Criando Fraturas rigidamente estabilizadas para a Avaliação ossificação intramembranosa, Distração Osteogênica, ou Cura de defeitos críticos Sized

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Animal Care UCSF institucional e do uso Comissão e em conformidade com as diretrizes nacionais.

1. Preparação de Fixadores Antes de Cirurgia

1. Antes de criar fratura estabilizada, é preciso montar o design personalizado aparelho de fixação externa. Os quadros personalizado concebido externos de fixação consistia de dois anéis de alumínio estabilizados por três aço inoxidável-# 0/56 hastes roscadas, 8 # 2/56 porcas hexagonais, e 17 correspondentes parafusos (Small Inc., Miami Lakes, FL ^3).
2. Dois anéis de alumínio são necessárias por fratura. Para montar um anel 4 # 2/56 porcas hexagonais (pequena parte Inc., Miami Lakes, FL) e parafusos nos furos correspondentes adequados, estes devem permanecer solto. Este será o anel proximal. Para o anel distal montar 3 porcas e parafusos, mais uma vez não aperte totalmente.

2. Anestesia Criação fratura, fixador e Aplicação

1. Os ratinhos (idade, sexo, e do corpopeso são determinados pelo utilizador) são anestesiados por injecção intraperitoneal de 50mg/ml cetamina, 0,5 mg / ml Medetomidina (0,03 ml rato /).
2. Aplique lubrificante ocular para os olhos dos camundongos e coloque um pedaço de fita em toda a sua cabeça para proteger os olhos durante o procedimento.
3. O animal é colocado sobre uma almofada de aquecimento para o resto do procedimento.
4. Transfixar das metáfises proximal e distal da tíbia esquerda com quatro pinos de 0,25 mm de insetos estéreis (Anticorro: Ferramenta de Ciência Fine, Foster City, CA), anexando os pinos de uma ferramenta Dremel e perfurando-los através do osso.
5. Pinos são orientadas perpendicularmente ao eixo longo da tíbia, e 90 ° entre si. Pelo menos 10 mm entre os pinos proximais e distais.
6. Posicione o primeiro anel acima dos pinos proximais com as porcas voltado para dentro, em direção aos pinos. Proteger os pinos ao anel mantendo a tíbia posicionado centralmente dentro do anel de alumínio.
7. Posicione o segundo anel abaixo do dipinos Stal e fixar os pinos ao anel usando as porcas hexagonais, como anteriormente. Adicionar a combinação porca e parafuso quarto para o fixador distal.
8. Criar a fratura transversal por flexão de três pontos com um dispositivo apropriado. Nós utilizamos o sistema de gravidade da Bonnarens e Einhorn ^4. Descanse a superfície póstero-lateral da tíbia entre os blocos, levante o peso até uma altura pré-determinada ao longo do braço de queda e deixar cair o peso de modo que entra em contato com o aspecto ântero-lateral da tíbia para produzir a fratura fechado. A altura do peso é retirado da necessidades de ser determinado para cada estirpe de rato para garantir uma fractura simples exclusivamente da tíbia.
9. Fracture é confirmado por raio-X.
10. Após a confirmação da fractura, três aço inoxidável # 0/56 hastes roscadas estão ligados aos anéis. A partir da extremidade distai inserir a haste e enfiar uma porca no anel distai para fixar a haste. Em seguida, coloque outra porca na haste, o anel proximal vai sentar-se no topo desta nut. Certifique-se que os dois anéis será realizada a distâncias iguais e não sobrecarregar os pinos. Fixar o anel proximal para as hastes com uma porca terceiro.
11. As injecções subcutâneas de buprenorfina (1,0 mg / kg) para a analgesia são dadas imediatamente após a cirurgia e os animais são monitorizados para a dor e buprenorfina dada como necessário.
12. A anestesia é revertida pela administração Atipamezole, e os animais são monitorados até que eles são sensíveis e deambulando.

3. Distração Osteogênica (ver também: ^12,13)

Para modificar este procedimento para acomodar distração osteogênica é simples. Os anéis são mantidas em posição por hastes roscadas, e ligando as porcas que prendem as hastes no lugar dos anéis pode ser movido de intervalo.

1. Latência: Para padrão distração osteogênica usando este modelo, os fixadores são colocados na tíbia e deixados sozinhos por um período de latência de 5 dias.
2. Distração: osteog Distraçãoenesis pode ser realizada ligando as porcas sobre as hastes de estabilização ¼ de volta (0,25 mm) a cada dia, 7 dias.
3. Maturação: Bony ponte é observado por 10 dias e consolidação completa é observado por 27 dias após a conclusão de distracção.

4. Criação de um defeito crítico Sized

Para criar um defeito de tamanho crítico os fixadores externos são aplicados como anteriormente descrito com as seguintes modificações.

1. Antes de iniciar o procedimento da pele é limpo com etanol a 70%.
2. Os fixadores são aplicados completamente antes de criar o defeito.
3. O rato é depois colocar sob o microscópio de dissecação para visualizar a tíbia medial, e uma incisão (5-7 mm) é feita com uma lâmina de # 10 em um bisturi.
4. O músculo é suavemente seccionado e separado para expor o meio-diáfise da tíbia.
5. Um segmento de 3 mm do osso é então removido das tesouras meados de diáfise usando. Utilizando tele ponta da tesoura, o osso é lentamente snipped afastado e fragmentos de osso são removidos com uma pinça, se necessário. Deve ser tomado cuidado com as pontas dos tesoura para evitar o deslocamento da tíbia com uma grande força mecânica.
6. Examinar o local cirúrgico para assegurar que não existem fragmentos de osso, os quais podem promover a cicatrização.
7. Substituir o músculo em torno das extremidades embotadas da tíbia.
8. Feche a incisão na pele com suturas 2-3 de 6-0 monofilamento Polyamine.
9. A anestesia é revertida e os animais são monitorizados para a dor e dado analgésicos, como descrito anteriormente.

5. Os resultados representativos

Quando adequadamente aplicada, os fixadores externos proporcionar mais estabilidade rígida da fractura fechada tibial com excelente redução (Figs. 1, 2). No entanto, em alguns casos, a redução inadequada (uma diferença óbvia e grande entre as extremidades do osso ou fracturas múltiplas ocorrer (Fig. 3 (Fig. 4). Em contraste, se a fractura não é estabilizada um calo cartilagem grande é formada na abertura fractura (Fig. 5), e este é substituído por osso através do processo de ossificação intramembranosa.

Figura 1. Radiografias ilustrando um dispositivo de fixação externa utilizado para estabilizar a fratura da tíbia. Radiografia tirada após fratura mostrando alguns segmentos ósseos bem alinhados (seta).

Figura 2. Imagem de um rato após o fixador foi aplicado.

Figura 3. Radiografia depois de fracture mostra segmentos ósseos desalinhadas e fragmentadas (seta).

Figura 4. Fratura estabilizada cura através de ossificação intramembranosa. Coloração Tricrômico de fratura estabilizada mostra algum osso novo (b) no local da fratura. Barra de escala = 500 mm.

Figura 5. Fratura não estabilizada cura através de ossificação endocondral. A coloração tricromo de fractura não-estabilizada mostra cartilagem (c) e osso (b) no local da fractura. Barra de escala = 500 mm.

Ossos curar por duas modalidades diferentes, dependendo da estabilidade mecânica (revisto em: ^14). Quando deixou instáveis ​​se forma um molde grandes de cartilagem no intervalo fractura que é substituído por osso para preencher as duas extremidades do osso partido. Proximal e distal à quebra, o osso faz diretamente por ossificação intramembranosa dentro do periósteo e endósteo. Em contraste, na cicatrização de fracturas estável ocorre exclusivamente através de ossificação intramembranosa ^3. No entanto, os mecanismos específicos que regulam o interruptor entre estes dois processos são desconhecidos. Há evidências de que o destino de células estaminais em resposta ao ambiente mecânico é controlada geneticamente e podem ser alteradas. Em camundongos que não possuem MMP9 formas de cartilagem no local da fratura de fraturas estáveis, sugerindo que MMP9 está envolvido nas decisões tronco destino celular durante a reparação da fratura ^5. Cartilagem pode também ser induzido a formar em fracturas estáveis ​​se a proteína morfogenética do osso(BMP) via de sinalização é ativado durante a reparação de fraturas ^8,9. Para tirar essas conclusões fornecendo estabilização rígida durante os primeiros estágios de cura é importante, porque essas decisões tronco destino da célula é feita durante os primeiros dias após a lesão ^11.

O nosso método de fixação externa, quando aplicado correctamente podem ser usados ​​para estabilizar osso para avaliar a ossificação intramembranosa durante a cicatrização de fracturas. O nosso método cria uma fractura, juntamente com outras lesões dos membros que ocorrem em um impacto de alta velocidade. Em contraste, os modelos de perfuração de furos que são usados ​​para avaliar a ossificação intramembranosa podem não reflectir trauma em pacientes. Além disso, o método aqui descrito é fechada, de modo as complicações associadas com uma lesão aberta, não se confundem interpretação dos resultados. Outro método comum para a estabilização utiliza a colocação de um pino intramedular antes da ruptura (por exemplo ^4). Esta técnica é amplamente utilizada, e colocação de the pinos é simples e eficiente. Embora essa abordagem produz estabilização lateral, não prevê a estabilidade rotacional. A lesão resultante cura principalmente através ossificação endocondral que pode ser alcançado sem estabilização em todos os ^3. Fixação chapeado também tem sido usada para atingir a estabilização fractura em ratinhos ^15. Aqui uma fractura aberta é criado e especialmente concebidos fixadores internos são fixados ao osso depois de uma osteotomia é feita. Similar à nossa abordagem do método de fixação interna proporciona estabilidade ea cicatrização ocorre através de ossificação intramembranosa. Nós não observamos complicações significativas, pin-infecções do trato, ou outras co-morbidades associadas com este procedimento, e os animais são capazes de se movimentar facilmente suas gaiolas. Os inconvenientes principais são no comprimento de tempo que leva para se tornar proficientes neste método, o tempo que leva para completar o processo, e à exigência de equipas de dois indivíduos para realizar o procedimento. Eun combinação com manipulações genéticas ou fisiológica aos ratos, comparando estabilizado para a consolidação da fratura não estabilizada oferece uma visão considerável sobre os mecanismos que regulam o destino de células-tronco durante a cicatrização da fratura ^5, e permitiu uma investigação da distração osteogênica ¹⁴ ao mesmo tempo, proporcionando-nos uma modelo de não-união ^13.