Funksjonell Kalsium Imaging in Developing kortikal Networks

Dawitz, J., Kroon, T., Hjorth, J. J., Meredith, R. M. Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks. J. Vis. Exp. (56), e3550, doi:10.3791/3550 (2011).

Et kjennetegn mønster av aktivitet i utviklingsland nervesystem er spontan, synkronisert nettverk aktivitet. Synkronisert aktiviteten har vært observert i intakt ryggmargen, hjernestammen, netthinnen, cortex og dissosiert neuronal kultur preparater. I perioder med spontan aktivitet, nevronene depolarize å avfyre ​​ett eller bursts av aksjonspotensialer, aktivisere mange ionekanaler. Depolarisering aktiverer spenningsstyrte kalsium kanaler på dendritter og pigger som formidler kalsium tilstrømningen. Meget synkronisert elektrisk aktivitet har blitt målt fra lokale nevrale nettverk bruker feltet elektroder. Denne teknikken gir høy timelige samplingsfrekvens men lavere romlig oppløsning på grunn av integrerte lese ut av flere nerveceller på en elektrode. Enkelt celle oppløsning på neuronal aktivitet er mulig ved hjelp av patch-clamp elektrofysiologi på single neurons å måle avfyring aktivitet. Imidlertid er muligheten til å måle fra et nettverk begrenset til antall nevroner patchet erimultaneously, og er vanligvis bare ett eller to nerveceller. Bruken av kalsium-avhengige fluorescerende indikator fargestoffer har aktivert måling av synkronisert aktivitet over et nettverk av celler. Denne teknikken gir både høy romlig oppløsning og tilstrekkelig tidsmessige sampling å registrere spontan aktivitet av å utvikle nettverk.

Et viktig trekk ved nylig forming cortical og hippocampus nettverk under pre-og tidlig postnatal utvikling er spontan, synkronisert neuronal aktivitet (Katz & Shatz, 1996; Khaziphov & Luhmann, 2006). Dette korrelerte nettverk aktiviteten antas å være avgjørende for generering av funksjonelle kretser i utviklingsland nervesystemet (Spitzer, 2006). I begge primater og gnager hjernen, er tidlige elektriske og kalsium nettverk bølger observert pre-og postnatalt in vivo og in vitro (Adelsberger et al, 2005;. Garaschuk et al, 2000;.. Lamblin et al, 1999). Disse tidlige aktivitet mønstre, som er kjent for å kontrollere flereutviklingsprosesser inkludert nevronal differensiering, synaptogenesis og plastisitet (Rakic ​​& Komuro, 1995;. Spitzer et al, 2004) er av avgjørende betydning for riktig utvikling og modning av kortikale kretsene.

I denne Jove video, viser vi de metoder som brukes til bildet spontan aktivitet i utviklingsland kortikale nettverk. Kalsium-sensitive indikatorer, som Fura 2-AM ester diffuse over cellemembranen der intracellulære esterase aktivitet kløyver AM estere å forlate cellen-impermeant form for indikator fargestoff. Den impermeant form av indikator har karboksylsyre grupper som er i stand til å så oppdage og binde kalsium ioner intracellulært .. Fluorescens av kalsium-sensitive fargestoff er midlertidig endret ved binding til kalsium. Singel eller multi-foton imaging teknikker brukes til å måle endring i fotonene bli sluppet fra fargestoff, og dermed indikere en endring i intracellulær kalsium. Videre har disse kalsium-dependent indikatorer kan kombineres med andre fluorescerende markører for å undersøke celletyper i aktivt nettverk.

1. Making horisontale entorhinal-hippocampus hjernen skiver

Entorhinal-hippocampus hjernen skiver er laget ved hjelp anatomiske guider, beskrevet i en 3D-oversikt over regionen i henhold til Canto, Wouterlood & Witter (2008) nevral plastisitet ID 381243 ^9.

1. Lag 500ml av skive løsning, oxygenate med carbogen gass (95% oksygen, 5% karbondioksid) i minst 20 minutter og deretter fryse 250ml til glasur. Minutter før slicing, knuse og blande slice isen med de resterende 250ml boblende slice løsning som skal brukes for disseksjon og for å kutte i slicing kammeret.
2. Lag 200ml av r-ACSF (recovery ACSF) og minst 500 ml e-ACSF (eksperimentell ACSF) løsning. Kontinuerlig oxygenate både løsninger med carbogen gass (95% oksygen, 5% karbondioksid) i minst 20 minutter før vevet forberedelse.
3. Denne protokollen er gyldig for mus fra postnatal dag 0 opp til maksimalt 3 uker gamle. Halshogge den Animal, ifølge lokale etiske komité prosedyrer, og dissekere ut hjernen raskt i en petriskål med iskald slice løsning utarbeidet i trinn 1 ovenfor (se tabell 1 for løsninger og reagenser).
4. Overfør hjernen på et filter papir dynket med slice løsning og skille de to halvkulene med et skarpt barberblad. Overfør en halvkule tilbake i iskald slice løsning.
5. Fjern lillehjernen av den andre halvkulen. Vend hjernen på midtlinjen sin og kuttet av toppen av hjernen med en liten vinkel mot rostral slutten.
6. Vend hjernen på kuttet (rygg) overflate og lim den inn på vev innehaveren av slicer opp ned ved å forsiktig skyve med en bomullspinne.
7. Slice 300 mikrometer tykke hjernen skiver ved hjelp av en lav frekvens og hastighet i de resterende iskalde slice løsning laget i Trinn 1. Under våre forhold, bruker vi en Thermo Fisher Scientific vibratome (Microm, 650V HM) ved innstillinger 0,05 mm / s og 36Hz.
8. Somsnart en skive er kuttet, overføre den til en skive holderen (neddykket) som inneholder oksygen Kunstig Cerebro spinalvæske (ACSF) (2,5 Mg ^{2 +,} 1.6mm Ca ^{2 +,} se tabell 2) ved romtemperatur. En høyere magnesium konsentrasjon i r-ACSF reduserer tilførselen av kalsium i nerveceller via NMDA reseptorer følgende slicing og i vår erfaring, fører til en bedre kvalitet på skiver for eksperimenter. Ved behov, kutt andre cerebral halvkule etterpå.
9. La skivene i en time å komme seg.

Tabell 1. Oppskrift på skive løsning.

Tabell 2. Oppskrift for både utvinning (r-ACSF) og eksperimentelle (e-ACSF) løsning.

2. Utarbeidelse av flekker lmrav

For å laste celler med kalsium-avhengige indikator eller celle-spesifikk markør, skiver trenger å bli overført til et kammer for farging prosedyren. Selv kommersielle kamre kan være tilgjengelig, kan man lett bli sammen av standard laboratorieutstyr for svært liten kostnad. De viktigste funksjonene i et slikt kammer er at skivene er varmet til mellom 30 og 35 ° C, ruges i en kontinuerlig oxygenated medium, og at kammeret er skjermet mot lys.

1. Ved hjelp av en oppvarmet stang, lage et lite hull i sideveggen av to disponibel polystyren petriskåler (35 og 100 mm diameter) som er akkurat stor nok til å tillate en del av silisium rør (diameter ca 1,5 mm) til å passere gjennom.
2. Tre silisium slangen gjennom hullet i den lille petriskål og danne en løkke inni den indre veggen av liten skål.
3. Bruk superlim for å forsegle den åpne enden av slangen og stokk resten av slangen til den indre veggen av petriskål. Ved hjelp av en nål, lage fine hull jevnt fordelt intervaller i slangen innenfor den indre petriskål.
4. Lim de mindre petriskål inni større, med begge hullene justert. Tre andre enden av silisium slangen gjennom hullet i veggen av større petriskål.
5. For grensesnittet parabolen, ta en cellekultur inn godt med semipermeabel membran og bruke et oppvarmet skalpell, skjære den øverste 1 cm unna å forlate et grunt fat for å holde skiver under inkubering.
6. På lokket av de større petriskål, lage et hull ca. 0,5-1cm diameter for å tillate carbogen (95% O _2, 5% CO ₂₎ å strømme inn i kammeret.
7. Ta en 5 eller 10 ml plast sprøyte. Ved hjelp av en oppvarmet skalpell, lage en vinklet kuttet til fjerne enden av sprøyten og holde noen få cm lengde sprøyte tube med spissen. Ved hjelp av superlim, fest snittflaten av sprøyten slangen til petriskål lokket, over 0,5-1cm diameter hull.
8. Fest silisium tubing og påubing kontakten til sprøyten spissen. Fest en slange kobling til silisium slangen inn i bunnen av petriskåler.
9. Koble opp både rør til en regulator for carbogen (95% O _2, 5% CO ₂₎ forsyning. Plasser misfarging kammer på en varm plate for inkubering mellom 30-35 ° C. Sørg for at kammeret kan være skjermet fra lys under hele inkubering prosessen. Farging kammeret er nå klar til å montere og bruke for skive inkubasjon.

Metodikk Figur 1. Tverrsnitt av farging kammeret viser slice inkubering (over) og anvendelse av kalsium-sensitive indikator (pipetteres grønt fargestoff, nedenfor).

3. Farging av skiver

Gjennom noen håndterer med fluorescerende fargestoffer, unngå fotobleking ved å arbeide med lite lys og holde fargestoff og tHan farget vev i mørket mellom håndtering.

1. Sett misfarging kammer på en varme plate (35 ° C), koble den til en carbogen gassforsyning og fylle det med ca 1.5ml r-ACSF fra stykket holderen.
2. Plasser grensesnitt rett i flekker kammer og fylle det med 1 ml ACSF.
3. Sikre en god carbogen forsyning i farging kammeret for å holde ACSF boblende på en mild, jevn hastighet.
4. Legg til 9 mL DMSO og 1 mL pluronic syre (20% i DMSO stamoppløsning, Invitrogen) i et hetteglass på 50 mikrogram Fura 2-AM. Vortex fargestoff mix i 15 minutter.
5. Overfør skivene i grensesnittet parabolen og pipette fargestoff inn i r-ACSF direkte over hippocampus og entorhinal cortex regionen av interesse, som indikert i Methodology figur 1 (ovenfor), oppnå en endelig fargestoff konsentrasjon av 50mm.
6. Lukk lokket på flekker kammer og inkuber fargestoff for 20 - 40 minutter avhengig av alderen på dyret (se tabell 3).
7. TransPer skivene tilbake i slice holderen.

Tabell 3. Inkubasjon ganger for forskjellige aldre, empirisk bestemmes i laboratoriet.

Fire. Andre fargestoffer og eldre vev

Kanskje skyldes økt myelination i hjernevev, gjør skiver fra eldre gnagere ikke ta opp Fura 2-AM ester så lett. For å lette opptak av dette fargestoffet en preincubation steg med Cremophor EL (Sigma) brukes for hjernen til mus ved P13 og eldre ^11. Cremophor er en ikke-ionisk overflateaktivt stoff som brukes som hjelpestoff i mange Pharmaceutical-applikasjoner. Uten dette trinnet, finner vi at celle-spesifikk merking er ekstremt dårlig og inkonsekvent hele cortical skive.

1. Overfør gamle skivene i et grunt preincubation tallerken fylt med 3ml r-ACSF og 8 mL 0,5% cremophor (Sigma) oppvarmet til 35 ° C i 3 minutter.
2. Overfør skivene i grensesnittet parabolen og følge den vanlige flekker prosedyre (trinn 4-7, se ovenfor).

Kalsium fargestoffer belastning både nerveceller og ikke-nevroner i stykket forberedelse. Å identifisere og skille mellom disse celletypene i nettverket, kan sulforhodamine 101 (SR101) brukes til å merke astrocytes innenfor skive.

Farging av skiver for sulforhodamine 101

Følg trinn 1-3 som før (§ 3).
Ta 1 mL av 10mm stamløsningen av sulforhodamine (Sigma) fra lagring ved -20 ° C og oppløses i 999 mL r-ACSF å gi en 10 mM løsning. Pipetter den lilla fargestoff OVer det skiver som før (trinn 5-7), slik at skivene incubating for en periode på 15 minutter.

Microglia og endotelceller er merket med FITC tomat lektin dye

Følg trinn 1-3 som før.
Ta 25 mL av 2mg/ml Lycopersicon esculentum (tomat) lektin FITC konjugat (L0401, Sigma) lager løsningen i 2,5 ml r-ACSF å gi 20 mg / ml konsentrasjon. Pipetter fargestoff over skiver som før (trinn 5-7), slik at skivene incubating for en periode på 45 minutter.

Merk, er det ikke mulig å kombinere dette fargestoff med en kalsium-sensitiv indikator som Fura 2-AM eller Oregon Grønn BAPTA-1 (OGB-1) som fluoresce i det grønne området av spekteret siden fotoner fra begge fargestoffer skal avgis ved overlappende bølgelengder. Det finnes imidlertid andre kalsium-indikator fargestoffer som kalsium appelsin, Fura Red som kan brukes i kombinasjon med egnede filtre eller Texas-Red lektin konjugater å kombinere viddh kalsium-indikator fargestoffer i det grønne spekteret.

5. Feste skiver til innspilling kammer

Under bildebehandling skiver trenger å være stabilt under mikroskop. Vanligvis et metall harpe er plassert for å holde nede vevet, men det kan ujevnt forvrenge overflaten av stykket, og gir bare en del av synsfeltet for imaging i fokus. For å unngå dette, skiver fast til innspillingen kammeret ved hjelp Polyethylenimine (PEI).

1. Klargjør PEI løsningen (1 ml Polyethyleneimine løsning i 250ml borsyre buffer (tabell 4)). Pass på PEI oppløses helt (stir over natten).
2. Fyll innspillingen kamre med PEI løsning slik at bunnen er dekket med væske minst en time før du ønsker å bruke skiver
3. Vask innspillingen kamre med destillert vann og deretter med r-ACSF fra driftsenheten kammeret.
4. Overfør en skive inn et opptak kammer.
5. Fjern r-ACSF med en pipette og plasser slis i midten med en børste.
6. Fjern r-ACSF rundt stykket med biter av filterpaper. For stabilitet og etterlevelse, er det viktig at det ikke er ACSF rundt skive lenger.
7. Pipette omtrent 0,5-1 ml ACSF, avhengig av størrelsen av opptaket kammer, på skive. ACSF skal bare dekke slice overflaten.
8. Sett innspillingen kammer med stykket i en stor fuktet grensesnitt container, perfused med carbogen, og la skiver igjen i minst en time.

Tabell 4. Recipe PEI løsning.

Seks. Imaldring

Kalsium-avhengige indikator fargestoffer kan avbildes ved hjelp av enten en-eller to-foton mikroskopi. Bruk av to-foton bildebehandling aktiveres kun indikator fargestoff innenfor det sentrale volumet av regionen av interesse, og dermed redusere mengden av lysspredning i vevet. Videre gjør det bedre dybde penetrasjon av lys inn i skive.

For funksjonell kalsium bildebehandling bruker vi en Titanium safir laser levert av Coherent koblet til en Olympus mikroskop med 20x objektiv (NA 0,95) og et Trimscope system av LaVision Biotec. Den Trimscope Systemet muliggjør ramme skanning med 64 beamlets samtidig og er kombinert med et Hamamatsu C9100 EM-CCD-kamera for rask frame-skanning priser.

1. Plasser innspillingen kammeret under mikroskopet og etablere en stabil perfusjon med bildebehandling e-ACSF (1.6 Ca ^{2 +} / 1,5 Mg ^{2 +} ratio (tabell 2)) oppvarmet til en mer fysiologisk temperatur på minimale 30 ° C.
2. Focoss inn i regionen av interesse (ROI) med hvitt lys belysning. Unngå å utsette stykket for lys lenger enn nødvendig.
3. Velg bølgelengde, avbildning synsfelt, skanning frekvens, pixel tetthet og ekstra programvare alternativer gjelder for vev og biologiske signaler du ønsker å måle. For kalsium nettverk bildebehandling med Fura 2-AM vi vanligvis velge en bølgelengde på 820nm, en 250x250 mikrometer avbildning synsfelt, en linescanning frekvens 1200Hz og 2-by-2 Binning. Dette resulterer i en frametime på ca 100ms og dermed en avbildning frekvens på ca 10Hz.
4. Sjekk om avkastningen er i fokus med en kontinuerlig skanning modus og utvalgte bølgelengde på LASERLIGHT. Juster fokus og laser intensitet for å unngå pixel metning og bleking av bildet ditt.
5. Lag en timelapse film av avkastningen. Vi har vanligvis få to timelapse filmer på 2000 bilder hver.
6. For celle påvisning og identifikasjon, ta en z-stack ved hjelp av en stepsize på 1 mikrometer og forestille e + / 20 mikrometer rundt avbildes flyet av fokus.

7. Representative resultater

Vellykket lasting av kalsium indikatorer, er Fura 2-AM er vist i Figur 1 i utviklingsland neokortikale og entorhinal cortex nettverk ved hjelp multiphoton imaging. Noen fargestoff er fortsatt til stede som bakgrunn flekker i vevet, men celle soma og i noen tilfeller, proximal dendritter er klart synlige og atskilt fra omkringliggende neuropil. Hvis du legger ikke har vært vellykket, er svært liten celle-spesifikk farging observert og små klynger av fargestoff flekker er ofte synlige på skive overflaten i døde membran rusk.

I disse screenshots, er nettverket av celler klart synlig i en enkelt plan i fokus for samtidig cell imaging. Bruk av et metall harpe eller ufullstendig stikker av stykket til innspillingen kammer kan resultere i en ujevn skive overflaten som skal avbildes.

550fig1.jpg "alt =" Figur 1 "/>
Figur 1. Fura 2-AM ester-loaded utvikle neokortikale (A, venstre) og entorhinal (B, høyre) nettverk. Scale barer 100 mikrometer.
For å skille nevroner fra astrocytes, co-anvendelse av sulforhodamine 101 med Fura 2-AM ester muliggjør separasjon av celletyper i nettverket.

Figur 2. Astrocyte merking med sulforhodamine 101. En Co-merking av Fura 2-AM ester og sulforhodamine 101. Eksitasjon bølgelengde: 820nm. Bildesamling på PMTs med dichroic speil på 560/70nm for bølgelengde separasjon. B representant fluorescens spor fra et nevron (over) og en astrocyte (nedenfor). Scale barer 60 sek, 10 ΔF (au fluo).

Figur 3. FITC-konjugert Lycopersicon esculentum (tomat) lektin flekker . Merking av microglia og endotelceller i utviklingsland mus hippocampus (A) og overfladisk entorhinal cortex (B).

Kalsium indikator fargestoffer brukes til å lese-out aktivitet fra flere celler samtidig utvikle hjernebarken og hippocampus nettverk.

Figur 4. Dynamic kalsium transienter i hippocampus og kortikale nettverk.

Film 1: Fura 2-AM ester lasting av mus entorhinal cortex under andre postnatal uke.
Klikk her for å se filmen en.

Movie 2: Fura 2-AM ester lasting av mus hippocampus løpet av den første postnatal uken.
Klikk her for å se filmen to.

Movie 3: Fluo-4 lasting av mus cortex, under den første postnatal uken.
50movie3.avi "> Klikk her for å se film tre.

I tilfelle av Fura 2-AM ester, celle aktivering involverer en depolarisering-indusert tilførsel av kalsium, reduseres fargestoff fluorescens. For fargestoffer som Fluo-4, er det motsatte sant og celle depolarisering er observert som en økning i foton utslipp. Somatiske kalsium transienter er hovedsakelig måles, men aktiviteten i større proksimale dendritter kan også ses i noen forberedelser, som vist i Movie 2.

Les ut av nettverk aktivitet kan kvantifiseres ved hjelp av kommersielle eller in-house software scripts. I vår lab, celle identifisering og nettverk aktivitet måles og analyseres i et semi-automatisert måte ved hjelp av in-house kode for Matlab (MathWorks).

Figur 5. Representant analyse av synkronisert kalsium transienter fra et utviklingsland kortikale nettverk. 3D-representasjon av ett nevron ( (B) fra en z-stack for automatisert neuron deteksjon. Målinger av kalsium transienter inkluderer amplitude, frekvens og # av aktive celler som kan leses ut fra enkelt nervecelle data (C). Synkronisering mellom ulike spor kan visualiseres ved hjelp av en raster plot (D).

Metodene vi viser her viser egnet protokoller for kalsium avbildning av nettverk dynamikk fra identifiserbare celler i å utvikle cortical og hippocampus nettverk i mus og også i rotte hjernen. Disse metodene gir optimal romlig oppløsning til å visualisere et lokalt nettverk av celler somas samtidig for måling suprathreshold aktivitet. Temporal oppløsning av nettverk aktivitet kan varieres, avhengig ramme oppkjøpet CCD kameraets innstillinger, for å optimalisere signal: støymålinger for lang varighet suprathreshold hendelser, som vanligvis finnes i utviklingsland nervesystemet. Disse protokollene er ikke begrenset til hippocampus og kortikale nettverk, men også merke celler i hele utvikle nervesystemet. Begrensningen med denne metoden er at bare suprathreshold aktivitet kan registreres.

LaVision Biotec GmbH (Bielefeld, Tyskland) sponset innsending avgifter av dette manuskriptet artikkelen.

Arbeidet i laboratoriet er støttet av Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO) (917.10.372) til rmm. JD er tilsluttet EUs FP7 BrainTrain program ( www.brain-train.nl ). Vi takker Pieter Laurens-Baljon og Sabine Schmitz (begge CNCR, VU University Amsterdam) for bilder av FP multielectrode array kurver og neuronal kulturer brukt i videosekvens.

1. Katz, L.C. & Shatz, C.J. Synaptic activity and the construction of cortical circuits. Science. 274, 1133-1138 (1996).
2. Khazipov, R., & Luhmann, H.J. Early patterns of electrical activity in the developing cerebral cortex of humans and rodents. Trends in Neurosciences. 29, 414-418 (2006).
3. Spitzer, N.C. Electrical activity in early neuronal development. Nature. 444, 707-712 (2006).
4. Adelsberger, H., Garaschuk, O., & Konnerth, A. Cortical calcium waves in resting newborn mice. Nat. Neurosci. 8, 988-990 (2005).
5. Garaschuk, O., Linn, J., Eilers, J., & Konnerth, A. Large-scale oscillatory calcium waves in the immature cortex. Nat. Neurosci. 3, 452-459 (2000).
6. Lamblin, M.D., et al. Electroencephalography of the premature and term newborn. Maturational aspects and glossary. Neurophysiol. Clin. 29, 123-219 (1999).
7. Rakic, P. & Komuro, H. The role of receptor/channel activity in neuronal cell migration. J. Neurobiol. 26, 299-315 (1995).
8. Spitzer, N.C., Root, C.M., & Borodinsky, L.N. Orchestrating neuronal differentiation: patterns of Ca2+ spikes specify transmitter choice. Trends. Neurosci. 27, 415-421 (2004).
9. Canto, C.B., Wouterlood, F.G., & Witter, M.P. What does the anatomical organization of the entorhinal cortex tell us? Neural. Plast. 2008, 381243 (2008).
10. Bureau, I., Shepherd, G.M., & Svoboda, K. Precise development of functional and anatomical columns in the neocortex. Neuron. 42, 789-801 (2004).
11. Ikegaya, Y., Le Bon-Jego, M., & Yuste, R. Large-scale imaging of cortical network activity with calcium indicators. Neuroscience research. 52, 132-138 (2005).

3 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.