Modifierad jäst-Two-Hybrid System för att identifiera proteiner Interagera med Growth Factor Progranulin

1. Bakgrundsinformation

Jästen två-hybrid systemet är en kraftfull genetisk teknik som används för att upptäcka protein-protein interaktioner ^{16, 17.} Flera typer av 2-hybrid system, såsom lexa-baserade system, SOS-rekryteringssystem och bakterier eller däggdjursceller cellbaserade 2-hybrider, är kommersiellt tillgänglig, fokuserar denna uppsats specifikt om ändringar av de vanligaste GAL4 baserade jäst 2-hybridsystem. Korthet bygger metoden på egenskaperna hos jästen GAL4 protein som består av avskiljbara domäner ansvarig för DNA-bindande och transkriptionsaktiveringen. Betet proteinet uttrycks som en fusion till GAL4 DNA-bindande domän (DNA-BD), medan bytet proteiner uttrycks som fusioner till GAL4 aktivering domän (AD). Interaktion mellan bete och bytesdjur proteiner fusion leder till transkriptionell aktiveringar av GAL4-bindningsställen innehåller reporter gener som är integrerade i jäst genome. Principen om Y2H visas i fig. 1 och den experimentella proceduren sammanfattas i figur. 2.

2. Krävs material och lösningar

1. YPD Growth Medium (en blandning av pepton, jästextrakt och dextros i optimala proportioner ökar mest Saccharomyces cerevisiae stammarna).
2. Minimal SD-baser (Minimal syntetiska definierade (SD) baser innehåller en bas jäst kväve, ammonium sulfat och en kolkälla, dextros. Dropout (DO) tillskott kan läggas till Minimal SD Base för att göra en syntetisk, definierat medium som saknar den angivna näringsämnen).
3. Leu /-TRP Dropout (DO) tillägg (som innehåller alla essentiella aminosyror förutom leucin och tryptofan)
4. -His/-Leu/-Trp/-Ura Dropout (DO) Supplement (innehåller varje essentiell aminosyra förutom leucin, tryptofan, histidin, och uracil)
5. Luria buljong (LB) (Trypton 10 g / L, jästextrakt 5 g / L, NaCl 5 g / L)
6. X-Gal (5-bromo-4-klor-3-indolyl-β-D-galaktopyranosid) lösning: utarbetats som en 20 mg / ml stamlösning i N, N-Dimetylformamid
7. 10X TE (100 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM EDTA, autoklaveras)
8. Sonicated sill eller lax spermiens DNA, kokt (10 mg / ml)
9. 10X LiAc (1 M litium-acetat, autoklaveras)
10. 50% PEG-3350 lösning, filter-steriliserade
11. 3-Amino-1, 2, 4-Triazole (3AT)
12. Kanamycin
13. Ampicillin
14. ELECTROMAX DH5α celler
15. Z buffert: 16,1 g Na2HPO4 7H2O (eller 8,52 g vattenfritt), 5,5 g NaH2PO4 H2O (eller 4,8 ganhydrous), 0,75 g KCl, 0,246 g MgSO4 7H2O (eller 0,12 g vattenfritt), upplöst i 1 L autoklaveras, destillerat vatten och anpassas till pH 7,0.

3. Bete generationens (pDBLeu-PGRN)

En cDNA fragmentet kodning PGRN saknas signal peptid (aa21-588) var directionally klonade in i Sal I-Inte jag i nätverket pDBLeu vektor (de ProQuest två-hybrid systemet, Invitrogen),hålla samma översättning läsram som GAL4 DNA-bindande domän för att generera pDBLeu-PGRN.

1. Förstärka cDNA fragmentet av PGRN beskrivs ovan med PCR med oligonukleotiden primers avsedda att innehålla begränsningar webbplatser (Sal jag på 5'end och Inte jag i 3'end) så att i-frame fusion.
2. Gel rena PCR-produkten, endonukleaser smälta med begränsningar Sal I och inte I.
   Förbered BF vektor pDBLeu genom att dubbelklicka begränsning matsmältning med samma restriktionsendonukleaser.
3. Ligate fragmentet begränsningen PGRN i linjäriserade pDBLeu vektor och förvandlas till DH5α med urval för LB + kanamycin vid 25 mikrogram / ml.
4. Verifiera korrigering av konstruktionen genom DNA-sekvensering.

4. Småskalig omvandling av bete plasmid

1. Inokulera 5 ml av YPD med en koloni av Mav203 (Invitrogen), skaka över natten vid 30 ° C.
2. Späd natten kultur i 50 ml YPD. Odla ett tilläggitional 2-4 timmar.
3. Pellets cellerna vid 3000 rpm i 5 min vid RT. Suspendera pelleten i 40 ml autoklaveras, destillerat vatten.
4. Re-pellets cellerna. Resuspendera i 2 ml lösning som jag, inkubera vid RT 10 min.
   Lösning I: 0,5 ml 10xLiAc, 0,5 ml 10xTE, 4 ml H ₂ O
5. Fördela DNA till rören: 2-3 ìl av pDBLeu-PGRN (0.25μg/μl) och 10 l av denaturerad klippt, lax spermie-DNA (10μg/μl). Lägg 100μl jästceller, blanda väl.
6. Tillsätt 700μl lösning II, blanda väl. Inkubera vid 30 ° C i 30 min. Lösning II: 0,2 ml 10xLiAc, 0,2 ml 10xTE, 1,6 ml 50% PEG3350.
7. Heat shock vid 42 ° C i 15 min.
8. Pellets i 2 min. Kassera supernatanten. Ã…tersuspendera pelleten i 200 l autoklaveras, destillerat vatten.
9. Plate suspensionen på SD-Leu plattor med seriespädningar. Inkubera plattan vid 30 ° C i 2-3 dagar.

5. Bait validering

Innan du utför jast två-hybrid skärm, testa pDBLeu-PGRN för själv-aktivering och bestämma den basala uttryck nivåer HIS3 reporter genen. Det här testet avgör om beten aktivera transkription och om självaktivering kan neutraliseras av hämmare. 3-Amino-1, 2, 4-triazol (3-AT) är en kompetitiv hämmare av HIS3-genen produkt och kan användas för att titrera den lägsta HIS3 uttryck som behövs för tillväxt på histidin-brist media.

1. Omvandla den pDBLeu-PGRN i jäst Mav203 stam, plåt omvandlingen på SD-Leu plattor, och inkubera i 48-72 timmar vid 30 ° C.
2. Patch kolonier från varje omvandling använda autoklaveras tandpetare på SD-Leu-Hans plattor innehållande 3-AT i koncentrationer på 10 mm, 25 mm, 50 mm, 75 mm och 100 mm. 3-AT är en kompetitiv hämmare av HIS3 enzymet och bara beten som uppvisar självaktivering kommer att kunna växa i närvaro av 3-AT.
3. Bait stammar som växer på tallrikar containing 100 mM 3-AT är inte lämpliga för användning i två-hybrid skärmen. För beten som kan användas, använder den lägsta 3-AT koncentration som hämmar celltillväxt. I många fall är 25 mm 3-AT användas vid screening.

6. cDNA bibliotek screening

Den pDBLeu-PGRN plasmiden förs in MaV203 hjälp av en smÃ¥skalig omvandling enligt ovan. Att införa pPC86-biblioteket (Invitrogen) i MaV203 (pDBLeu-PGRN), beskrev proceduren nedan normalt ger ~ 4 x 10 ⁴ kolonier med 0,5 mikrogram av plasmid bibliotek DNA. Därför kommer 2,5 x 10 ⁶ jäst transformants kräver ~ 30,0 mikrogram pPC86-cDNA-bibliotek plasmid-DNA, 25 transformationer, och femtio 10-cm plattor (SD-Leu-TRP-Hans-Ura 3 AT).

1. Förbered lämpligt antal av 10-cm SD-Leu-TRP-Hans-Ura 3 AT plattor (50 för förfarandet nedan). Också förbereda minst fyra 10-cm SD-Leu-TRP plattor för att uppskatta antalet transformants.
2. Förvandla biblioteket tillden MaV203 innehåller pDBLeu-PGRN enligt det förfarande som beskrivs nedan.
   1. Häng flera isolerade kolonier av MaV203 (pDBLeu-PGRN) i ~ 100μl autoklaveras, destillerat vatten och spred dem på en 10-cm SD-Leu plåt. Upprepa proceduren för en andra SD-Leu plåt. Inkubera båda plattorna i 18-24 timmar vid 30 ° C.
   2. Skrapa och helt avbryta cellerna i 10 ml autoklaveras, destillerat vatten. Lägg till en tillräcklig mängd cellsuspension till 500 ml vätska YPD medium i en kolv för att ge en OD ₆₀₀ pÃ¥ ~ 0,1.
   3. Kontrollera att OD är ~ 0,1 efter inokulation.
   4. Skaka vid 30 ° C tills OD ₆₀₀ nÃ¥r ~ 0,4.
   5. Bered en färsk:
      1. 110 ml 1X TE / LiAc genom att kombinera 11 ml 10X TE, 11 ml 10X LiAc, och 88 ml autoklaveras vatten.
      2. 16 ml PEG / LiAc genom att kombinera 1,6 ml 10X TE, 1,6 ml 10X LiAc och 12,8 ml 50% PEG-3350.
   6. Pellets cellerna vid 3000g i 5 min i rumstemperatur.
   7. Släng tHan supernatanterna och försiktigt suspendera pelleten genom att pipettera upp och ned i 100 ml autoklaveras, destillerat vatten vid rumstemperatur.
   8. Centrifugera vid 3000 gi 5 minuter i rumstemperatur.
   9. Kasta bort vätskefasen av centrifugerade cellerna och resuspendera cellpelleten i 50 ml 1X TE / LiAc lösning.
   10. Centrifugera vid 3000 gi 5 minuter i rumstemperatur.
   11. Ta bort supernatanterna och återsuspendera pelleten i en slutlig volym på 2,5 ml 1X TE / LiAc lösning.
   12. Utför 25 transformationer. Kombinera 2,5 ml celler, 125 l (10μg/μl) denaturerade, klippt lax spermier DNA, och 30 mikrogram cDNA bibliotek. Blanda försiktigt genom att pipettera upp och ned. Tillsätt 15 ml PEG / LiAc lösning och blanda försiktigt. Fördela i 25 autoklaveras 1,5 ml mikrocentrifugrör på 700 l vardera.
   13. Inkubera i 30 min i en 30 ° C vattenbad.
   14. Värme chock för 15 min i en 42 ° C vattenbad.
   15. Centrifugera vid 6000 gi 1 minut vid rumstemperatur. Ta försiktigt bort supernatant. Försiktigt återsuspendera varje pellet i 400 l autoklaveras, destillerat vatten genom att pipettera upp och ned.
3. Tavla på 200 l omvandlingen blandning från varje omvandling till enstaka 10-cm SD-Leu-TRP-Hans-Ura 3 AT (3AT koncentration: 25 mm) plattor med en spridning bar, så 25 autoklaveras 1,5 ml mikrocentrifugrör kan göra 50 tallrikar (SD-Leu-TRP-Hans-Ura 3 AT).
4. Inkubera plattorna i 5-10 dagar vid 30 ° C.
5. För att uppskatta omvandlingseffektiviteten av reaktionen spädningar av en reaktion (1:40, 1:400 och 1:4000) är pläterade på SD-Leu-TRP plåt. Efter inkubation under 3 dagar vid 30 ° C, antalet kolonier räknas och det totala antalet beräknade transformants.

7. X-gal-analysen

1. Överföring kolonier till YPD plattan, inkubera vid 30 ° C över natten.
2. Placera rundade Nitrocellulosa membran på YPD plattan, se till att det inte finns några bubblor mellan membranet och YPD plattan. Efter 1-2 min, MAke att alla kolonier överförs till membran (nitrocellulosa papper).
3. Lägg sidan membranet kolonin i båten gjorde med aluminiumfolie papper.
4. Placera membranet i flytande kväve, vänta tjugo sekunder, och dränka in i flytande kväve i ett par minuter.
5. Ta ut membranet att tina.
6. Under tiden blanda följande reagens:
   1,5 ml Z-buffert
   20μl X-gal (20 mg / ml)
7. Drop Z buffert / X-gal i en petriskål, placera Whatman papper ovanpå det.
8. Placera försiktigt nitrocellulosa papper ovanpå Whatman papper.
9. Inkubera vid 37 ° tills blå kolonier visas.

8. Retransformation analys

Prey fusionsproteiner (AD-Y) isolerade från biblioteket screening bör behålla samspelet med bete fusionsprotein (DB-X) för att förmå rapporten gener, och retransformation av bytesdjur kloner och bete bygga in i jäst kan ytterligare eliminera falska positiva och underlätta läggaitional analys.

1. Isolera plasmid DNA från jäststammar potentiellt innehåller interagerande proteiner.
2. Förvandla DNA i E. coli DH5α celler, platta de förändringar på LB 100 mikrogram / ml ampicillin plattor att selektivt isolera pPC86-cDNA bibliotek, och inkubera över natten vid 37 ° C.
3. Välj flera kolonier från plattan att sätta i LB 100 mikrogram / ml ampicillin buljong.
4. Förbered miniprep DNA och undersöka genom att dubbelklicka begränsning analys med Sal I och inte I.
5. Co-omvandla bytet plasmiden och agn plasmid in MaV203, plåt omvandlingen blandningar på SC-Leu-TRP plattor och inkubera under 2-3 dagar vid 30 ° C.
6. Välj tre olika kolonier från SC-Leu-TRP plåt, utför X-gal-analys.

9. Sekvensering och bioinformatik analys

Sekvens plasmid DNA som isolerades från troligen sant positiva kloner, jämföra dessa sekvenser dem i GenBank med BLAST-program, och identifiera de två-hybrid kloner som motsvarar kända gener. Sekvensering data visade att två av de 12 positiva erhållits ovan var cellytan TNFR2 (TNFRSF1B/CD120b; anslutning # NM_130426). Dessutom var samspelet mellan PGRN och TNFR verifieras med hjälp av olika protein-protein växelverkan analyser, såsom in vitro i fast fas bindande analys, Co-immunoprecipitation, ytplasmonresonans analys och flödescytometri analys ^14.

10. Representativa resultat

Flödesschemat av granskningen beskrivs i figur. 3. Normalt 50-100 positiva klon sökande kommer att erhållas i detta steg. Vi isolerade initialt 54 positivt klon kandidater bland 2500 tusen transformants skärmad med PGRN bete. Positiva klon kandidater verifieras sedan genom att utföra X-gal-analysen. Normalt är cirka 50% falskt positiva kloner bort via X-gal-analysen. Vi fick 23 positiva klon uppriktig Ates i detta steg för PGRN betet (bild 4). Retransformation av bytet kloner och bete bygga in jäst eliminera ytterligare falska positiva och kloner som fortfarande aktivera reportern gener sannolikt representerar sant positiva. Vanligtvis kommer ca 50% positiva klon kandidater tas bort. Vi isolerade slutligen 12 positiva kloner som interagerar med PGRN i jäst.

Figur 1. Princip för jäst två-hybrid-system

Figur 2. Pipeline att identifiera proteinbindning partner med hjälp av jäst två-hybrid-system

Figur 3. Flödesschema av screening jäst två-hybrid bibliotek.rge.jpg "target =" _blank "> Klicka här för en fullstor version av denna bild.

Figur 4. Beta-galaktosidas analys av positiva klon kandidater. A Positiva kloner från skärmen Bibliotek överfördes till YPD plattan och inkuberas vid 30 ° C över natten, B, var alla kolonier på YPD plattan överförs till nitrocellulosa membran och beta-galaktosidas-analysen utförs.

Jäst två-hybrid screening har visat sig vara ett effektivt verktyg för att identifiera proteininteraktioner ^{16, 17.} Jämfört med andra metoder för att identifiera protein-bindande partners, såsom biokemiska co-rening och proteinchip, jäst två-hybrid systemet är en känslig genetisk metod som kan användas för screening mycket stort antal av kodande sekvenser på ett relativt enkelt experiment, i Dessutom registrerar den att det in vivo interaktioner och behöver inte komplicerat protein rening. Naturligtvis jäst två-hybrid systemet har begränsningar, till exempel (avsaknad av nödvändiga post-translationella modifieringar, den otillräckliga vikning och / eller stabiliteten hos ett fusionsprotein, och den förändrade subcellulära platsen proteiner förs till kärnan och detta kan inte den verkliga fysiologiska tillstånd). Dessutom kan de proteiner som uppvisar falska aktivering av reporter gener, t ex själv aktivatorer, inte direkt användas som lockbete för screening bytet cDNA bibliotek. För att övervinna denna nackdel, är de enskilda funktionella domäner istället för intakta proteiner, som vanligtvis används som lockbete följt av validering av samspelet med hjälp av olika metoder med intakta proteiner. Till exempel har vi isolerat framgångsrikt ADAMTS-7 metalloproteinas och progranulin tillväxtfaktor som bindande partner COMP hjälp av EGF-liknande domän COMP som ett lockbete ^{10, 13.}

Den konventionella säkerhetskontrollen är tidskrävande, eftersom jästen transformants är pläterade pÃ¥ första minus-tre plattor (SD-Leu-TRP-Hans tre AT) för att välja Hans + kloner, som sedan överförs till den andra minus-tre plattor (SD -Leu-TRP-Ura 3 AT) för Ura val. Dessutom mÃ¥ste replikering av tusentals positiva kloner specialverktyg, och den här skärmen process resulterar ofta i ett stort antal falskt positiva. Vi plated direkt jästen transformants pÃ¥ minus fyra plattor (SD-Leu-TRP-Hans-Ura 3 AT) i stället för tvÃ¥ MinuS-tre plattor, eftersom sann interaktion kloner ska kunna samtidigt aktivera alla reportern konstruktioner (dvs producera histidin, och uracil) integreras i jästgenomet och ska överleva pÃ¥ minus fyra plattor (SD-Leu-TRP-Hans- URA 3 AT). Denna ändring förkortar markant processen (t.ex. konventionella undersökningen är vanligtvis tar 10-20 dagar, medan den modifierade skärmen förfarande behöver bara 5-10 dagar), minskar arbetsbördan, och, viktigast, minskar antalet falska positiva. Dessutom är denna metod reproducerbara och tillförlitliga, och vi har även anställt denna modifierade system isolera proteiner av olika beten, bland annat natrium kanal ¹² och extracellulära matrix protein ^{10, 13.} Nyligen identifierade vi PGRN som en ny ligand av TNF receptorer som använder denna metod ^{14, 15,} ger en stabil grund för framtida upptäckter som rör denna tillväxtfaktor.