Opprette strengt stabilisert Brudd for vurdering Intramembranous ossifikasjon, Distraction Osteogenesis, eller helbredelse av Kritiske Sized Defekter

Alle prosedyrer ble godkjent av UCSF Institutional Animal Care og Bruk komité og i overensstemmelse med nasjonale retningslinjer.

1. Utarbeidelse av Fixators før operasjonen

1. Før du oppretter stabilisert fraktur, trenger man å montere den tilpassede design ekstern fiksering enhet. De spesialdesignede eksterne fiksering rammer besto av to aluminium ringer stabiliserte seg etter tre rustfritt stål # 0/56 gjengestenger, 8 # 2/56 sekskantmutterene og 17 matchende bolter (liten del Inc., Miami Lakes, ³ FL).
2. To aluminium ringene er nødvendig per brudd. Til en ring montere 4 nr. 2/56 sekskantmutterene (liten del Inc., Miami Lakes, FL) og matchende bolter i de riktige hullene, bør disse være løs. Dette vil være den proksimale ringen. Til distale ringen sammen 3 muttere og bolter, ikke igjen ikke stram.

2. Anestesi, Fracture Creation, og Fixator Application

1. Mus (alder, kjønn, og kroppvekt bestemmes av brukeren) blir bedøvet ved intraperitoneal injeksjon av 50mg/ml Ketamin, 0,5 mg / ml Medetomidin (0,03 ml / mus).
2. Bruk øye smøremiddel til øynene av mus og plassere et stykke tape over hodet for å beskytte øynene under prosedyren.
3. Dyret er plassert på en varmepute for resten av prosedyren.
4. Transfix de proksimale og distale metaphyses av venstre tibia med fire 0,25 mm steril insekt pins (Anticorro: Fine Science Tool, Foster City, CA) ved å feste pinnene til en Dremel Tool og boring dem gjennom benet.
5. Pins er orientert vinkelrett på den lange aksen av tibia, og 90 ° til hverandre. Minst 10 mm mellom proksimale og distale pins.
6. Plasser den første ringen over proksimale pins med nøtter vendt innover, mot pinnene. Fest pinnene til ringen holde tibia plassert sentralt innenfor aluminium ringen.
7. Plasser andre ringen under diStal pins og sikre pins til ringen ved hjelp av sekskantmutterene som før. Legg til fjerde mutter-bolten kombinasjon til den distale fixator.
8. Opprett tverrgående brudd med tre-punkts bøying med en passende enhet. Vi bruker alvoret system av Bonnarens og Einhorn ^4. Hvil posterolateral overflaten av tibia over blokkene, øke vekten til en forhåndsbestemt høyde langs slipp armen og slipp vekten slik at det berører anterolateralt av tibia for å produsere den butte brudd. Høyden vekten er redusert fra må bestemmes for hver stamme av mus for å sikre en enkelt brudd utelukkende av tibia.
9. Fracture bekreftes av X-ray.
10. Etter å ha bekreftet bruddet, er tre rustfritt stål # 0/56 gjengestenger festet til ringene. Starter fra den distale enden sette stangen og træ en mutter på distale ringen for å sikre stanga. Deretter satte en annen mutter på stang, vil den proksimale ringen sitte på toppen av dette nUT. Kontroller at de to ringene vil bli holdt i lik avstand og ikke anstrengende pinnene. Fest proksimale ringen til de stenger med en tredje nøtt.
11. Subkutane injeksjoner av buprenorfin (1,0 mg / kg) for smertelindring gis umiddelbart etter operasjonen og dyr overvåkes for smerte og gitt buprenorfin etter behov.
12. Anestesi blir reversert ved å administrere atipamezol, og dyrene blir fulgt til de er responsive og ambulerer.

3. Distraksjon Osteogenesis (se også: ^12,13)

For å endre denne prosedyren for å imøtekomme distraksjon Osteogenesis er grei. Ringene holdes i posisjon av gjengestenger, og ved å skru mutterne som holder stengene på plass ringene kan flyttes fra hverandre.

1. Ventetid: For standard distraksjon Osteogenesis bruke denne modellen fixators er plassert på tibia og alene en latenstid på 5 dager.
2. Distraksjon: Distraction osteogenesis kan utføres ved å skru mutterne på de stabiliserende stengene ¼ turn (0,25 mm) hver dag 7 dager.
3. Modning: Bony bridging er observert av 10 dager og full konsolidering er observert ved 27 dager etter avslutningen av distraksjon.

4. Opprettelse av en kritisk skalert Defekt

For å opprette en kritisk størrelse defekt de eksterne fixators brukes som tidligere beskrevet med følgende modifikasjoner.

1. Før du begynner prosedyren huden er rengjort med 70% etanol.
2. De fixators brukes helt før du lager feilen.
3. Musen er å plassere så under dissekere mikroskop for å visualisere den mediale tibia, og et snitt (5-7 mm) er laget med en # 10 blad på en skalpell.
4. Muskelen er forsiktig transected og skilt for å eksponere midten diaphysis av tibia.
5. En 3 mm segment av benet blir deretter fjernet fra midten diaphysis med saks. Bruk tHan peker på saksen, er benet sakte klippet bort og beinrester blir fjernet med pinsett om nødvendig. Det bør utvises forsiktighet med tuppen av saksen for å unngå å fortrenge tibia med stor mekanisk styrke.
6. Undersøk det kirurgiske området for å sikre at det ikke er noen beinrester, da disse kan fremme helbredelse.
7. Bytt muskelen rundt avstumpet endene av tibia.
8. Lukk snitt på huden med 2-3 sting i 6-0 polyamin Monofilament.
9. Anestesi er snudd, og dyrene blir overvåket for smerte og gitt smertestillende som tidligere beskrevet.

5. Representative Resultater

Når riktig brukt, de eksterne fixators gi mer rigid stabilitet av den lukkede tibial brudd med utmerket reduksjon (1 Fig., 2). Men i noen tilfeller mangelfull reduksjon (en opplagt og stort gap mellom benendene eller flere brudd forekommer (Fig. 3 (Fig. 4). I kontrast, hvis bruddet ikke er stabilisert en stor brusk callus dannes i bruddet gap (Fig. 5), og dette er erstattet av bein gjennom prosessen intramembranous forbening.

Figur 1. Røntgenbilder illustrerer en ekstern fiksering enhet som brukes til å stabilisere tibial brudd. Røntgenbilde tatt etter bruddet viser en godt justert bone segmenter (pilspiss).

Figur 2. Bilde av en mus etter at fixator har blitt påført.

Figur 3. Røntgenbilde tatt etter fracture viser feiljustert og fragmentert bein segmenter (pilspiss).

Figur 4. Stabilisert brudd helbreder via intramembranous forbening. Trichrome farging av stabilisert fraktur viser noen nye bein (b) ved frakturstedet. Scale bar = 500 mikrometer.

Figur 5. Non-stabilisert fraktur helbreder via endochondral forbening. Trichrome farging av ikke-stabilisert fraktur viser brusk (c) og bein (b) ved frakturstedet. Scale bar = 500 mikrometer.

Bones helbrede ved to ulike modaliteter avhengig mekanisk stabilitet (anmeldt i: ^14). Da forlot ustabile et stort brusk mal former i sprekken gapet som er erstattet av bein å bygge bro over to endene av brukket ben. Proksimalt og distalt til pause, danner bein direkte av intramembranous forbening innenfor periosteum og endosteum. I kontrast, oppstår i stabile frakturer healing utelukkende via intramembranous forbening ^tre. Men de spesifikke mekanismene som regulerer bytte mellom disse to prosessene er ukjente. Det er dokumentert at stamcelleforskningen skjebne i respons til den mekaniske miljøet styres genetisk og kan endres. Hos mus som mangler Mmp9 brusk former i frakturstedet av stabile frakturer som tyder på at Mmp9 er involvert i stamcelleforskningen skjebne beslutninger under brudd reparasjon ^fem. Brusk kan også bli overtalt til å danne i stabile frakturer hvis Benmorfogenetiske protein(BMP) signalveien aktiveres under brudd reparasjon ^8,9. For å trekke disse konklusjonene gi stiv stabilisering i de tidlige stadier av helbredelse er viktig, fordi disse stamcelleforskningen skjebne beslutninger fattes i løpet av de første dagene etter skade ^11.

Vår metode for ekstern fiksering, når det brukes riktig kan brukes til å stabilisere bein å vurdere intramembranous forbening under bruddheling. Vår metode skaper et brudd sammen med andre lem skader som oppstår i en høy hastighet effekt. I motsetning kan bore hull modeller som brukes til å vurdere intramembranous forbening ikke nødvendigvis traumer hos pasienter. Videre er metoden som er beskrevet her stengt, så komplikasjoner forbundet med en åpen skade gjør ikke forvirre tolkning av resultatene. En annen vanlig metode for stabilisering bruker plassering av en intramedullær pin før brudd (f.eks ^4). Denne teknikken er mye brukt, og plassering av the pin er enkel og effektiv. Mens denne tilnærmingen gir lateral stabilisering den ikke gir for rotasjonsstabiliteten. Den resulterende skade leges primært via endochondral forbening som kan oppnås uten stabilisering på alle ^3. Plated fiksering har også blitt brukt for å oppnå brudd stabilisering i mus ^15. Her et åpent brudd er opprettet og spesialdesignede interne fixators er festet til benet etter en osteotomi er gjort. I likhet med vår tilnærming til osteosyntese metoden gir stabilitet og healing skjer via intramembranous forbening. Vi har ikke observere betydelige komplikasjoner, pin-skrift infeksjoner eller andre tilleggssykdommer forbundet med denne prosedyren, og dyrene er i stand til å bevege seg rundt burene lett. De største ulempene er i hvor lang tid det tar å bli dyktigere på denne metoden, den tiden det tar å fullføre prosedyren, og kravet for lag av to personer til å utføre prosedyren. Jegn kombinasjon med genetiske eller fysiologisk manipulasjoner til musene, sammenligne stabilisert til ikke-stabilisert bruddheling gir betydelig innsikt i de mekanismer som regulerer stamcelleforskningen skjebne under bruddheling ^5, og har tillatt en gransking av distraksjon Osteogenesis ¹⁴ mens også gir oss en modell av ikke-union ^13.