成長因子Progranulinと相互作用するタンパク質を識別するように変更酵母ツーハイブリッドシステム

1。背景情報

酵母ツーハイブリッドシステムは、タンパク質-タンパク質相互作用^16、17を発見するのに使用される強力な遺伝学的手法です。などのLexA -ベースのシステム、SOSの募集システム、および細菌または哺乳類細胞ベースの2 - ハイブリッドとして2 - ハイブリッドシステム、、いくつかの種類が市販されている、この論文では特に、最も一般的に使用されるGAL4ベースの変更に焦点を当てて酵母2 - ハイブリッドシステム。簡単に言えば、法はDNA結合および転写活性化に関与する分離可能なドメインから構成される酵母のGAL4タンパク質の性質に基づいています。獲物のタンパク質がGAL4活性化ドメイン（AD）への融合体として発現している間、baitタンパク質は、GAL4 DNA結合ドメイン（DNA - BD）の融合として表現さ​​れます。餌と獲物の融合タンパク質間の相互作用は、酵母のGに統合されているレポーター遺伝子を含むGAL4結合部位の転写アクティベーションにつながるenome。 Y2Hの原理を図に示します。 1と実験手順を図にまとめられている。 2。

2。必要な材料とソリューション

1. YPD培地（ペプトンのブレンド、酵母エキス、およびほとんどのサッカロマイセスセレビシエ菌を成長させるための最適な割合でブドウ糖）。
2. 最小限の合成定義（SD）塩基は酵母窒素塩基、硫酸アンモニウム、及び炭素源を含む最小のSDベース（、デキストロース。ドロップアウト（DO）サプリメントは、指定を欠く合成、定義された培地を作るためのMinimal SD Baseに追加することができます。栄養素）。
3. レイ/ - Trpをドロップアウト（DO）サプリメント（ロイシンおよびトリプトファンを除く全ての必須アミノ酸を含む）
4. -His/-Leu/-Trp/-Uraドロップアウト（DO）サプリメント（ロイシン、トリプトファン、ヒスチジン、およびウラシルを除くすべての必須アミノ酸を含む）
5. ルリア培地（LB）（トリプトン10g / L、酵母エキス5g / L、塩化ナトリウムを5g / L）
6. X- ギャル（5 - ブロモ-4 - クロロ-3 - インドリル-β- D -ガラクトピラノシド）ソリューション：Nで20 mg / mlのストック溶液として調製し、N -ジメチルホルムアミド
7. 10X TE（100mMトリス- HCl（pH 7.5）を、10mMのEDTA、オートクレーブ処理したもの）
8. 超音波処理したニシンやサケ精子DNA、ゆで（10 mg / ml）を
9. 10X LiAc（1 M酢酸リチウム、オートクレーブ処理したもの）
10. 50％PEG - 3350ソリューション、フィルター滅菌
11. 3 - アミノ-1、2、4 - トリアゾール（3AT）
12. カナマイシン
13. アンピシリン
14. ELECTROMAXDH5α細胞
15. Zバッファ：16.1グラムNa2HPO4 7H2O（または8.52グラム無水）、H2O 5.5グラムリン酸二水素ナトリウム（または4.8 ganhydrous）、0.75グラムのKCl、0.246グラム硫酸マグネシウム7H2O（または0.12グラム無水）、1リットルのオートクレーブ、蒸留水に溶解して調整pH 7.0の。

3。餌の世代（pDBLeu - PGRN）

シグナルペプチド（aa21 - 588）を欠いているcDNA断片のエンコーディングPGRNは、方向的に、pDBLeuベクトルのSalI -をNot I部位（ProQuestのツーハイブリッドシステム、Invitrogen）にクローニングしたpDBLeu - PGRNを生成するためのGAL4 DNA結合ドメインと同様の翻訳読み枠を保持。

1. インフレーム融合を可能にする制限部位を（3'末端サル5'末端にIおよびNot I）を含むように設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いたPCRにより、上記のPGRNのcDNA断片を増幅する。
2. ゲルPCR産物を精製し、制限付きダイジェストはSalIとはI.エンドヌクレアーゼ
   同一の制限エンドヌクレアーゼによる二重制限消化によりDBベクトルpDBLeuを準備します。
3. 線形化pDBLeuベクターに制限PGRN断片をライゲーションし、25μg/ mlのLB +カナマイシンのための選択とDH5αに変身。
4. DNAシークエンシングでは構成要素の修正を確認してください。

4。プラスミド餌の小スケール変換

1. Mav203（Invitrogen社）のコロニーをYPDの5 mlを接種し、30℃一晩振とう℃を
2. YPD 50mlに一晩培養を希釈する。アドインを拡大itional 2〜4時間。
3. 室温で5分間3000rpmでペレットは、細胞。オートクレーブ、蒸留水40mlにペレットを再懸濁する。
4. 再ペレット細胞。私は、RTで10分間でインキュベート溶液2mlに再懸濁します。
   溶液I：0.5ミリリットル10xLiAc、0.5ミリリットル10xTE、4ミリリットルH ₂ O
5. pDBLeu - PGRNの2-3μL（0.25μg/μl）と変性剪断サケ精子DNA（10μg/μl）10μlの：チューブにDNAを分注する。 100μlの酵母細胞を追加して、よく混ぜる。
6. 700μl溶液IIを追加、よく混ぜる。 30℃で30分間インキュベートします。 II液：0.2ミリリットル10xLiAc、0.2ミリリットル10xTE、1.6ミリリットル50パーセントPEG3350。
7. 42℃のヒートショック℃で15分間。
8. 2分間ペレット。上清を捨てる。 200μlのオートクレーブ、蒸留水でペレットを再懸濁する。
9. 段階希釈によるSD - Leuのプレート上にサスペンションプレート。 2〜3日、30℃でインキュベートする。

5。餌の検証

いやを行う前に自己活性化し、HIS3レポーター遺伝子の基底発現レベルを決定するためのSTツーハイブリッドスクリーニング、テストpDBLeu - PGRN。このテストでは、餌が転写を活性化するかどうかと自己活性化は阻害剤によって中和することができるかどうかを決定します。 3 -アミノ-1、2、4 -トリアゾール（3 - AT）は、HIS3 -遺伝子産物の競合阻害剤であり、ヒスチジン欠乏培地での増殖に必要なHIS3の発現の最小レベルを滴定するために使用することができます。

1. 酵母Mav203ひずみ、プレートSD - Leuのプレートに変換にpDBLeu - PGRNを変換し、そして30℃で48〜72時間インキュベート℃に
2. にオートクレーブつまようじを使用して、各形質転換からのパッチのコロニーSD - LEU -彼の10mMの濃度で3 - ATを含むプレート、25mMの、50mMの、75mMの、及び100mM。 - AT 3は3 - ATの存在下で増殖できるようになるHIS3酵素と自己活性化を示す唯一の餌の競合的阻害剤です。
3. プレートcontainiに成長する餌株NGの100mM 3 - ATは、ツーハイブリッドスクリーンでの使用には適していません。使用できる餌のために、最低3 - AT濃度の細胞増殖を阻害します。多くの場合、3 - ATの25mMのスクリーニングに使用されます。

6。 cDNAライブラリーのスクリーニング

プラスミドpDBLeu - PGRNは、上述したように小規模の変換を使用してMaV203に導入される。 MaV203（pDBLeu - PGRN）にpPC86 -ライブラリ（Invitrogen）を導入するため、手順は以下のとおり、通常、プラスミドライブラリーDNAの0.5μgで〜4 × 10 ⁴コロニーが得られます。したがって、2.5 × 10 ⁶の酵母形質転換体は、〜30.0μgのpPC86 - cDNAライブラリープラスミドDNA、25の変換、五十10cmのプレート（SD - Leuの- TRP -彼の浦3 AT）が必要になります。

1. プレート（下の手順のための50）に10cmのSD - Leuの- TRP -彼の浦3の適切な数を準備します。また、形質転換体の数を推定するために少なくとも4つの10cmのSD - LEU - Trpプレートを準備。
2. ライブラリへの変換下記の手順に従ってpDBLeu - PGRNを含むMaV203。
   1. 〜100μlのオートクレーブ、蒸留水でMaV203のいくつかの単離されたコロニー（pDBLeu - PGRNを）中断して、10cmのSD - Leuのプレートの上にそれらを広げ。第二SD - Leuの板のための手順を繰り返します。 30℃で18〜24時間の両方のプレートをインキュベート℃に
   2. 削ると完全に10ミリリットルオートクレーブ、蒸留水で細胞を懸濁する。 〜0.1のOD _600を与えるためにフラスコ内の液体YPD培地500mlに細胞懸濁液の十分なボリュームを追加します。
   3. ODは、接種後〜0.1であることを確認してください。
   4. OD _600が約0.4に達するまで30℃で振とうする。
   5. 新鮮な準備：
      1. 11ミリリットル10X TE、11ミリリットル10X LiAc、および88ミリリットルオートクレーブ水を組み合わせることにより、110ミリリットル1 × TE / LiAc。
      2. 1.6ミリリットル10X TE、1.6ミリリットル10X LiAc、および12.8ミリリットルの50％PEG - 3350を組み合わせることで、16ミリリットルPEG / LiAc。
   6. 室温で5分間、3000グラムで、細胞を回収します。
   7. tを捨てる彼は清と穏やかに、室温で100ミリリットルオートクレーブ、蒸留水でピペッティングでペレットを再懸濁します。
   8. 室温で5分間3000gで遠心する。
   9. 遠心分離細胞の上清を捨て、50 mlの1X TE / LiAc溶液中で細胞ペレットを再懸濁します。
   10. 室温で5分間3000gで遠心する。
   11. 上清を取り除くと2.5 mlの1X TE / LiAc溶液の最終体積でペレットを再懸濁します。
   12. 25の変換を実行します。 2.5ミリリットルの細胞、125μlの（10μg/μl）変性剪断サケ精子DNA、および30μgのcDNAライブラリーを組み合わせる。ピペッティングにより穏やかに混合。 15ミリリットルPEG / LiAcソリューションを加え、穏やかに混ぜる。 700μlを各25オートクレーブした1.5​​ mlのマイクロ遠心チューブに分注し。
   13. 30 ° Cの水浴中で30分間インキュベート。
   14. 42℃の水浴中で15分間熱ショック。
   15. 室温で1分間6,000 × gで遠心する。慎重にスーパーを削除する上清。優しく上下にピペッティングすること400μlのオートクレーブ、蒸留水でそれぞれのペレットを再懸濁します。
3. プレートシングル10cmのSD - Leuの- TRP -彼の浦3 AT（3AT濃度：25mM）を上に各形質転換から200μlの形質転換混合物スプレッドのバーを使用してプレートには、その25は、1.5 mlのマイクロ遠心チューブに50プレートを作ることができるオートクレーブ（SD - Leuの- TRP -彼の浦+3 AT）。
4. 30℃で5-10日間培養する℃を
5. 反応の形質転換効率を推定するために、一つの反応（1:40、1:400と1:4000）の連続希釈液をSD - Leuの- TRPプレート上にプレーされています。 30℃で3日間Cインキュベートした後、コロニー数を計数し、形質転換体の総数が計算されます。

7。 X - galアッセイ

1. YPDプレートにコロニーを移し、30℃で一晩。
2. 場所は、YPDプレート上にニトロセルロース膜を丸め、膜とYPDプレートの間に気泡がないことを確認してください。 1〜2分、MA後のKEは、必ずすべてのコロニーは、膜（ニトロセルロース紙）に転送されます。
3. アルミ箔の紙で作られたボートで膜のコロニー側を上に置きます。
4. 液体窒素中にメンブレンを入れ、数分のために液体窒素中に20秒、と水没を待つ。
5. 雪解けに膜を取り出して。
6. 一方、以下の試薬を混ぜる。
   1.5ミリリットルZバッファ
   20μlのX - galを（20 mg / ml）を
7. その上に場所ワットマン濾紙、ペトリ皿の中でZバッファー/ X - galを削除します。
8. ワットマン濾紙の上にニトロセルロース紙を慎重に置きます。
9. 青色のコロニーが現れるまで37℃でインキュベートする。

8。再変換アッセイ

ライブラリーのスクリーニングから単離された獲物の融合タンパク質（AD - Y）は、酵母に餌の融合タンパク質との相互作用（DB - X）レポートの遺伝子を誘導するために、そして獲物のクローンと餌の構造の再変換を維持する必要がありますさらに偽陽性を排除し、追加を容易にすることができますitional分析。

1. 潜在的に相互作用するタンパク質を含む酵母菌株からプラスミドDNAを単離する。
2. 大腸菌にDNAを変換DH5α細胞を、プレートLB 100μg/ mlのアンピシリンプレート上での変換が選択的にpPC86 - cDNAライブラリーを分離し、37℃で一晩インキュベートする℃まで
3. LB 100μg/ mlのアンピシリンをスープに入れてプレートからいくつかのコロニーを選択してください。
4. ミニプレップDNAを準備およびSal IおよびNot Iで二重制限分析により確認し
5. 共同変換、MaV203に獲物がプラスミドと餌プラスミドプレートSC - LEU - Trpプレート上で形質転換混合物、および30℃で2-3日インキュベート℃に
6. SC - Leuの- TRPプレートから3つの異なるコロニーを選択、X - galアッセイを行います。

9。シーケンシングとバイオインフォマティクス解析

シーケンス可能性が真の陽性クローンから単離されたプラスミドDNAは、BLAを使用してGenBankのものにこれらのシーケンスを比較するSTプログラム、および既知の遺伝子に対応するこれら二つのハイブリッドクローンを識別する。配列データは、上記で得られた12陽性の二つが​​細胞表面TNFR2（;アク＃NM_130426 TNFRSF1B/CD120b）であることを示した。さらに、PGRNとTNFRとの間の相互作用は、インビトロ固相結合アッセイ、共免疫沈降法、表面プラズモン共鳴分析、およびフローサイトメトリーアッセイ¹⁴を含む様々なタンパク質-タンパク質相互作用アッセイを、使用して検証した。

10。代表的な結果

スクリーニングのフローチャートを図で説明されています。 3。通常は50から100までの正のクローンの候補者は、この段階で得られます。我々は、最初にPGRN餌でスクリーニング250万形質転換体のうち54陽性クローンの候補を単離した。陽性クローンの候補は、X - galアッセイを行うことにより検証した。通常は、約50％の偽陽性クローンは、X - galアッセイを介して削除されます。私たちは、率直な23の陽性クローンを得 PGRNの餌（ 図4）のためのこのステップでATES。獲物のクローンと酵母に餌の構造の再変換は、さらに、まだレポーター遺伝子は、おそらく真の陽性を表すアクティブに偽陽性とクローンを排除する。通常は、約50％の陽性クローンの候補が削除されます。我々は最終的に酵母におけるPGRNと相互作用する12個の陽性クローンを単離した。

図酵母ツーハイブリッドシステム1。原理

図2酵母ツーハイブリッドシステムを用いたタンパク質結合パートナーを同定するのパイプライン

スクリーニング酵母ツーハイブリッドライブラリの図3。フローチャート。rge.jpg"ターゲット="_blank">この画像のフルサイズバージョンを表示するにはここをクリックしてください。

陽性クローンの候補の図4。β-ガラクトシダーゼアッセイ。ライブラリ画面から得られる、陽性クローンをYPDプレートに移し、30℃で一晩インキュベートした; Bは、YPDプレート上のすべてのコロニーをニトロセルロース膜に転写し、β-ガラクトシダーゼアッセイは、実施した。

酵母ツーハイブリッドスクリーニングは、タンパク質の相互作用^16、17を同定^する際に有効なツールであることが証明されている。このような生化学的共精製とプロテインチップなどの蛋白質 - 結合パートナーを同定するための他のアプローチと比較して、酵母ツーハイブリッドシステムは、比較的単純な実験でコード配列の非常に高い数字をスクリーニングに用いることができる敏感な遺伝学的アプローチであり、でさらには、それはin vivoでの相互作用で検出し、複雑なタンパク質の精製を必要としません。もちろん、酵母ツーハイブリッドシステムは、例えば、必要な翻訳後修飾、不十分なフォールディングおよび/または融合タンパク質の安定性、および変更された細胞内局在の不在を制限があります（タンパク質が核に運ばれ、このしているかもしれない）実際の生理的状態ではない。さらに、レポーター遺伝子、例えば、自己活性化、のスプリアス活性を示すタンパク質は、直接餌CDをスクリーニングするための餌として使用することはできません。NAライブラリ。この欠点を克服するために、個々の機能ドメインの代わりに、無傷のタンパク質は、通常、無傷のタンパク質で、様々なアプローチを用いて相互作用の検証に続いて餌として使用されます。例えば、我々は成功したADAMTS - 7メタロプロテイナーゼと餌^10、13とCOMPのEGF様ドメインを使用してCOMPの結合パートナーとしてprogranulinの成長因子を単離した。

宿主が酵母である形質転換体を、2番目のマイナス、3枚のプレート（SDに転送される彼の+のクローンを、選択するには、最初のマイナス3枚のプレート（SD - Leuの- TRP -彼の3 AT）上に播種されているため、従来のスクリーニング手順は、時間がかかり、裏の選択用）AT - LEU -トリプトファンの浦3。さらに、陽性クローンの数千の複製は、特別なツールを必要とし、この画面のプロセスは、多くの場合、偽陽性の大規模な数の結果。我々は、直接ではなく、マイナス4枚のプレート（SD - Leuの- TRP -彼の浦3 AT）は、2つのminuで酵母の形質転換体をプレーティングS - 3枚のプレート、真の相互作用のクローンが同時に酵母のゲノムに組み込まレポーター構築物（すなわち生産ヒスチジン、およびウラシル）のすべてをアクティブにするとマイナス4枚のプレートに存続することができるはずなので（SD - Leuの- TRP - Hisを、 ）AT裏3。この変更は、著しくプロセスを短縮（変更画面の手順は、わずか5〜10日必要なのに対し、従来のスクリーニング手順は、通常、10〜20日かかるなど）、作業負荷を軽減、そして、最も重要なのは、偽陽性の数を減らします。さらに、このアプローチは、再現性と信頼性であり、そして我々が正常にナトリウムチャネル¹²と細胞外マトリックスタンパク質^10、13を含む様々な餌、の結合タンパク質を単離することに、この修正されたシステムを採用している。最近、我々はこの成長因子に関連する将来の発見のための強固な基盤を提供し、このアプローチ^14、15を使用^して、TNF受容体の新規リガンドとしてPGRNを同定した。