2:1, v / v) à l'expectorations aide d'une pipette de transfert stérile.
  4. Replacez le couvercle et secouer vigoureusement le tube 10-20 Fois. Sinon, le mélange peut être vortex (30 sec).
  5. Laisser le tube de se tenir debout pendant 5 min à température ambiante.
  6. Agiter vigoureusement le tube 10-20 fois. Vous pouvez également utiliser un vortex (30 sec).
  7. Laisser le tube de se tenir debout pendant 10 min à température ambiante.
  8. Inspectez les spécimens: Les échantillons doivent être liquéfié sans grumeaux visibles de crachats.

2. Les sédiments concentrés

Note: Le processus que comme de nombreux spécimens à la fois qu'il ya de GeneXpert système DX modules disponibles pour exécuter les tests!

  1. Étiquetez chaque Xpert MTB / RIF cartouche avec l'ID de l'échantillon correspondant.
  2. Transfert de 1,5 ml de réactif Xpert échantillon MTB / RIF à une conique, avec bouchon à vis tube à l'aide d'une pipette de transfert stérile.
  3. Ajouter au moins 0,5 ml sédiments concentrée sur le tube de réactif contenant l'échantillon à l'aide d'une pipette de transfert stérile.
  4. Replacez le couvercle et secouer le tube de vigorously 10-20 fois. Vous pouvez également utiliser un vortex (30 sec).
  5. Laisser le tube de se tenir debout pendant 5 min à température ambiante.
  6. Agiter vigoureusement le tube 10-20 fois. Vous pouvez également utiliser un vortex (30 sec).
  7. Laisser le tube de se tenir debout pendant 10 min à température ambiante.
  8. Inspectez les spécimens: Les échantillons doivent être liquéfié sans grumeaux visibles de crachats.

3. Chargement de la Xpert MTB / RIF Cartouche

Remarque: Commencer le test dans les 30 minutes de l'ajout de l'échantillon de la cartouche!

  1. Vérifiez les étiquettes sur le VTT Xpert / FRR cartouche et l'ID de l'échantillon.
  2. Ouvrez le couvercle de la cartouche.
  3. Utilisation de la pipette de transfert stérile fourni, aspirer l'échantillon liquéfié dans la pipette de transfert jusqu'à ce que le ménisque est au-dessus de la marque minimum et transférer l'échantillon dans l'orifice ouvert de la Xpert MTB / RIF cartouche.

Note:Distribuer lentement afin de minimiser le risque de formation d'aérosols!

  1. Fermez le couvercle de la cartouche.

4. Démarrage du test

Remarque: Avant de commencer le test, s'assurer que le système GeneXpert Dx est équipé du logiciel GX2.1, et le Xpert MTB / RIF dosage est importé dans le logiciel 9!

  1. Allumez l'ordinateur, puis allumez l'instrument GeneXpert Dx.
  2. Sur le bureau Windows, double-cliquez sur l'icône de raccourci GeneXpert Dx.
  3. Connectez-vous au logiciel du système GeneXpert Dx en utilisant votre nom d'utilisateur et mot de passe.
  4. Dans la fenêtre GeneXpert système DX, cliquez sur Créer un test. La cartouche de balayage de code à barres boîte de dialogue apparaît.
  5. Dans la zone ID de l'échantillon, scanner ou tapez l'ID de l'échantillon.
  6. Scannez le code à barres sur le Xpert MTB / RIF cartouche. La fenêtre Test Créer s'affiche.
  7. Cliquez sur Démarrer le test
  8. Ouvrez la porte du module instrument avec la lumière clignote en vert, et de charger la cartouche.
  9. Fermez la porte. Le test démarre et le voyant cesse de clignoter et reste constamment vert. Lorsque le test est terminé, la lumière s'éteint.
  10. Attendez jusqu'à ce que le système libère le verrou de la porte à la fin de la course, puis ouvrez la porte du module et retirez la cartouche.
  11. Éliminer les cartouches usagées dans les conteneurs de déchets appropriés conformément aux pratiques standard de votre institution.

5. Les résultats représentatifs

Chaque Xpert MTB / RIF cartouche comprend des réactifs pour la détection de complexe MTB et la résistance RIF ainsi que d'un contrôle du traitement de l'échantillon (CPS) pour contrôler le traitement adéquat des bactéries cibles et de surveiller la présence de l'inhibiteur (s) dans la réaction de PCR . Le contrôle Test de sonde (PCC) vérifie la réhydratation réactif, tube de PCR en remplissantla cartouche, la stabilité de l'intégrité de la sonde, et un colorant. 9 Les amorces dans l'Xpert MTB / RIF dosage amplifier une portion du gène rpoB de la paire contenant 81 de base "noyau" région. Cinq couleurs différentes fluorogènes nucléiques sondes d'hybridation des acides, appelés balises moléculaires, d'interroger l'ensemble de la 81-pb de base 14. Chaque balise moléculaire a été conçu pour être aussi précis que cela ne se lie pas à son objectif si la séquence cible diffère de la rpoB de type sauvage séquence en aussi peu que une seule substitution nucléotidique. Depuis la fluorescence moléculaire balises seulement quand ils sont liés par leurs objectifs, les séquences rpoB dire de type sauvage, l'absence de l'une quelconque des cinq couleurs dans l'essai de la différence entre l'conservée séquence de type sauvage et des mutations dans la région du coeur qui sont associés à la résistance FRR 6.

Le CPS devrait être positif dans un échantillon négatif et peut être négatif ou positif dans un échantillon positif. Le testrésultat sera "non valide" si la CPS n'est pas détecté dans un test négatif. Avant le début de la réaction de PCR, le système GeneXpert Dx mesure le signal de fluorescence à partir des sondes pour surveiller la réhydratation bourrelet, par réaction tube de remplissage, l'intégrité de la sonde et la stabilité de colorant. Le PCC passe si le signal de fluorescence des sondes répond aux critères d'acceptation sont assignées. Les résultats sont interprétés par le système GeneXpert Dx de signaux de fluorescence mesurés et algorithmes de calcul embarqués et sont affichés dans la fenêtre Résultats de 9, comme indiqué ci-dessous:

VTT Détecté: ADN cible VTT est détecté, les deux contrôles, la CPS et du PCC, de répondre aux critères d'acceptation sont assignées. La baisse des valeurs de Ct représentent une plus forte concentration de départ de matrice d'ADN; des valeurs plus élevées représentent Ct une concentration plus faible de la matrice d'ADN. Dans les résultats VTT DETECTES "Résistance FRR DETECTE" (figure 1A), "Résistance FRR non détecté" (

VTT n'est pas détectée: ADN cible VTT n'est pas détecté, les deux contrôles, la CPS et du PCC, de répondre aux critères d'acceptation assignées (Figure 2).

Blancs: Présence ou absence de VTT ne peut être déterminée: la CPS ne répond pas aux critères d'acceptation, c'est à dire l'échantillon n'a pas été correctement traitées, ou PCR est inhibée (figure 3). Remarque: répéter le test avec un échantillon supplémentaire!

Erreur: Une ou plusieurs des résultats du PCC a échoué (FAIL). Les deux VTT et de la CPS afficher aucun résultat. Remarque: répéter le test avec un échantillon supplémentaire! Si le PCC a adopté (PASS), l'erreur est causée par une défaillance d'un composant système.

Figure 1: ADN cible VTT est détecté, les deux contrôles, la CPS et du PCC, de répondre aux critères d'acceptation sont assignées. La baisse des valeurs de Ct représentent un départ plus élevé,concentration de matrice d'ADN; des valeurs plus élevées Ct représentent une concentration plus faible de matrice d'ADN. Dans les résultats VTT DETECTES "Résistance FRR non détecté" (figure 1A), "Résistance FRR DETECTE" (figure 1B), ou «FRR Résistance INDETERMINEE" s'affiche sur une ligne distincte.

Figure 1A
. Figure 1A VTT DÉTECTÉ; Résistance FRR pas détecté, à savoir que le type sauvage séquence d'acide nucléique de la FRR 81-pb résistance-determining region (RRDR) du gène rpoB était présent 6. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 1B
. La figure 1B VTT DÉTECTÉ; Résistance FRR DETECTE. Remplissez abandonner Probe B (flèche), qui couvre les positions 513 à 517 de la R RDR du gène rpoB. 6 Dans l'exemple, le séquençage partiel a révélé que la mutation du gène rpoB D516V a été détectée. 8 Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 2
Figure 2 ADN cible VTT n'a pas été détecté;.. Les deux contrôles, la CPS et du PCC, de répondre aux critères d'acceptation assignées Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 3
. Résultat de test valide la figure 3, la présence ou l'absence de savoir VTT ne peut être déterminée: la CPS ne répond pas aux critères d'acceptation, parce que l'échantillon n'a pas été correctement traitée, ou parce que la PCR a été inhibée.3547fig3large.jpg "target =" _blank "> Cliquez ici pour agrandir la figure.

Disclosures: Diagnostic de la tuberculose pulmonaire avec le Xpert MTB / RIF test

Pas de conflits d'intérêt déclarés.

Materials: Diagnostic de la tuberculose pulmonaire avec le Xpert MTB / RIF test

Name Company Catalog Number Comments
Xpert MTB/RIF test Cepheid GXMTB/RIF-10
Transfer pipettes Sarstedt Ltd 86.1172.001
Conical tubes, 15 ml, 120 x 17 mm, PS Sarstedt Ltd 62.553.542

References: Diagnostic de la tuberculose pulmonaire avec le Xpert MTB / RIF test

  1. Sudre, P., ten Dam, G., Chan, C., & Kochi, A. Tuberculosis in the present time: a global overview of the tuberculosis situation. World Health Organisation Document WHO/TUB/91. 158, 1-47 (1991).
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