और परिसंचारी मेलेनोमा कोशिकाओं का उपयोग Photoacoustic Flowmetry की जांच अलगाव

O'Brien, C. M., Rood, K., Sengupta, S., Gupta, S. K., DeSouza, T., Cook, A., et al. Detection and Isolation of Circulating Melanoma Cells using Photoacoustic Flowmetry. J. Vis. Exp. (57), e3559, doi:10.3791/3559 (2011).

परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाओं (CTCs) उन कोशिकाओं है कि एक macroscopic ट्यूमर से अलग है और बीज ^{माध्यमिक} 1,2,3 ट्यूमर को रक्त और लसीका प्रणाली के माध्यम से फैल रहे हैं. CTCs हैं metastatic रोग और रक्त के नमूनों में अपने पता लगाने के संकेतक के लिए कैंसर का पता लगाने और एक रोगी के उपचार के लिए प्रतिक्रिया की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. चूंकि CTCs दुर्लभ हैं, के बारे में एक सामान्य रक्त कोशिकाओं के अरबों के बीच उन्नत कैंसर रोगियों में ट्यूमर सेल, उनके पता लगाने और गणन शामिल एक मुश्किल काम है. हम वर्णक के सबसे मेलेनोमा कोशिकाओं में उपस्थिति दोहन करने के लिए photoacoustic उत्पन्न, या लेजर प्रेरित परिसंचारी मेलेनोमा कोशिकाओं (CMCs) ^4,5 का पता लगाने के के लिए एक कस्टम प्रवाह कोशिकामापी में अल्ट्रासोनिक तरंगों . इस प्रक्रिया में एक पूरे रक्त के नमूने अलग centrifugation का उपयोग और सफेद रक्त कोशिकाओं की परत प्राप्त करने के जरूरत पर जोर देता है. यदि पूरे रक्त में मौजूद है, CMCs इसी तरह घनत्व के कारण श्वेत रक्त कोशिकाओं के साथ अलग होगा. इन कोशिकाओं में resuspended हैंफॉस्फेट खारा (पीबीएस) buffered और flowmeter में पेश किया. रक्त कोशिका निलंबन की एक सतत प्रवाह के बजाय, हम दो चरण प्रवाह प्रेरित क्रम में आगे के अध्ययन के लिए इन कोशिकाओं पर कब्जा. दो चरण प्रवाह में, एक microfluidic प्रणाली में दो अमिश्रणीय तरल पदार्थ जंक्शन और तरल ^6,7 के slugs बारी फार्म पर मिलना. पीबीएस सफेद रक्त कोशिकाओं और हवा के फार्म microliter slugs निलंबित कर दिया है कि sequentially लेसर प्रकाश के साथ विकिरणित हैं. तरल चरण के लिए एक surfactant के अलावा वर्दी अलसाना गठन की अनुमति देता है और उपयोगकर्ता दो चरणों के प्रवाह की दर बदलकर विभिन्न आकार slugs बना सकते हैं. और सफेद रक्त कोशिकाओं के साथ हवा और पीबीएस के slugs के slugs कोई प्रकाश अवशोषक होते हैं और इसलिए, photoacoustic तरंगों का उत्पादन नहीं करते. हालांकि, सफेद रक्त कोशिकाओं है कि यहां तक ​​कि एकल CMCs होते की slugs लेसर प्रकाश को अवशोषित और उच्च आवृत्ति ध्वनिक तरंगों का उत्पादन. ये slugs कि photoacoustic लहरें उत्पन्न तनहा verific लिए cytochemical धुंधला के लिए एकत्रCMCs के व्यावहारिक.

1. रक्त नमूना तैयार

1. दो 5 एमएल vacutainers में एक स्टेज चतुर्थ कैंसर रोगी से पूरे रक्त का लगभग 10 एमएल ड्रा.
2. प्रति मिनट 3000 क्रांतियों (rpm) पर दस मिनट के लिए ट्यूबों अपकेंद्रित्र.
3. रक्त के नमूने तीन अलग अलग परतों में अलग होगा: नीचे की परत एरिथ्रोसाइट्स, मध्यम परत, buffy कोट भी कहा जाता है शामिल हैं, leukocytes और मेलेनोमा कोशिकाओं शामिल है, और ऊपर परत प्लाज्मा और प्लेटलेट्स होते हैं. Buffy कोट परेशान बिना संभव के रूप में ज्यादा प्लाज्मा के रूप में निकालें.
4. जगह दो 1 एमएल Wintrobe ट्यूबों में 250 Histopaque 1077 की μL.
5. एक 9 "पाश्चर पिपेट का प्रयोग, शेष प्लाज्मा, पूरे buffy कोट, और भी एरिथ्रोसाइट्स के ऊपर परत को निकालने के लिए, <500 μL एकत्र सुनिश्चित करने के.
6. Histopaque परत के ऊपर समाधान प्लेस और 3000 rpm पर 10 मिनट के लिए 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में Wintrobe ट्यूबों अपकेंद्रित्र.
7. खून फिरअलग, लेकिन इस समय एरिथ्रोसाइट्स Histopaque द्वारा अलग किया जाएगा, buffy कोट की आसान निकासी के लिए अनुमति देता है. एक 9 "पाश्चर पिपेट का उपयोग करने के लिए पूरे buffy कोट प्राप्त है और यह एक 2 एमएल Eppendorf ट्यूब में जगह.
8. पीबीएस की 1.5 एमएल में 2% v / v बीच 20 के साथ buffy कोट निलंबित.

2. प्रवाह चैम्बर निर्माण

1. एक एक्रिलिक सिलेंडर, 20 मिमी बाहरी व्यास, 17 मिमी भीतरी व्यास, और 8 लंबा मिमी प्राप्त करते हैं. सिलेंडर के पक्ष के माध्यम से एक दूसरे से 90 डिग्री कोण पर तीन 5 मिमी व्यास छेद ड्रिल. बहुलक टयूबिंग (1.6 मिमी भीतरी व्यास, 5 मिमी बाहरी व्यास) के तीन टुकड़े काटें, और drilled छेद में उन्हें जगह है.
2. एक्रिलिक अंगूठी के नीचे के पार Parafilm खींचो करने के लिए एक पानी तंग सील कर. parafilm एक्रिलिक की अंगूठी के साथ एक उथले कटोरा रूपों और acrylamide समाधान है कि एक प्रवाह चैम्बर फार्म का होगा आयोजन करेगा.
3. टयूबिंग के टुकड़े से भर के माध्यम से एक 1.6 मिमी व्यास के तार निलंबितएक दूसरे, सुनिश्चित करें कि अकेले तार की अंगूठी के बीच के माध्यम से दिखाई देता है. एक 1.6 मिमी व्यास के तार और स्थिति ट्यूब एक निलंबित तार से दूर मिमी के साथ टयूबिंग के तीसरे टुकड़ा भरें. इन तारों ट्यूबिंग में प्रवेश करने से रोकने के acrylamide. बाद acrylamide solidifies, तार, निकाला जाएगा एक बेलनाकार प्रवाह पथ और एक जगह छोड़ने के लिए एक ऑप्टिकल फाइबर की स्थिति प्रवाह - पथ पर केंद्रित है.
4. तैयार acrylamide का 5 एमएल जोड़ें [20 g (सिग्मा Aldrich) acrylamide, 0.7 ग्राम bisacrylamide (सिग्मा Aldrich), आसुत जल के 100 एमएल] एक छोटे बीकर. अमोनियम persulfate (सिग्मा) की 0.02 ग्राम उपाय और यह बीकर को जोड़ने. 3 मिनट के लिए हलचल पट्टी के साथ मिक्स. बीकर के लिए 20 μL tetramethylethylenediamene (फिशर साइंटिफिक) जोड़ें. जल्दी से एक्रिलिक रिंग में मिश्रण डालना, शीर्ष पर भरने. कुछ सेकंड के बाद, समाधान जेल, एक प्रवाह चैम्बर मोल्ड बना. ध्यान से तार खींच बाहर, acrylamide जेल परेशान नहीं सुनिश्चित करने के. प्रवाह स्वेच्छाचारीसंख्या अब इस्तेमाल के लिए तैयार है.

3. Photoacoustic flowmetry सेट अप

1. Acoustically जोड़े एक piezoelectric polyvinylidene फ्लोराइड प्रवाह चैम्बर प्रवाह - पथ से ऊपर सीधे अल्ट्रासाउंड जेल का उपयोग करने के लिए ध्वनिक transducer (Panametrics).
2. एक संगीन Neill (BNC) Concelman केबल का उपयोग, एक RITEC ब्रॉडबैंड रिसीवर-640A (बाहर, highpass फिल्टर: 1 मेगाहर्ट्ज, imput प्रतिबाधा: 50 Ohms, प्रवर्धन: 35 डीबी Lowpass फिल्टर) के इनपुट के लिए transducer कनेक्ट. आस्टसीलस्कप (Tektronix टीडीएस 2024B) फिल्टर के उत्पादन में कनेक्ट. आस्टसीलस्कप को ट्रिगर करने के लिए, एक photodiode (Thorlabs) transducer के पास सेट कर दिया जाता है और एक BNC केबल का उपयोग कर आस्टसीलस्कप में plugged है.
3. एक टी संबंधक (लघु पार्ट्स) प्रवाह चैम्बर के एक हाथ से जुड़ी है. दो सिरिंज पंप (Braintree वैज्ञानिक) संबंधक के अन्य शाखाओं के लिए जुड़े हुए हैं. एक सिरिंज हवा होते हैं, जबकि अन्य सेल भाग 1 में तैयार निलंबन शामिल होंगे. प्रवाह दरों सेट100 μL / मिनट.
4. हवा रूपों में से एक एक छोटी सी जेब तक में प्रवाह चैम्बर के छोटे टयूबिंग निकालें, और है कि स्लॉट में 0.37 संख्यात्मक एपर्चर के साथ एक 1 मिमी व्यास कोर ऑप्टिकल फाइबर सम्मिलित. पानी के साथ जेब इंटरफ़ेस संकेतों को कम करने और प्रवाह - पथ पर लागू लेज़र प्रकाश की राशि में वृद्धि भरें. ऑप्टिकल फाइबर और प्रवाह - पथ के लिए कम दूरी की संख्यात्मक एपर्चर के कारण, लेजर केवल नमूने के किसी भी समय पर एक अलसाना चमकाना होगा, यह सुनिश्चित करना है कि लेजर के सामने में सीधे नमूना एक ही नमूना है photoacoustic संकेतों बनाने. लेजर ऊर्जा लगभग 28 MJ / ² सेमी 7 मिमी ² के एक स्थान आकार के साथ होना चाहिए .
5. पर दोनों सिरिंज पंप मुड़ें. जब दो अमिश्रणीय तरल पदार्थ टी जंक्शन तक पहुँचते हैं वे सजातीय slugs और transducer पिछले प्रवाह में विभाजित किया जाएगा.
6. बह नमूना चमकाना के साथ एक nanosecond लेजर स्पंदित करने के लिए मेलेनोमा कोशिकाओं में photoacoustic लहरें उत्पन्न. के रूप में मेलेनिन broadb हैऔर ऑप्टिकल अवशोषक, किसी भी दृश्य लेजर तरंग दैर्ध्य इस्तेमाल किया जा सकता है.
7. यदि एक संकेत आस्टसीलस्कप पर प्रकट होता है जब एक काउंटर transducer ऊपर है, अलसाना मेलेनोमा होता है, और एक संग्रह शीशी में छोड़ने तक प्रणाली के माध्यम से नज़र रखी जानी चाहिए.

4. Immunocytochemistry

1. Cytospin 4 अपकेंद्रित्र (थर्मो वैज्ञानिक) पर कब्जा कर लिया slugs लेने के क्रम में उन्हें गिलास स्लाइड के लिए ठीक है. प्लेस Cytofunnels में कांच स्लाइड (Shandon ईज़ी एकल Cytofunnel ब्राउन फ़िल्टर कार्ड थर्मो वैज्ञानिक के साथ) और Cytospin 4 अपकेंद्रित्र में उन्हें लोड. पीबीएस में 1% गोजातीय सीरम (सिग्मा) प्रत्येक कीप में albumin के 100 μL रखो और फिर 3 मिनट के लिए 600 rpm पर अपकेंद्रित्र करने में मदद के लिए कब्जा कर लिया कोशिकाओं गिलास स्लाइड के लिए छड़ी.
2. Centrifugation के बाद, Cytofunnels करने के लिए सेल के नमूने को जोड़ने और फिर 3 मिनट के लिए 600 rpm पर अपकेंद्रित्र. फिर एक इथेनॉल आधारित लगानेवाला के साथ स्लाइड्स स्प्रे.
3. 10 मिनट के लिए पीबीएस में स्लाइड्स दो बार धोएं.
4. ऊष्मायन के बाद, कमरे के तापमान पर एक humidified कक्ष में 1 घंटे के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के साथ स्लाइड्स और सेते छानना. प्रत्येक स्लाइड 1% मार्ट 1 खरगोश में उठाया एंटीबॉडी, 1% CD-45 माउस में उठाया एंटीबॉडी, 10% बकरी सीरम, और 89% पीबीएस शामिल करना चाहिए.
5. ऊष्मायन के बाद, 10 मिनट के लिए तीन बार पीबीएस में स्लाइड्स धो लो.
6. स्लाइड्स तो एक माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान है, जो fluorophore एंटीबॉडी के लिए बाध्य किया गया है में incubated हैं. मिश्रण 0.05% विरोधी खरगोश एंटीबॉडी, बकरी, 0.05% बकरी विरोधी माउस एंटीबॉडी, 0.1% बकरी सीरम, और 99% पीबीएस शामिल हैं. स्लाइड्स अंधेरे में 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर incubated हैं.
7. ऊष्मायन के बाद छानना, स्लाइड्स पीबीएस में 5 मिनट के लिए तीन बार धो लो.
8. एक नाभिक के लिए दाग, 0.1 DAPI / μg एमएल (Invitrogen) के लिए के साथ कोशिकाओं सेते1 मिनट. तब स्लाइड्स छानना और पीबीएस में धो.
9. सेल नमूना से अधिक स्लाइड प्रति राल आधारित बढ़ते मीडिया के 20 μL का उपयोग coverslip माउंट. स्पष्ट नेल पॉलिश के साथ coverslip सील स्लाइड बनाए रखने के लिए. अब स्लाइड्स के लिए एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के साथ imaged किया जा करने के लिए तैयार हैं.

5. प्रतिनिधि परिणाम:

चित्रा 1 सफेद रक्त कोशिकाओं और मेलेनोमा कोशिकाओं से photoacoustic waveforms यहाँ दिखाए जाते हैं. सफेद रक्त कोशिकाओं, कोई अंतर्निहित pigmentation के होने, इलेक्ट्रॉनिक शोर के एक फ्लैट लाइन (बाएं) के रूप में कोई photoacoustic तरंगों और प्रकट उत्पादन. pigmented मेलेनोमा कोशिकाओं एक मजबूत photoacoustic लहर (दाएं) पैदा करता है.

चित्रा 2 immunocytochemical धुंधला के बाद, सुसंस्कृत मेलेनोमा कोशिकाओं बीएल में DAPI संकेतों दिखानेue जबकि MART1 हरे रंग में प्रकाश डाला है.

चित्रा 3. DAPI और MART1 के लिए छवियों overlaying, चित्रा 2 के रूप में, leukocytes के एक संकेतक के रूप में CD45 के साथ, यह आंकड़ा कई सफेद रक्त कोशिकाओं के बीच मेलेनोमा कोशिकाओं से पता चलता है.

CTCs का पता लगाने के अभी भी बहुत कुछ नैदानिक ​​दुर्लभ ट्यूमर कोशिकाओं को अलग करने की कठिन समस्या के कारण अनुप्रयोगों के साथ एक अनुसंधान प्रधान क्षेत्र है. RT-पीसीआर, microfluidic सेल पर कब्जा, immunomagnetic कब्जा, और अन्य तरीकों ^8-12 सहित सीटीसी का पता लगाने, के लिए कई अन्य तकनीकों का मूल्यांकन किया जा रहा हैं. हालांकि, CMCs शो के photoacoustic पता लगाने का वादा के रूप में यह लेबल मुक्त है और एक तेजी से और सही छोटे, प्रकाश को अवशोषित कणों पर कब्जा करने का मतलब प्रदान करता है.

प्रोटोकॉल के लिए सफेद रक्त कोशिकाओं को अलग वर्णित अत्यधिक कुशल है, अभी तक लाल रक्त कोशिकाओं की एक कम संख्या में नमूने में मौजूद है. ये लाली contaminating कोशिकाओं को भी लेसर प्रकाश को अवशोषित है, लेकिन एक बहुत कमी आई स्तर पर. लाल रक्त कोशिकाओं हमारे मेलेनोमा पहचान प्रणाली के साथ हस्तक्षेप नहीं यह सुनिश्चित करने के के लिए, पांच स्वस्थ रोगी के नमूने प्रणाली के माध्यम से शुरू किए गए थे और कोई भी एक संकेत दे दी है, यह दर्शाता है कि लाल रक्त कोशिकाओं के लिए काफी कम सांद्रता में मौजूद हैंहो अवहेलना.

एकाग्रता के अध्ययन की एक श्रृंखला सुसंस्कृत मेलेनोमा कोशिकाओं का उपयोग कर और photoacoustic प्रवाह प्रणाली संवेदनशील 1 सेल / μL (अप्रकाशित डेटा) करने के लिए नीचे सिद्ध किया गया है आयोजित किया गया है. इन अध्ययनों जा रहे हैं और जल्द ही कैंसर रोगी के नमूने का उपयोग कर परीक्षण शामिल होंगे.

इस photoacoustic तकनीक भी और exogenous chromophores संलग्न द्वारा स्तन और प्रोस्टेट कैंसर जैसे गैर pigmented CTCs में उपयोग के लिए मूल्यांकन किया जा रहा है. हम प्रारंभिक कैंसर cells13 पर सोने के नैनोकणों का उपयोग कर काम किया है. इन परीक्षणों से पता चला है कि नैनोकणों आवश्यक ऑप्टिकल अवशोषण प्रदान करने के लिए photoacoustic लहरें उत्पन्न कर सकते हैं. शेष तकनीकी चुनौती है कैंसर की कोशिकाओं को इस तरह के कणों चुनिंदा देते हैं.

जॉन ए यात्री यात्री टेक्नोलॉजीज इंक, एक मानव स्वास्थ्य के सुधार के लिए photoacoustic प्रौद्योगिकी का व्यवसायीकरण करने के लिए गठित कंपनी के संस्थापक और अध्यक्ष है.

हम जैव इंजीनियरिंग और क्रिस्टोफर एस बॉण्ड मिसौरी विश्वविद्यालय में जीवन विज्ञान केंद्र के विभाग के समर्थन स्वीकार करते हैं. हम मिसौरी लाइफ साइंसेज रिसर्च बोर्ड 09-1034 और R21CA139186-0 NIH से अनुदान सहायता स्वीकार करते हैं. हम भी वित्तीय सहायता के लिए मिसौरी, मिसौरी आण्विक कोशिका विज्ञान कोर विश्वविद्यालय और इंजीनियरिंग कॉलेज मिसौरी विश्वविद्यालय के विश्वविद्यालय में जीवन विज्ञान अंडर ग्रेजुएट रिसर्च अवसर कार्यक्रम धन्यवाद.

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