Modificeret Gær-Two-Hybrid system til at identificere Proteiner Interaktion med Growth Factor Progranulin

1. Baggrundsinformation

Den gær to-hybrid-system er en stærk genetisk teknik, der bruges til at opdage protein-protein interaktioner ^{16, 17.} Flere typer af 2-hybrid systemer, såsom Lexa-baserede systemer, SOS Rekruttering System, og bakterier-eller pattedyr celle-baseret 2-hybrider, der er kommercielt tilgængelige, dette dokument specifikt fokuseres på ændringer af de mest almindeligt anvendte GAL4 baseret gær 2-hybrid-system. Kort fortalt, er metoden baseret på egenskaberne af gær GAL4 protein, der består af adskillelige domæner ansvarlig for DNA-bindende og transkriptionel aktivering. Den agn protein er udtrykt som en fusion til GAL4 DNA-bindende domæne (DNA-BD), mens byttet proteiner udtrykkes som fusioner til GAL4 aktivering domæne (AD). Samspil mellem agn og byttedyr fusion proteiner fører til transkriptionelle aktiveringer af GAL4-bindingssteder indeholdende reporter gener, der er integreret i gær genome. Princippet om Y2H er illustreret i Fig. 1, og den eksperimentelle procedure er opsummeret i Fig. 2.

2. Nødvendige materialer og løsninger

1. YPD Vækst Medium (en blanding af pepton, gærekstrakt, og druesukker i optimale forhold til dyrkning af de fleste Saccharomyces cerevisiae stammer).
2. Minimal SD Bases (Minimal syntetisk defineret (SD) baser omfatter en Yeast Nitrogen Base, ammonium sulfat, og kulstofkilde, dextrose. Dropout (DO) kosttilskud kan føjes til Minimal SD Base til at foretage en syntetisk, defineret medium mangler den angivne næringsstoffer).
3. Leu /-TRP Dropout (DO) tillæg (som indeholder alle essentielle aminosyre undtagen leucin og tryptophan)
4. -His/-Leu/-Trp/-Ura Dropout (DO) Supplement (som indeholder alle essentielle aminosyre undtagen leucin, tryptofan, histidin, og uracil)
5. Luria-bouillon (LB) (trypton 10 g / L, Gærekstrakt 5 g / L, NaCl 5 g / L)
6. X-Gal (5-bromo-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) løsning: udarbejdet som en 20 mg / ml stamopløsning i N, N-dimethylformamid
7. 10X TE (100 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM EDTA, autoklaveret)
8. Sonicated Sild eller Laks Sperm DNA, kogt (10 mg / ml)
9. 10X LiAc (1 M lithium acetat, autoklaveret)
10. 50% PEG-3350-løsning, filter-steriliseret
11. 3-Amino-1, 2, 4-triazol (3AT)
12. Kanamycin
13. Ampicillin
14. ELECTROMAX DH5α celler
15. Z buffer: 16,1 g Na2HPO4 7H2O (eller 8,52 g vandfrit), 5,5 g NaH2PO4 H2O (eller 4,8 ganhydrous), 0,75 g KCl, 0,246 g MgSO4 7H2O (eller 0,12 g vandfri), opløst i 1 L autoklaveres, destilleret vand og justeres til pH 7,0.

3. Bait generation (pDBLeu-PGRN)

En cDNA fragment kodning PGRN mangler signal peptid (aa21-588) blev retningsbestemt klonet ind i Sal I-Ikke jeg lokaliteter af pDBLeu vektor (de ProQuest to-hybrid-system, Invitrogen),holde den samme oversættelse læseramme som GAL4 DNA bindende domæne til at generere pDBLeu-PGRN.

1. Forstærke cDNA fragment af PGRN beskrevet ovenfor ved PCR ved hjælp af oligonukleotide primere konstrueret til at indeholde begrænsninger sites (Sal jeg ved 5'end og ikke mig ved 3'end), der giver mulighed for frame fusion.
2. Gel rense PCR-produkt, koncentrat med begrænsninger endonucleases Sal I og Not I.
   Forbered DB vektor pDBLeu ved at dobbeltklikke begrænsning fordøjelsen med det samme restriktion endonucleases.
3. Ligate begrænsningen PGRN fragment i lineariseret pDBLeu vektor og omdanne til DH5α med udvælgelse til LB + kanamycin på 25 mikrogram / ml.
4. Kontroller korrektion af konstruktionen ved DNA-sekventering.

4. Lille skala transformation af lokkemad plasmid

1. Podes 5 ml YPD med en koloni af Mav203 (Invitrogen), ryste natten over ved 30 ° C.
2. Fortynd natten kulturen i 50 ml YPD. Grow et tilføjelsesprogramtab i et 2-4 timer.
3. Pellet cellerne ved 3000 rpm i 5 minutter ved RT. Resuspender pellet i 40 ml autoklaveret, destilleret vand.
4. Re-pillen cellerne. Resuspenderes i 2 ml oploesning I, inkubér ved RT 10 min.
   Løsning I: 0,5 ml 10xLiAc, 0,5 ml 10xTE, 4 ml H ₂ O
5. Dispenser DNA på rør: 2-3 μl af pDBLeu-PGRN (0.25μg/μl) og 10 μl af denatureret, forskydes laks sperm DNA (10μg/μl). Tilføj 100μl gærceller, bland godt.
6. Tilføj 700μl løsning II, bland godt. Inkuber ved 30 ° C i 30 min. Løsning II: 0,2 ml 10xLiAc, 0,2 ml 10xTE, 1,6 ml 50% PEG3350.
7. Heat shock på 42 ° C i 15 min.
8. Pellet i 2 min. Supernatanten fjernes. Resuspender pellet i 200 μl autoklaveres, destilleret vand.
9. Plate suspensionen på SD-Leu plader med seriefortyndinger. Inkubér pladen ved 30 ° C i 2-3 dage.

5. Bait validering

Før du udfører jast to-hybrid-screen, test pDBLeu-PGRN for selv-aktivering og bestemme den basale udtryk niveauer i HIS3 reporter genet. Denne test afgør, om lokkemad aktivere transkription og om selvaktivering kan neutraliseres af inhibitorer. 3-Amino-1, 2, 4-triazol (3-AT) er en kompetitiv hæmmer af den HIS3-genet produkt og kan bruges til at titrere minimum af HIS3 udtryk kræves for vækst på histidin-mangel medier.

1. Transformer pDBLeu-PGRN ind gær Mav203 stamme, plade omdannelsen på SD-Leu plader, og inkuber i 48-72 timer ved 30 ° C.
2. Patch kolonier fra hver transformation ved hjælp af autoklaveres tandstikkere på SD-Leu-Hans plader, der indeholder 3-AT ved koncentrationer på 10 mm, 25 mm, 50 mm, 75 mm og 100 mm. 3-AT er en kompetitiv hæmmer af HIS3 enzymet og kun lokkemad, der udviser selv-aktivering vil være i stand til at vokse ved tilstedeværelse af 3-AT.
3. Agn stammer, der vokser på plader containing 100 mM 3-AT er ikke egnet til brug i de to-hybrid skærm. For lokkemad, der kan bruges, skal du bruge laveste 3-i en koncentration, der hæmmer cellevækst. I mange tilfælde er 25 mm 3-AT anvendes til screening.

6. cDNA bibliotek screening

Den pDBLeu-PGRN plasmid tilføres MaV203 hjælp af en lille skala transformation som beskrevet ovenfor. At indføre pPC86-bibliotek (Invitrogen) i MaV203 (pDBLeu-PGRN), proceduren beskrevet nedenfor typisk giver ~ 4 x 10 ⁴ kolonier med 0,5 mikrogram plasmid bibliotek DNA. Derfor vil 2,5 x 10 ⁶ gær transformanter kræver ~ 30,0 mikrogram pPC86-cDNA bibliotek plasmid-DNA, 25 transformationer, og halvtreds 10-cm plader (SD-Leu-Trp-Hans-Ura 3 AT).

1. Forbered passende antal 10-cm SD-Leu-Trp-Hans-Ura 3 PÅ plader (50 til proceduren nedenfor). Også forberede mindst fire 10-cm SD-Leu-Trp plader for at anslå antallet af transformanter.
2. Omdanne biblioteket tilden MaV203 indeholder pDBLeu-PGRN i henhold til proceduren beskrevet nedenfor.
   1. Suspendere flere isolerede kolonier af MaV203 (pDBLeu-PGRN) i ~ 100μl autoklaveres, destilleret vand og sprede dem på en 10-cm SD-Leu plade. Gentag proceduren for et andet SD-Leu plade. Inkubér begge plader i 18-24 timer ved 30 ° C.
   2. Skrab og helt udeluk cellerne i 10 ml autoklaveret, destilleret vand. Tilføj en tilstrækkelig mængde af cellesuspension til 500 ml væske YPD medie i en kolbe at give en OD ₆₀₀ af ~ 0,1.
   3. Kontroller, at OD er ​​~ 0,1 efter inokulering.
   4. Ryst ved 30 ° C indtil OD ₆₀₀ når ~ 0,4.
   5. Forbered friske:
      1. 110 ml 1X TE / LiAc ved at kombinere 11 ml 10X TE, 11 ml 10X LiAc, og 88 ml autoklaveres vand.
      2. 16 ml PEG / LiAc ved at kombinere 1,6 ml 10X TE, 1,6 ml 10X LiAc, og 12,8 ml 50% PEG-3350.
   6. Pellet cellerne på 3000g i 5 minutter ved stuetemperatur.
   7. Kassér than supernatanter og forsigtigt resuspender pellet ved pipettering op og ned i 100 ml autoklaveret, destilleret vand ved stuetemperatur.
   8. Centrifuger ved 3000 gi 5 min ved stuetemperatur.
   9. Supernatanten af ​​centrifugeres celler og resuspender cellepelleten i 50 ml 1X TE / LiAc løsning.
   10. Centrifuger ved 3000 gi 5 min ved stuetemperatur.
   11. Fjern supernatanter og resuspender pellet i en endelig volumen på 2,5 ml 1X TE / LiAc løsning.
   12. Udføre mere end 25 transformationer. Kombiner 2,5 ml celler, 125 μl (10μg/μl) denatureret, forskydes laks sæd DNA, og 30 mikrogram cDNA bibliotek. Bland forsigtigt ved pipettering op og ned. Tilsæt 15 ml PEG / LiAc løsning og bland forsigtigt. Alikvot til 25 autoklaveres 1,5-ml mikrocentrifugerør på 700 μl hver.
   13. Inkuber i 30 minutter i en 30 ° C vandbad.
   14. Heat shock i 15 min i en 42 ° C vandbad.
   15. Centrifugér ved 6.000 g for 1 minut ved stuetemperatur. Tag forsigtigt supernatant. Forsigtigt resuspender hver pellet i 400 μl autoklaveres, destilleret vand ved pipettering op og ned.
3. Plate de 200 μl transformation blanding fra hver transformation på en enkelt 10-cm SD-Leu-Trp-Hans-Ura 3 AT (3AT koncentration: 25 mm) plader ved hjælp af en spredt bar, så 25 autoklaveres 1,5-ml mikrocentrifugerør kan lave 50 plader (SD-Leu-Trp-Hans-Ura 3 AT).
4. Pladerne inkuberes i 5-10 dage ved 30 ° C.
5. For at estimere transformationseffektivitet af reaktionen, serielle fortyndinger af en reaktion (1:40, 1:400 og 1:4000) er belagte på SD-Leu-Trp plade. Efter inkubation i 3 dage ved 30 ° C, er antallet af kolonier tælles, og det samlede antal beregnet transformanter.

7. X-gal assay

1. Overførsel kolonier til YPD plade; inkuber ved 30 ° C natten over.
2. Placer afrundet Nitrocellulose membran på YPD pladen; sørg for der er ingen bobler mellem membranen og YPD plade. Efter 1-2 min, MAKE sikker på at alle kolonier er overført til membraner (nitrocellulose papir).
3. Placer membranen koloni opad i båd lavet med aluminiumsfolie papir.
4. Sæt membranen ind i flydende kvælstof, vent 20 sekunder, og dykke ind i flydende nitrogen i et par minutter.
5. Tag membran til at tø.
6. Imens blandes følgende reagens:
   1,5 ml Z buffer
   20μl X-gal (20 mg / ml)
7. Drop Z buffer / X-gal i en petriskål, sted Whatman papir oven på det.
8. Anbring forsigtigt nitrocellulose papir oven på Whatman papir.
9. Inkuber ved 37 ° indtil blå kolonier vises.

8. Retransformation assay

Prey fusion proteiner (AD-Y) isoleret fra biblioteket screening bør bevare samspillet med agn fusion protein (DB-X) til at fremkalde rapporten gener, og retransformation af byttedyr kloner og agn konstruere ind gær kan yderligere eliminere falske positiver og lette tilføjetab i et analyse.

1. Isoler plasmid DNA fra gærstammer potentielt indeholder interagerende proteiner.
2. Omdan DNA i E. coli DH5α celler, fabrikationsskilt transformationer på LB 100 mg / ml ampicillin plader til selektivt at isolere pPC86-cDNA bibliotek, og inkuberes natten over ved 37 ° C.
3. Saml flere kolonier fra pladen til at sætte ind i LB 100 mg / ml ampicillin bouillon.
4. Forbered miniprep DNA og undersøge ved at dobbeltklikke begrænsning analyse med Sal I og Not I.
5. Co-transformere bytte plasmid og agn plasmid ind MaV203, plade omdannelsen blandinger SC-Leu-Trp plader, og inkuber i 2-3 dage ved 30 ° C.
6. Pick tre forskellige kolonier fra SC-Leu-Trp plade, udføre X-gal Assay.

9. Sequencing og bioinformatik analyse

Sekvens af plasmid-DNA, der blev isoleret fra sandsynligvis sande positive kloner, sammenligne disse sekvenser til dem i GenBank ved hjælp af BLAST-programmet, og identificere de to-hybrid-kloner, der svarer til kendte gener. Sekventering data viste, at to af de 12 positive opnåede ovenfor celleoverflade TNFR2 (TNFRSF1B/CD120b; Tiltrædelse # NM_130426). Desuden blev samspillet mellem PGRN og TNFR kontrolleres ved hjælp af forskellige protein-protein interaktion assays, herunder in vitro fast-fase bindende assay, Co-immunoprecipitation, Surface plasmon resonans analyse, og Flowcytometri assay ^14.

10. Repræsentative resultater

Rutediagrammet af screeningen er skitseret i Fig. 3. Typisk 50-100 positive klon kandidater vil blive opnået på dette trin. Vi har i første omgang isoleret 54 positive klon kandidater blandt 2.500 tusind transformanter screenes med PGRN agn. Positive klon kandidater blev derefter verificeret ved at udføre X-gal analysen. Typisk er omkring 50% falsk positive kloner fjernet via X-gal analysen. Vi fik 23 positive klon oprigtig ates på dette trin for PGRN agn (Fig. 4). Retransformation af byttedyr kloner og agn konstruere ind gær yderligere eliminere falske positiver og kloner, der stadig aktivere reporter gener sandsynligvis repræsenterer den sande positiver. Typisk vil omkring 50% positive klon kandidaterne blive fjernet. Vi har endelig isoleret 12 positive kloner, der interagerer med PGRN i gær.

Figur 1. Princip af gær to-hybrid-system

Figur 2. Pipeline identificere proteinbinding partnere ved hjælp af gær to-hybrid-system

Figur 3. Rutediagram af screening gær to-hybride bibliotek.rge.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se fuld størrelse version af dette billede.

Figur 4. Beta-galactosidase analyse af positive klon kandidater. A Positive kloner stammer fra skærmen Bibliotek blev overført til YPD plade og inkuberes ved 30 ° C natten over, B, blev alle kolonier på YPD plade overført til nitrocellulose membraner og beta-galactosidase analysen udføres.

Gær to-hybrid screening har vist sig at være et effektivt redskab til at identificere protein interaktioner ^{16, 17.} Sammenlignet med andre metoder til at identificere proteinbindende partnere, såsom biokemiske co-rensning og protein chips, gær to-hybrid systemet er et følsomt genetisk tilgang, der kan bruges til screening meget stort antal kodningssekvenser i et relativt simpelt eksperiment, og i Desuden er det detekterer in vivo interaktion og behøver ikke kompliceret proteinoprensning. Selvfølgelig gær to-hybrid-system har sine begrænsninger, for eksempel, (ingen af ​​de nødvendige post-translationelle modifikationer, den utilstrækkelige folde og / eller stabilitet af en fusion protein, og den ændrede subcellulære placering proteiner er bragt til kernen, og dette kan ikke være den reelle fysiologiske tilstand). Desuden kan de proteiner, der udviser falske aktivering af reporter gener, f.eks self aktivatorer, ikke umiddelbart bruges som lokkemad til screening byttet cDNA biblioteker. For at overvinde denne ulempe, er de enkelte funktionelle domæner i stedet for intakte proteiner, der normalt bruges som lokkemad efterfulgt af valideringer af samspillet ved hjælp af forskellige tilgange med intakte proteiner. For eksempel har vi med succes isoleret ADAMTS-7 metalloproteinase og progranulin vækst faktor som den bindende partnere COMP bruge Globaliseringsfonden-lignende domæne af COMP som lokkemad ^{10, 13.}

Den konventionelle screening procedure er tidskrævende, da gæren transformanter er belagt på den første minus-tre plader (SD-Leu-Trp-Hans tre AT) for at vælge hans + kloner, som derefter overføres til den anden minus-tre plader (SD -Leu-Trp-Ura 3 AT) for Ura valg. Derudover er der behov for replikation af tusinder af positive kloner specialværktøj, og dette skærmbillede proces resulterer ofte i et stort antal falske positiver. Vi har direkte belagte gæren transformanter på minus-fire plader (SD-Leu-Trp-Hans-Ura 3 AT) i stedet for to Minus-tre plader, fordi sand interaktion kloner bør være i stand til samtidigt aktivere alle de reporter konstruerer (dvs. producerer histidin, og uracil) integreret i gær genomet og skal overleve på minus-fire plader (SD-Leu-Trp-Hans- Ura 3 AT). Denne ændring markant forkorter processen (f.eks konventionel screening-procedure tager normalt 10-20 dage, mens den modificerede skærmen procedure skal kun 5-10 dage), reducerer arbejdsbyrden, og vigtigst af alt, reducerer antallet af falske positiver. Hertil kommer, at denne tilgang reproducerbar og pålidelig, og vi har med succes anvendt dette ændret ordning med at isolere proteiner af forskellige lokkemad, herunder natrium-kanal ¹² og ekstracellulær matrix protein ^{10, 13.} For nylig har vi identificeret PGRN som en ny ligand af TNF-receptorer ved hjælp af denne metode ^{14, 15,} giver et solidt fundament for fremtidige opdagelser i forbindelse med denne vækstfaktor.