Creare fratture rigidamente stabilizzati per la Valutazione ossificazione intramembranosa, osteogenesi per distrazione, o guarigione di difetti critici Sized

Tutte le procedure sono state approvate dal Institutional Animal Care UCSF e sull'uso Comitato e sono conformi alle linee guida nazionali.

1. Preparazione dei fissatori Prima di Chirurgia

1. Prima di creare fratture stabilizzate, bisogna montare il custom-design del dispositivo di fissazione esterna. Le custom-designed telai esterni di fissaggio costituito da due anelli di alluminio stabilizzata da tre in acciaio inox # 0/56 barre filettate, 8 # 2/56 dadi esagonali e 17 bulloni corrispondenza (Small Part Inc., Miami Lakes, FL ^3).
2. Due anelli di alluminio sono necessari per frattura. Per assemblare un anello 4 # 2/56 dadi esagonali (piccola parte Inc., Miami Lakes, FL) e bulloni corrispondenti negli appositi fori, questi deve rimanere libera. Questo sarà l'anello prossimale. Per montare l'anello distale 3 dadi e bulloni, ancora una volta non serrare a fondo.

2. Anestesia, Creazione Fracture, e fissatore Application

1. Mice (età, sesso, e il corpopeso sono determinati dall'utente) vengono anestetizzati mediante iniezione intraperitoneale di 50mg/ml chetamina, 0,5 mg / ml medetomidina (0,03 ml / topo).
2. Applicare il lubrificante occhio agli occhi dei topi e mettere un pezzo di nastro in tutta la loro testa per proteggere i loro occhi durante la procedura.
3. L'animale viene posto su una piastra elettrica per il resto della procedura.
4. Trafiggere il metafisi prossimale e distale della tibia sinistra con quattro perni di 0,25 mm di insetti sterili (Anticorro: Strumento Science Fine, Foster City, CA) collegando i pin di uno strumento di Dremel e la perforazione attraverso l'osso.
5. Perni sono orientate perpendicolarmente all'asse longitudinale della tibia, e 90 ° fra loro. Almeno 10 mm tra i perni prossimale e distale.
6. Posizionare il primo anello sopra i perni prossimali con i dadi rivolti verso l'interno, verso i birilli. Fissare i perni sul ring mantenendo la tibia in posizione centrale all'interno dell'anello di alluminio.
7. Posizionare il secondo anello di sotto delperni Stal e fissare i perni per l'anello con i dadi esagonali come prima. Aggiungere il quarto dado-bullone combinazione della distale fissatore.
8. Creare la frattura trasversale da tre punti di piegatura con un dispositivo appropriato. Usiamo il sistema di gravità della Bonnarens Einhorn e ^4. Appoggiare la superficie postero-laterale della tibia attraverso i blocchi, sollevare il peso ad un'altezza predeterminata lungo il braccio goccia e perdere peso in modo che viene a contatto con l'aspetto antero-laterale della tibia per produrre la frattura smussata. L'altezza del peso viene fatto cadere da deve essere determinato per ogni ceppo di topo per garantire una frattura singola esclusivamente della tibia.
9. Fracture è confermata da X-ray.
10. Dopo la conferma della frattura, tre acciaio inossidabile # 0/56 aste filettate sono attaccati agli anelli. A partire dall'estremità distale inserire l'asta e infilare un dado sull'anello distale per bloccare l'asta. Poi mettere un altro dado sullo stelo, l'anello prossimale siederà in cima a questo nut. Assicurarsi che i due anelli si terrà a distanze uguali e non sforzare le spine. Fissare l'anello prossimale alle aste con una terza noce.
11. Iniezioni sottocutanee di buprenorfina (1,0 mg / kg) per l'analgesia viene dato immediatamente dopo l'intervento chirurgico e gli animali vengono monitorati per dolore e buprenorfina dato quando necessario.
12. L'anestesia è invertita con la somministrazione di atipamezolo, e gli animali vengono monitorati fino a quando non sono reattivi e deambulazione.

3. Osteogenesi per distrazione (vedi anche: ^12,13)

Per modificare questa procedura per accogliere distrazione osteogenesi è semplice. Gli anelli sono tenuti in posizione da barre filettate, e ruotando i dadi di fissaggio delle aste in posizione gli anelli possono essere allontanate.

1. Latenza: Per distrazione osteogenesi standard utilizzando questo modello i fissatori sono posti sul tibia e lasciato solo per un periodo di latenza di 5 giorni.
2. Distrazione: osteog Distractionenesis può essere effettuata agendo sui dadi sulle barre stabilizzatrici ¼ di giro (0,25 mm) ogni giorno 7 giorni.
3. Maturazione: Bony ponte è osservata da 10 giorni e il consolidamento completo è osservata da 27 giorni dopo il completamento di distrazione.

4. Creazione di un difetto critico Sized

Per creare un difetto critico dimensioni dei fissatori esterni vengono applicate come precedentemente descritto con le seguenti modifiche.

1. Prima di iniziare la procedura, la pelle viene pulita con il 70% di etanolo.
2. I fissatori sono applicati completamente prima di creare il difetto.
3. Il mouse viene quindi posto sotto il microscopio di dissezione per visualizzare la tibia mediale, e una incisione (mm 5-7) è realizzato con una lama # 10 su un bisturi.
4. Il muscolo viene delicatamente recisi e separato per esporre la metà diafisi della tibia.
5. A 3 mm del segmento osseo viene quindi rimosso dalle forbici utilizzando metà diafisi. Uso tegli punto delle forbici, l'osso è stato tagliato via lentamente e frammenti ossei vengono rimossi con pinze se necessario. Bisogna fare attenzione con le punte delle forbici per evitare di sostituirsi alla tibia con una grande forza meccanica.
6. Esaminare il sito chirurgico per garantire che non vi siano frammenti ossei, in quanto potrebbero promuovere la guarigione.
7. Sostituire il muscolo intorno alle estremità smussate della tibia.
8. Chiudere l'incisione sulla pelle con 2-3 punti di sutura monofilamento 6-0 di poliammine.
9. L'anestesia è invertito e gli animali vengono monitorati per dolore e dato analgesici come precedentemente descritto.

5. Risultati rappresentativi

Quando correttamente applicato, i fissatori esterni fornire più rigida stabilità della frattura chiusa tibiale con una eccellente riduzione (Figg. 1, 2). Tuttavia, in alcuni casi insufficiente riduzione (una lacuna evidente e grande tra le estremità ossee o fratture multiple verificarsi (Fig. 3 (Fig. 4). Al contrario, se la frattura non è stabilizzato un callo cartilagine grande è formata nella gap frattura (Fig. 5), e questo è sostituito da osso attraverso il processo di ossificazione intramembranosa.

Figura 1. Radiografie illustrano un dispositivo esterno di fissaggio utilizzato per stabilizzare frattura tibiale. Radiografia dopo la frattura che mostra alcuni segmenti ossei ben allineati (punta di freccia).

Figura 2. Immagine di un topo dopo che il fissatore è stato applicato.

Figura 3. Radiografia presa dopo fracture mostra segmenti ossei non allineate e frammentato (punta di freccia).

Figura 4. Frattura stabilizzata guarisce via ossificazione intramembranosa. Colorazione tricromica di frattura stabilizzata mostra qualche nuovo osso (b) al sito di frattura. Scala bar = 500 micron.

Figura 5. Non stabilizzato frattura guarisce via encondrale. Colorazione tricromica di frattura non-stabilizzato mostra cartilagine (c) e osso (b) al sito di frattura. Scala bar = 500 micron.

Ossa guarire da due diverse modalità a seconda della stabilità meccanica (recensione in: ^14). Se lasciato instabili a grandi forme modello cartilagine nel gap frattura che è sostituito da osso per colmare le due estremità della frattura. Prossimale e distale alla rottura, l'osso si forma direttamente da ossificazione intramembranosa all'interno del periostio e endosteum. Al contrario, in stabile guarigione delle fratture avviene esclusivamente via ossificazione intramembranosa ^3. Tuttavia, i meccanismi specifici che regolano il passaggio tra questi due processi non sono noti. Vi sono prove che destino delle cellule staminali in risposta all'ambiente meccanica è controllata geneticamente e può essere modificato. Nei topi che mancano MMP9 forme della cartilagine nel sito frattura di fratture stabili che suggeriscono che MMP9 è coinvolto nelle decisioni sul destino delle cellule staminali durante la riparazione della frattura ^5. La cartilagine può anche essere indotta a formare in fratture stabili se la proteina morfogenetica ossea(BMP) via di segnalazione viene attivata durante la riparazione della frattura ^8,9. Al fine di trarre tali conclusioni, fornendo la stabilizzazione rigida durante le prime fasi di guarigione è importante, perché queste decisioni destino delle cellule staminali vengono effettuate durante i primi giorni dopo la lesione ^11.

Il nostro metodo di fissazione esterna, quando applicato correttamente può essere usato per stabilizzare osso per valutare ossificazione intramembranosa durante la guarigione della frattura. Il metodo crea una frattura con danni agli arti altri che si verificano in un impatto ad alta velocità. Al contrario, i modelli foro che vengono utilizzati per valutare ossificazione intramembranosa non può riflettere trauma in pazienti. Inoltre, il metodo qui descritto è chiuso, quindi complicazioni associate con una ferita aperta non confondere l'interpretazione dei risultati. Un altro metodo comune per la stabilizzazione utilizza il posizionamento di un perno endomidollare prima della frattura (esempio ^4). Questa tecnica è ampiamente usata, e il posizionamento dei the perno è semplice ed efficace. Mentre questo approccio produce stabilizzazione laterale, non prevede stabilità rotazionale. Il danno risultante guarisce principalmente attraverso encondrale che può essere raggiunto senza una stabilizzazione a tutti e ^3. Fissazione placcato è stato utilizzato anche per ottenere la stabilizzazione della frattura in topi ^15. Qui una frattura aperta e viene creato appositamente progettati fissatori interni sono fissati all'osso dopo osteotomia è fatto. Simile al nostro approccio al metodo di fissazione interna offre la stabilità e la guarigione avviene attraverso ossificazione intramembranosa. Non osserviamo complicazioni significative, pin-infezioni del tratto o altre comorbidità associate a questa procedura, e gli animali sono in grado di muoversi con facilità le loro gabbie. Gli inconvenienti principali sono nella lunghezza del tempo necessario per diventare esperti in questo metodo, il tempo necessario per completare la procedura, e la necessità di due gruppi di individui per eseguire la procedura. Ion combinazione con manipolazioni genetiche o fisiologiche ai topi, confrontando stabilizzato per la guarigione della frattura non stabilizzata permette di comprendere considerevoli i meccanismi che regolano il destino delle cellule staminali durante la guarigione della frattura ^5, e ha permesso un'indagine di distrazione osteogenesi ¹⁴ allo stesso tempo ci fornisce uno modello di non-union ^13.