Funktionell Kalcium Imaging i utvecklingsländerna kortikala nätverk

Dawitz, J., Kroon, T., Hjorth, J. J., Meredith, R. M. Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks. J. Vis. Exp. (56), e3550, doi:10.3791/3550 (2011).

Ett kännetecken mönster av aktivitet i utvecklingen av nervsystemet är spontan, synkroniserad nätverksaktivitet. Synkroniserad aktivitet har observerats i intakta ryggmärgen, hjärnstammen, näthinnan, cortex och dissocierade neuronala förberedelser kultur. Under perioder av spontan aktivitet, nervceller depolarize att skjuta enstaka eller utbrott av aktionspotentialer, aktivera många jonkanaler. Depolarisation aktiverar spänningsstyrda kalciumkanaler på dendriter och ryggar som förmedlar kalciuminflödet. Mycket synkroniserad elektrisk aktivitet har mätts från lokala neuronala nätverk med hjälp av fältet elektroder. Denna teknik möjliggör hög temporal samplingsfrekvens men lägre spatial upplösning på grund av integrerad avläsning av flera nervceller vid en elektrod. Enda cell upplösning på nervaktivitet är möjligt med patch-clamp elektrofysiologi på enstaka nervceller för att mäta bränning aktivitet. Dock är förmågan att mäta från ett nätverk begränsat till antalet nervceller lappade simultaneously, och oftast bara en eller två nervceller. Användningen av kalcium-beroende fluorescerande indikator färger har möjliggjort mätning av synkroniserade verksamheten i ett nätverk av celler. Denna teknik ger både hög rumslig upplösning och tillräckliga tidsmässiga provtagning för att spela in spontana aktivitet utveckla nätverket.

En viktig egenskap hos nyligen bilda kortikal och hippocampus nätverk under pre-och tidig postnatal utveckling är spontan, synkroniserad neuronal aktivitet (Katz & Shatz, 1996; Khaziphov & Luhmann, 2006). Detta korrelerade nätverksaktivitet tros vara avgörande för den generation av funktionella kretsar i utvecklingsländerna nervsystemet (Spitzer, 2006). I både primater och gnagare hjärnan, är tidiga elektriska och kalcium vågor nätverk observerade pre-och postnatalt in vivo och in vitro (Adelsberger et al, 2005;. Garaschuk et al, 2000;.. Lamblin et al, 1999). Dessa tidiga aktivitetsmönster, som är kända för att kontrollera flerautvecklingsprocesser inklusive neuronal differentiering, synaptogenesis och plasticitet (Rakic ​​& Komuro, 1995;. Spitzer et al, 2004) är av avgörande betydelse för korrekt utveckling och mognad av kortikala kretsen.

I den här JUPITER videon visar vi de metoder som används för att bilden spontan aktivitet i utvecklingen av kortikala nätverk. Kalcium-känsliga indikatorer, som Fura 2-AM ester diffusa över cellmembranet där intracellulära esteras aktivitet klyver AM estrar lämna cell-impermeant form av indikator färgämne. Den impermeant form av indikator har karboxylsyra grupper som har möjlighet att sedan upptäcka och binda kalciumjoner intracellulärt .. Fluorescensen av kalcium-känsliga färgämne tillfälligt ändras vid bindning till kalcium. En eller flera foton imaging tekniker används för att mäta förändringen i fotoner som sänds ut från färgen och därmed indikerar en förändring i intracellulär kalcium. Dessutom är dessa kalcium-dependent indikatorer kan kombineras med andra fluorescerande markörer för att undersöka celltyper inom aktivt nätverk.

1. Göra horisontella entorhinal-hippocampus hjärnan skivor

Entorhinal-hippocampus hjärnan skivor görs med anatomiska guider, beskrivs i en 3D-bild av regionen enligt Canto, Wouterlood & Witter (2008) Neural Plasticitet ID 381.243 ^9.

1. Gör 500ml skiva lösning syresätta med carbogen gas (95% syre, 5% koldioxid) under minst 20 minuter och sedan frysa 250ml tills iskallt. Minuter före skivning, krossa och blanda skiva isen med de återstående 250ml bubblande skiva lösning som ska användas för dissekering och för att skära i skivning kammaren.
2. Gör 200 ml r-ACSF (återvinning ACSF) och minst 500 ml e-ACSF (experimentell ACSF) lösning. Kontinuerligt syresätter både lösningar med carbogen gas (95% syre, 5% koldioxid) under minst 20 minuter innan vävnad förberedelse.
3. Detta protokoll gäller för möss från postnatal dag 0 upp till högst 3 veckor gammal. Halshugga de animal, enligt lokala etisk kommitté förfaranden och dissekera ut hjärnan snabbt i en petriskål med iskall skiva lösning som framställts i steg 1 ovan (se tabell 1 för lösningar och reagens).
4. Överför hjärnan på ett filtrerpapper indränkt med slice lösning och separera de två halvkloten med en vass rakblad. Överför en halvklotet tillbaka till iskalla slice lösning.
5. Ta bort lillhjärnan den andra halvklotet. Vänd hjärnan på dess mittlinjen och skär av toppen av hjärnan med en liten vinkel mot rostralt slutet.
6. Vänd hjärnan på cut (dorsala) yta och limma det på den vävnad innehavaren av slicer upp och ned genom att försiktigt trycka med en bomullspinne.
7. Skiva 300 um tjocka hjärnan skivor med en låg frekvens och hastighet i de återstående iskalla slice lösning som gjorts i steg 1. Under våra villkor, använder vi en Thermo Fisher Scientific vibratome (microM, HM 650V) på inställningar 0,05 mm / s och 36Hz.
8. Somsnart en bit skärs, överför den till en skiva hållare (nedsänkt) som innehåller syresatt Artificiell ryggmärgsvätskan (ACSF) (2,5 Mg ^{2 +,} 1,6 mm Ca ^{2 +,} se tabell 2) vid rumstemperatur. En högre magnesium koncentration i R-ACSF minskar inflödet av kalcium i nervcellerna via NMDA-receptorer efter skivning och på vår erfarenhet, leder till en bättre kvalitet på skivor för experiment. Om det behövs, skär den andra hjärnhalva efteråt.
9. Låt skivorna i en timme att återhämta sig.

Tabell 1. Recept på skiva lösning.

Tabell 2. Recept för både återvinning (R-ACSF) och experimentella (e-ACSF) lösning.

2. Beredning av färgning lmbärnsten

För att ladda cellerna med kalcium-beroende indikator eller cell-specifik markör, skivor måste överföras till en kammare för färgningsproceduren. Även kommersiella kammare kan vara tillgängliga, kan man lätt monteras från vanliga labb utrustning till mycket låg kostnad. De viktigaste inslagen i en sådan avdelning är att skivor värms till mellan 30 och 35 ° C, ruvade i en ständigt syresatt medium och att kammaren är skyddad från ljus.

1. Med hjälp av en uppvärmd spö, gör ett litet hål i sidan väggen av två disponibel rätter polystyren Petri (35 och 100 mm diameter) som är precis så stora att en del av kisel slang (diameter ca 1,5 mm) för att passera.
2. Trä kisel slangen genom hålet i den lilla petriskål och bildar en ögla inne i innerväggen av den lilla skålen.
3. Använd superlim för att försegla den öppna änden av slangen och hålla resten av slangen till den inre väggen i petriskål. Med hjälp av en nål, göra fina hål jämnt fördelade mellanrum i slangen i de inre petriskål.
4. Limma mindre petriskål inuti den större, med både linje hål. Trä den andra änden av kisel slangen genom hålet i väggen i större petriskål.
5. För gränssnittet skålen, ta en cellkultur in bra med halvgenomträngligt membran och använda en uppvärmd skalpell skära upp 1cm bort att lämna ett grunt fat för att hålla skivorna under inkubationstiden.
6. På locket av de större petriskål, göra ett hål ca. 0,5-1cm diameter för att möjliggöra carbogen (95% O _2, 5% CO ₂₎ att flöda in i kammaren.
7. Ta en 5 eller 10 ml plastspruta. Med hjälp av en uppvärmd skalpell görs ett vinklat snitt för att ta bort sprutan och hålla ett par cm lång spruta röret med spetsen. Använda superlim, fäst snittyta på sprutan röret till petriskål locket, över 0,5-1cm diameter hålet.
8. Sätt silikon slang ochubing kontakten till sprutspetsen. Bifoga en annan slang kontakt till kisel slangen in basen av petriskålar.
9. Anslut upp båda rören till en regulator för carbogen (95% O _2, 5% CO ₂₎ utbudet. Placera färgning kammaren på en värmeplatta för inkubering mellan 30-35 ° C. Se till att kammaren kan skyddas från ljus under hela inkubationstiden processen. Färgningen kammaren är nu redo att montera och använda för skiva inkubation.

Metodik figur 1. Tvärsnitt av färgning kammaren visar slice inkubationen (ovan) och tillämpning av kalcium-känsliga indikatorn (pipetteras grön färg, nedan).

3. Färgning av skivor

Under all hantering med fluorescerande färger, undvik fotoblekning genom att arbeta med lite ljus och hålla färgen och than målat vävnad i mörkret mellan hantering.

1. Sätt färgning kammare på en värme platta (35 ° C), anslut den till en carbogen gasförsörjning och fyll den med ca 1,5 ml r-ACSF från segmentet hållaren.
2. Placera gränssnittet skålen i färgning kammaren och fyll den med 1ml ACSF.
3. Säkerställa en god carbogen leverans i färgning kammaren att hålla ACSF bubblande i en mjuk, jämn takt.
4. Lägg till 9 l DMSO och 1 l pluronic syra (20% i DMSO stamlösning, Invitrogen) i en injektionsflaska med 50 mikrogram Fura 2-AM. Vortex färgen blandas i 15 minuter.
5. Överför skivor i gränssnittet skålen och pipett färgen i r-ACSF direkt över hippocampus och entorhinal cortex regionen av intresse, såsom anges i metodik figur 1 (ovan), att uppnå en slutlig färg koncentration av 50 mM.
6. Stäng locket på färgning kammaren och inkubera färgen för 20 - 40 minuter beroende på djurets ålder (se tabell 3).
7. TransFer skivorna tillbaka i segmentet hållaren.

Tabell 3. Inkubationstider för olika åldrar, empiriskt bestämd i labbet.

4. Andra färgämnen och äldre vävnad

Kanske på grund av ökad myelination i hjärnvävnaden, göra skivor från äldre gnagare inte ta upp Fura 2-AM ester som lätt. För att underlätta spridningen av denna färg en preinkubation steg med hjälp av Cremophor EL (Sigma) används för hjärnan på möss vid P13 och äldre ^11. Cremophor är en icke-jonisk tensid som används som hjälpämne i många FARMACEUTISKAal applikationer. Utan detta steg, finner vi att cell-särskild märkning är extremt dålig och inkonsekvent hela kortikala slice.

1. Överför gamla skivor i en grund preinkubation tallrik fylld med 3 ml r-ACSF och 8 l 0,5% Cremophor (Sigma) uppvärmd till 35 ° C i 3 minuter.
2. Överför skivor i gränssnittet skålen och följa det normala färgningsproceduren (steg 4-7, se ovan).

Kalcium färgämnen belastning både nervceller och icke-nervceller i segmentet beredning. Att identifiera och skilja mellan dessa celltyper inom nätverket, kan sulforhodamine 101 (SR101) skall användas vid märkning astrocyter inom segmentet.

Färgning av skivor för sulforhodamine 101

Följ steg 1-3 som tidigare (avsnitt 3).
Ta 1 l 10 mM stamlösning av sulforhodamine (Sigma) från dess lagring vid -20 ° C och lös i 999 l R-ACSF att ge en 10 mikroM lösning. Pipettera den lila färgen ovER skivorna som tidigare (steg 5-7), lämnar skivor inkubation under en period av 15 minuter.

Mikroglia och endotelceller är märkta med FITC färgämne tomat lektin

Följ steg 1-3 som tidigare.
Ta 25 ìl 2mg/ml Lycopersicon esculentum (tomat) lektin FITC-konjugat (L0401, Sigma) stamlösning i 2,5 ml r-ACSF att ge 20 mikrogram / ml koncentration. Pipettera färgen över skivor som tidigare (steg 5-7), lämnar skivor inkubation under en period om 45 minuter.

Obs, är det inte möjligt att kombinera denna färg med en kalcium-känslig indikator som Fura 2-AM eller Oregon Grön BAPTA-1 kommer (ÖGB-1) som fluorescerar i det gröna utbudet av spektrumet då fotoner från både färgämnen avges på överlappande våglängder. Det finns dock andra kalcium-indikator färgämnen som Kalcium orange, Fura Red som kan användas i kombination med lämpliga filter eller Texas-Röd konjugat lektin att kombinera intelligensh kalcium-indikator färgämnen i det gröna spektrumet.

5. Fästa skivor att spela in kammarmusik

Under avbildning skivor behöver vara stabil under mikroskop. Vanligtvis en metall harpa förutsättningar att hålla ner vävnad men det kan ojämnt snedvrida ytan på skiva, ger bara en del av synfältet för avbildning i fokus. För att undvika detta är skivor som fastnat på inspelningen kammaren med hjälp av Polyethylenimine (PEI).

1. Förbered PEI-lösning (1 ml Polyethyleneimine lösning i 250 ml borsyra buffert (tabell 4)). Se till att PEI är helt upplöst (rör om natten).
2. Fyll inspelningen kammare med PEI-lösning så att botten är täckt med vätska minst en timme innan du vill tillämpa skivor
3. Tvätta inspelningen kammare med destillerat vatten och därefter med R-ACSF från företaget kammaren.
4. Överför en bit in i inspelningen kammare.
5. Ta bort r-ACSF med en pipett och placera slis i mitten med en borste.
6. Ta bort r-ACSF runt segment med hjälp av bitar av filterpaper. För stabilitet och följsamhet är det viktigt att det inte ACSF runt slice längre.
7. Pipettera ca 0,5-1ml ACSF, beroende på storleken av inspelningen kammaren, på skiva. ACSF ska bara täcka bit ytan.
8. Sätt inspelningen kammaren med skiva i en stor fuktig gränssnitt behållare, perfusion med carbogen och låt skivorna återhämta sig i minst en timme.

Tabell 4. Recept PEI lösning.

6. Imåldrande

Kalcium-beroende indikator färgämnen kan avbildas med antingen ett eller två foton mikroskopi. Användning av två-photon imaging aktiverar enda indikatorn färgämnet i de centrala volymen av regionen av intresse, vilket minskar mängden ljusspridningen i vävnaden. Dessutom gör det bättre djup penetration av ljuset i segmentet.

För funktionell kalcium bildbehandling använder vi ett Titanium safir laser levereras av Coherent kopplad till en Olympus mikroskop med ett 20x objektiv (NA 0,95) och en Trimscope system genom LaVision Biotec. Det Trimscope Systemet möjliggör ram skanning med 64 beamlets samtidigt och är tillsammans med en Hamamatsu C9100 EM-CCD-kamera för snabb frame-scanning priser.

1. Placera inspelningen kammaren under mikroskop och upprätta en stabil perfusion med bildbehandling e-ACSF (1,6 Ca ^{2 +} / 1,5 Mg ^{2 +} ratio (tabell 2)) upphettas till en mer fysiologisk temperatur minimala 30 ° C.
2. FOCoss i regionen av intresse (ROI) med vitt ljus belysning. Undvik att utsätta slice för ljus längre än nödvändigt.
3. Välj våglängd, avbildning synfält, scanning frekvens, pixeltätheten och ytterligare programvara som gäller för vävnad och biologiska signaler man vill mäta. För kalcium nätverk avbildning med Fura 2-AM vi vanligtvis väljer en våglängd på 820nm, en 250x250 ìm avbildning synfält, en linescanning frekvens av 1200 Hz och 2-i-2 binning. Detta resulterar i en frametime på ca 100 ms och därmed en avbildning frekvens på ca 10Hz.
4. Kontrollera om din ROI är i fokus med hjälp av en kontinuerlig scanning läge och valda våglängden LASERLIGHT. Justera fokus och laser intensitet för att undvika pixel mättnad och blekning av bilden.
5. Gör en timelapse film av din avkastning på investeringen. Vi förvärvar oftast två timelapse filmer av 2000 frames i varje.
6. För cell upptäckt och identifiering, ta en z-stack med en stepsize av 1 mikrometer och imag e + / 20 ìm runt avbildas plan fokus.

7. Representativa resultat

Framgångsrik lastning av kalcium indikatorer, Fura 2-AM visas i figur 1 i u hjärnbarkens och entorhinal cortex nätverk med multiphoton avbildning. Vissa färgämnen är fortfarande närvarande som bakgrundsfärgning i vävnaden, men cellen soma och i vissa fall, proximala dendriter syns tydligt och separat från omgivande neuropil. Om lastning inte har lyckats, är mycket liten cell-specifik färgning observeras och små kluster av färgämne fläckar är ofta synliga på skiva ytan i döda membran skräp.

I dessa skärmdumpar, är nätverket av celler tydligt i ett enda plan i fokus för samtidig cell imaging. Användning av en metall harpa eller ofullständiga fastnar för den del till inspelningen kammaren kan resultera i en ojämn skiva yta som ska avbildas.

550fig1.jpg "alt =" Bild 1 "/>
Figur 1. Fura 2-AM ester-loaded utveckla hjärnbarkens (A, vänster) och entorhinal (B, höger) nätverk. Skala barer 100 ìm.
Att separera nervceller från astrocyter, co-tillämpning av sulforhodamine 101 med Fura 2-AM ester möjliggör separation av celltyper inom nätverket.

Figur 2. Astrocyternas märkning med sulforhodamine 101. En Co-märkning av Fura 2-AM ester och sulforhodamine 101. Excitationsvåglängden: 820nm. Bildsamling på PMTs med dikroiskt spegel på 560/70nm för våglängden separation. B representant fluorescens spår från en neuron (ovan) och en astrocyternas (nedan). Skala barer 60 sek, ΔF 10 (au fluo).

Figur 3. FITC-konjugerat Lycopersicon esculentum (tomat) lektin färgning . Märkning av mikroglia och endotelceller i u-mus hippocampus (A) och ytliga entorhinal cortex (B).

Kalcium indikator färgämnen används för att läsa ut verksamhet från flera celler samtidigt utveckla kortikala och hippocampus nätverk.

Figur 4. Dynamisk kalcium transienter i hippocampus och kortikala nätverk.

Film 1: Fura 2-AM ester lastning av mus entorhinal cortex under andra födsel vecka.
Klicka här för att se film 1.

Film 2: Fura 2-AM ester lastning av musen hippocampus under de första postnatala veckan.
Klicka här för att se film 2.

Film 3: Fluo-4 lastning av musen cortex, under den första postnatala veckan.
50movie3.avi "> Klicka här för att se film 3.

Vid Fura 2-AM ester, cellsaktivering med en depolarisation-inducerad inflöde av kalcium minskar färgämne fluorescens. För färgämnen som Fluo-4, är det tvärtom och cell depolarisation observeras som en ökning av foton utsläpp. Somatisk kalcium transienter är främst mäts men aktiviteten i större proximala dendriter kan också ses i vissa förberedelser, som visas i Movie 2.

Avläsning av nätverksaktivitet kan kvantifieras med hjälp av kommersiella eller in-house mjukvara skript. I vårt labb, cell-identifiering och nätverksaktivitet mäts och analyseras i ett semi-automatiserat sätt med egen kod för Matlab (Mathworks).

Figur 5. Representativ analys av synkroniserade kalcium transienter från ett utvecklingsland kortikala nätverk. 3D-representation av en neuron ( (B) från en z-stack för automatiserad neuron upptäckt. Mätningar av kalcium transienter inkluderar amplitud, frekvens och # av aktiva celler som kan läsas ut från enstaka neuron data (C). Synkronisering mellan olika spår kan visualiseras med hjälp av ett raster plot (D).

De metoder som vi visar här visar lämpliga protokoll för kalcium avbildning av nätverk dynamik från identifierbara celler inom utveckling av kortikal och hippocampus nätverk i musen och även i råtta hjärnan. Dessa metoder ger optimal spatial upplösning för att visualisera ett lokalt nätverk av celler SOMAS samtidigt för att mäta suprathreshold aktivitet. Temporala upplösningen i nätverksaktivitet kan varieras beroende på ram förvärv CCD-kamera inställningar för att optimera signalen: bullermätningar för lång evenemang tid suprathreshold, som normalt återfinns i u nervsystemet. Dessa protokoll är inte begränsade till hippocampus och kortikala nätverk men också celler märkningen inom utvecklingen av nervsystemet. Begränsningen av denna metod är att bara suprathreshold aktivitet kan registreras.

LaVision Biotec GmbH (Bielefeld, Tyskland) sponsrade inlämnande avgifter av detta manuskript artikel.

Arbetet i labbet stöds av Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO) (917.10.372) till RMM. JD är anslutet till EU FP7 BrainTrain programmet ( www.brain-train.nl ). Vi tackar Pieter Laurens-Baljon och Sabine Schmitz (båda CNCR, VU University Amsterdam) för bilder på FP multielectrode utbud vågformer och neuronala kulturer används i videosekvensen.

1. Katz, L.C. & Shatz, C.J. Synaptic activity and the construction of cortical circuits. Science. 274, 1133-1138 (1996).
2. Khazipov, R., & Luhmann, H.J. Early patterns of electrical activity in the developing cerebral cortex of humans and rodents. Trends in Neurosciences. 29, 414-418 (2006).
3. Spitzer, N.C. Electrical activity in early neuronal development. Nature. 444, 707-712 (2006).
4. Adelsberger, H., Garaschuk, O., & Konnerth, A. Cortical calcium waves in resting newborn mice. Nat. Neurosci. 8, 988-990 (2005).
5. Garaschuk, O., Linn, J., Eilers, J., & Konnerth, A. Large-scale oscillatory calcium waves in the immature cortex. Nat. Neurosci. 3, 452-459 (2000).
6. Lamblin, M.D., et al. Electroencephalography of the premature and term newborn. Maturational aspects and glossary. Neurophysiol. Clin. 29, 123-219 (1999).
7. Rakic, P. & Komuro, H. The role of receptor/channel activity in neuronal cell migration. J. Neurobiol. 26, 299-315 (1995).
8. Spitzer, N.C., Root, C.M., & Borodinsky, L.N. Orchestrating neuronal differentiation: patterns of Ca2+ spikes specify transmitter choice. Trends. Neurosci. 27, 415-421 (2004).
9. Canto, C.B., Wouterlood, F.G., & Witter, M.P. What does the anatomical organization of the entorhinal cortex tell us? Neural. Plast. 2008, 381243 (2008).
10. Bureau, I., Shepherd, G.M., & Svoboda, K. Precise development of functional and anatomical columns in the neocortex. Neuron. 42, 789-801 (2004).
11. Ikegaya, Y., Le Bon-Jego, M., & Yuste, R. Large-scale imaging of cortical network activity with calcium indicators. Neuroscience research. 52, 132-138 (2005).

3 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.