Grootschalige Opname van Neuronen door Movable Silicon Probes in Behaving Knaagdieren

1. De bouw van de microdrive

Alle stations zijn van dezelfde basis-elementen: een bewegend deel, waarbij de elektrode en een vast deel, dat is verankerd aan de schedel draagt. Een ideale microdrive maakt glad, maar lang genoeg reizen van de elektrode in meerdere kleine stappen, is stevig genoeg om onbedoelde bewegingen van de elektrode, gemakkelijk te manipuleren door de experimentator zonder zich te bemoeien met het gedrag van het dier, klein van formaat en licht in gewicht te voorkomen. Als gevolg van deze tegenstrijdige eisen verschillende stations suite verschillende toepassingen.

Slechts 4 onderdelen zijn nodig om onze basis-station te bouwen: een koperen platte kop schroef, een bijpassende moer, een kunststof brug bereid uit een enkele rij pin header en twee op maat gesneden koperen platen.

1. Break een 3-pins stuk uit de kop
2. Trek de middelste pin.
3. Vergroot het gat door het boren van door met een boor grootte # 55.
4. Snijd een egelezen met de 00-90 kraan.
5. Knip twee stukken uit de koperen plaat.
6. Vijl de randen van de platen met een Dremmel.
7. Boor een gat in het midden van de beide stukken met behulp van een boor grootte # 65.
8. Monteer de aandrijving stukken, zodat de koperen platen zijn het aanraken van de pinnen. Om dit te bereiken, plaatst de koperen schroef door, achtereenvolgens, de koperen plaat, de schroefdraad pin header gat, de tweede koperen plaat, en de moer. Draai de schroef voorzichtig, zodat het geheel stabiel is.
9. Soldeer de pin eindigt op de koperen platen.
10. Vijl het uitstekende einde van de schroef.
11. Soldeer de moer op de schroef. Zorg ervoor dat te solderen de moer op de koperen plaat.
12. Test de beweging van de aandrijving: draai de schroef met de klok mee aan de kunststof brug te verheffen.

2. Voorbereiden van de silicium-sonde

Alvorens de sonde naar het station, om extra isolatie aan de hechting gebied van de sonde naar cerebr te voorkomenospinal vloeistof (CSF) of vochtigheid van de productie van kortsluiting:

1. Weeg en meng de Sylgard elastomeer componenten in een 10:1 verhouding.
2. Met behulp van een geslepen katoen applicator, passen de Sylgard naar de bovenkant van de sonde.
3. Laten drogen in een voorverwarmde oven bij 60 ° C gedurende 2 uur.

Om ervoor te zorgen dat de opname sites zijn zonder enige puin, de sonde tips moeten worden gereinigd:

4. Bereid een 4% verdunning van Contrad reinigingsmiddel.
5. Laat de sonde in de wasmiddel weken bij 63 ° C gedurende ten minste 2 uren.
6. Spoel het reinigingsmiddel weg door dompelen de sonde herhaaldelijk in gedestilleerd water.

Alvorens de sonde naar het station, moet de impedantie van iedere locatie worden gecontroleerd:

7. Dompel de sonde in 0,9% zoutoplossing, en sluit deze aan een impedantie-meter. Als er te veel opname sites hebben verkeerde impedantie, herhaalt u de stappen 2.4-2.6 of overwegen om een ​​andere sonde.Hier gebruiken we een impedantie Conditioning Module van Frederick Haer, Co (FHC), gecombineerd met een zelfgemaakte kanaalkiezer. Als alternatief kan een niPOD door NeuroNexus, Inc of NanoZ door Neuralynx, Inc maakt het monitoren van de impedantie van de probe kanalen tegelijk.

3. Het aanbrengen van de sonde naar de Microdrive

1. Met behulp van een scheermesje, snij meerdere groeven in de brug naar een robuust oppervlak te creëren.
2. Appose de sonde naar de brug van het station. Deze procedure gaat het beste onder een operatiemicroscoop, door te oordelen de aandrijving met een klem en het aanpassen van de sonde door een micromanipulator, zodat de schachten perfect parallel met de drive schroef. Dit zorgt ervoor dat tijdens de promotie, de sonde Shanks beweging in het hersenweefsel, zonder 'knippen' doorheen. De exacte diepte van de meetpennen opzichte van de basis van de aandrijving worden bepaald in dit stadium, rekening houdend met de diepte van de beoogde structuur van het oppervlak van deschedel.
3. De sonde wordt vervolgens op de brug met grip cement.
4. Optioneel: voor de visualisatie van de probe baan in de hersenen Dii oplossing (1-2% verdund in ethanol) kan worden aangebracht op de achterkant van de sonde in dit stadium.

4. Voorbereiden van de schedel

Voorafgaand aan chirurgie, wordt de referentie en massa-elektroden en de delen van de on-kop Faraday kooi bereid:

1. Snij twee 2 "lange stukken koperdraad en soldeer een uiteinde van elke geïsoleerde koperdraad ongeveer 1 mm.
2. Met behulp van een naald, schraap het hoofd van een 00 tot 90, 1/8 "roestvrij stalen schroeven en soldeer een stuk koperdraad aan. Solderen zoals roestvrij staal aardschroef-elektroden, moet een passend flux (bijv. N-3 Alle doel flux van La-Co) en hoge soldeerstift temperaturen. voorzichtig voorkomen dat soldeer stromen in de groef van de schroef. Dit zal gebruikt worden als de massa-elektrode. Herhaal dit met een andere schroef en koperdraad voor te bereidende referentie electrode.
3. Knip Trapezium stukken uit kopergaas. Deze stukken worden samengevoegd tot het headstage beschermen.

Chirurgische instrumenten en voorbereiding zijn dezelfde als gebruikt in tal van kleine dieren operaties. De hele operatie wordt gedaan onder diepe isofluraananesthesie, met behulp van aseptische omstandigheden, volgens de NIH goedgekeurde richtlijnen. Let op dat de (pseudo) chirurgie in deze video is alleen bedoeld ter illustratie. Voor de juiste zichtbaarheid en filmen doeleinden, een aantal voorbereidende stappen, chirurgische voorzorgsmaatregelen en postoperatieve procedures worden niet getoond / zichtbaar of besproken.

Voor de ingreep, moeten alle onderdelen en benodigdheden worden gesteriliseerd, nadat zij de juiste procedures (zie Richtlijnen voor het Survival Rodent Chirurgie; http://oacu.od.nih.gov/ARAC/surguide.pdf). Tijdens de operatie wordt een steriel veld op de schedel voorbereid en geïsoleerd door steriele doeken. Aan het einde van de chirurgie een breed spectrum antibiotica islokaal pplied en een langwerkende pijnstiller wordt intramusculair gegeven (bijv. buprenorfine, [Buprenex] 0,05 mg / kg). Daarnaast pijnstiller (bijvoorbeeld Ibuprofen) is voorzien in het drinkwater op ongeveer 60 mg/kg/24 uur gedurende 5 dagen. Voor een goede chirurgische en anesthesie procedures, raadpleeg dan geschikte bronnen ^12.

4. Plaats het dier in de stereotaxische apparaat, scheren en reinigen de hoofdhuid ^13.
5. Snijd de huid langs de middellijn en duw opzij de hoofdhuid. Verwijder het periost, reinig en droog de schedel.
6. Meet de locatie en de afstand tussen bregma en lambda, en bepaalt de x-en y-coördinaten van de sonde implantatie daarvan met behulp van een atlas stereotaxische ^14. Markeer de site door schrapen een kruis op de schedel met een scalpel.
7. Boor de schedel met een ronde kop boor (grootte ¼) en de drive ondersteuning schroeven (roestvrij staal, 000-120, 1/16 "), halverwege in het bot, op verschillende bot-platen op de top eennd aan de zijde van de schedel. De schroeven zal ankers om veilig band het hoofddeksel aan de schedel.
8. Boor gaten boven het cerebellum en steek de grond en referentie-elektroden bereid in stap 4.2. Voor het opnemen locale veldpotentialen (LFP), de keuze van de referentie locatie cruciaal. Deze site is gekozen omdat de kleine hersenen LFP is de kleinste van alle corticale gebieden en spieren artefacten zijn minimaal op deze middellijn locatie.
9. Breng dentine activator (Metabond kit) met een kleine borstel over het gehele oppervlak van de schedel. Spoel het met 0,9% zoutoplossing.
10. Breng tandheelkundige cement (Metabond kit, volg instructies van de fabrikant voor het mengen van) op de schedel, met zorg voor anker schroeven en grond-en referentie-elektroden, maar het verlaten van de sonde implantatieplaats duidelijk.
11. Zet de vier kopergaas kleppen (opgesteld in stap 4.3) aan de schedel. Voor deze, verstevigen de smalle basis van elk van hen tot de voorste, links, rechts, en de achterste zijkanten van de schedel. The koper nooit in direct contact met het bot, maar altijd gescheiden door een laag van cement.

5. Voorbereiding van de hersenen oppervlak

1. Met behulp van een ronde kop boor, boor rond de implantatie site in meerdere fasen, terwijl vaak irrigatie het bot met een zoutoplossing.
2. Verwijder voorzichtig het bot klep en irrigatie van de hersenen oppervlak.
3. Voor het inbrengen van een meerdere schacht probe, is een brede strook van dura verwijderd. Twee instrumenten nodig zijn om de dura te verwijderen: een scalpel en een haak bereid uit een insect naald (als alternatief, een standaard wolfraam micro-elektrode). Buig de punt van de naald door te drukken tegen een hard oppervlak (bijv. glas microscoop dia), en bevestig deze aan een handvat (hier, een stuk van houten Q-tip, als alternatief een microdissecting naaldhouder).
4. Til de dura met de haak, en snijd hem met een scalpel. Extra zorg wordt besteed om te voorkomen dat schade aan de pia, schepen en het oppervlak van de neocortex. Kleine bloedingen kunnen worden opgelostdoor zoutoplossing irrigatie. Als ernstige bloeding optreedt of de neocortex in gevaar wordt gebracht op welke wijze dan moet men overwegen beëindiging van de operatie en het voorbereiden van een ander dier.

6. Implantatie van de sonde

In dit stadium worden de dichtheid en de oriëntatie van corticale oppervlakteschepen zorgvuldig geëvalueerd. Stereotaxisch coördinaten worden aangepast omdat de sonde naar de hersenen binnendringen in een omgeving van grotere schepen.

Voor de implantatie, kan het aandrijfaggregaat worden gehouden met een alligator clip bevestigd aan de stereotaxische houder. Blijvend vrij zicht van de hersenen oppervlak en de tips van de sonde zijn van cruciaal belang voor een succesvolle penetratie.

1. Langzaam lager de sonde tot ongeveer 1 mm boven het beoogde doel, waarbij steeds bevloeien craniotomie met zoutoplossing. Voor neocorticale opname worden de meetpennen neergelaten in de cortex ongeveer 0,5 mm en weer opgeheven nabij het oppervlak. Sluit de craniotomie door een warme gesmolten mengsel van was en paraffineolie via een naald (10 20 g was in 10 ml paraffineolie, verwarmd op 65 ° C). Voor toepassing, koelen mengsel tot 30 ° C en testen dichtheid. Het moet zacht genoeg om gemakkelijk sonde beweging mogelijk te maken). Om een ​​volledige dekking te vergemakkelijken, kan het mengsel worden gesmolten ter plaatse door het benaderen van de geharde was met de punt van een micro-cauterizer.
2. Bevestig de onderkant van de aandrijving van de schedel met grip cement, let daarbij goed op weg de moer vrij om te draaien. Het is van groot belang om ongewenste "bump" van de aandrijving vermijden dit stadium anders probe beschadigen cortex. Nadat het station is bevestigd aan de schedel, moet soepele beweging van de sonde worden gecontroleerd.
3. Cement het connectordeel van de sonde op de schedel.

7. Het bouwen van de op-kop kooi van Faraday

1. Trek en de kopergaas kleppen monteren in een beschermende cilinder rond de sonde en drive. De cilinder dient ook als een elektrische schild tegen omgevingslawaai en de trage golven artefacten die door de in rekening gebrachte snorharen in het gedrag van dieren.
2. Stel de cilinder hoogte door het wegsnijden van overtollig materiaal, zodat de koper gaas is gelijk met de bovenkant van de sonde connector.
3. Soldeer de draden van de referentie-en grond schroeven om de betreffende pinnen van de connector. Ook solderen aangrenzende kopergaas flappen samen om hun elektrische continuïteit te waarborgen, en soldeer de aardedraad aan op de koperen mesh.
4. Een laag van greep op de kopergaas te versterken en om direct contact tussen het metaal en het dier huid te voorkomen. Optioneel, breng een laag van epoxyhars verder te versterken de hoofdband.
5. Test de beweging van de aandrijving schroef.
6. Bedek de bovenkant van de hoofdband met een stuk gesneden uit een rubberen handschoen.

8. Opnemen in de vrij bewegende dieren

1. Na appropriaten post-operatieve zorg, sluit het dier om de opname met behulp van een hoge impedantie headstage en een lichtgewicht, Ultraflexibele meeraderige kabel. Tegenwicht van het gewicht van de hoofdband.
2. Test de kwaliteit van het opnemen van elke dag in de homecage. De ligging van het registratiespoor gebieden wordt beoordeeld door twee bakken eenheid patronen en de vorm van de lokale veldpotentialen. Geleidelijk te verlagen de sonde door de schroef door kleine stappen (typisch 1/8 tot 1/4 draai per dag, dat wil zeggen 35-70 micrometer) tot de beoogde structuur is bereikt.

9. Representatieve resultaten

Elektrofysiologische signalen (lokale veld potentieel en eenheid activiteit) zijn afhankelijk van de opgenomen structuur en het huidige gedrag van het dier. Figuur 1 laat voorbeelden zien van 32-kanaals CA1 hippocampus-opnamen, terwijl de rat is het verkennen van een open veld. Let op de prominente 8 Hz (theta band) oscillatie van het lokale veld potentieel tijdens de verkenning met superimposed spiking op meerdere schachten en sites (voorbeelden van spikes aangegeven met pijlpunten). Om neuronale eenheid activiteit te analyseren, zijn spikes gedetecteerd en gesorteerd in afzonderlijke eenheden met behulp van cluster analyse van hun golfvormen ^15-16.

Figuur 1. CA1 hippocampus opnames in het gedrag rat met een 4 x 8 schachten plaatsen silicium sonde. Opnamen zijn breedband en bemonsterd op 20 000 Hz, die het mogelijk maakt om te studeren zowel lokale veld mogelijke trillingen (bijv. "theta" band 8 Hz ritme) en neuronale spiking activiteit.

Tabel 1. Alternatieven voor reagentia en apparatuur.

Deze film illustreert de implantatie procedure van silicium probes voor chronische grootschalige opnamen in de gedragen rat. Kritische stappen om de kwaliteit opnames van neuronale activiteit zorgen voor het gevolg zijn van de kwetsbaarheid van zowel biologische (hersenweefsel) en technische (silicium sonde) materialen. Speciale zorg dient te worden gehouden tijdens het hanteren van de sonde contact van schachten met afstand "hard" oppervlak (bijvoorbeeld de schachten zou breken wanneer men getracht te implanteren in de hersenen zonder de dura) voorkomen. Ook zou een schade aan het hersenweefsel (tijdens de voorbereiding van de hersenen vlak voor implantatie, of van stoten in de cel of het station als het eenmaal is ingeplant) leiden tot een beschadiging van de cellen en in gevaar te brengen de opname van eenheid activiteit. Bovendien dient de elektrische weg van de aarding worden gecontroleerd, als een circuit onderbreking tussen de cerebrospinale vloeistof, de grond schroeven, de koperdraad de kopergaas flappen en de aardpen de Connector, zou resulteren in een grote beweging artefacten en / of ruis op de telefoonlijn (50 Hz of 60 Hz). Als de Faraday kooi niet hoog genoeg kan de uitstekende micro-aandrijving als antenne. De antenne effect kan worden voorkomen door aarding van de drive als goed (soldeer een andere koperdraad tussen het station en de koper-mesh). De referentie-signaal moet op dezelfde manier worden gecontroleerd.

We illustreerde de implantatie van een enkele silicium sonde, maar meerdere locaties opnames met behulp van meerdere sensoren en aandrijvingen kunnen gemakkelijk worden bereikt na enige oefening. Daarnaast zijn we met vergelijkbare, maar kleinere schijven voor het implanteren van siliconen sondes in de hersenen van muizen. De in de handel verkrijgbare siliconen sondes en probe-flex kabel-connector componenten, samen met de geringe omvang van meerkanaals voorversterker zijn drastisch vereenvoudigd het bereidingsproces ten opzichte van voorgaande technieken. Vandaag is het zo gemakkelijk om tegelijkertijd op te nemen 64 tot 128 sites in een gedragen knaagdier vanaf 2 sites metdraadelektroden slechts een decennium geleden.

Silicon probe technologie is volop in ontwikkeling en het wijdverbreide gebruik ^17. Voorversterkers kan worden geïntegreerd met sondes ^18, en kleinere headstages, multiplexers of telemetrische systemen worden commercieel geproduceerd, verlegging van de grenzen van fysiologische opnames verder te grenzen.

Recente theoretische en experimentele studies met siliconen sondes ^17,19 aan te geven dat met de juiste verfijnde grootschalige opname mogelijkheden, in combinatie met nieuwe wiskundige inzichten en modelstudies, een staat zal zijn om van een representatief groot deel of misschien wel elk neuron op te nemen van het hersenvolume wordt uitgeoefend door een meervoudige schacht silicium sonde (duizenden cellen in ~ 1 micrometer ^{3; 5-17).} Echter, gezien de correlationele aard van deze metingen, de oorzaak-gevolg relatie tussen neuronale activiteit patronen blijft onvermijdelijk dubbelzinnig. Een goed begrip vanhoe gecoördineerde ensemble activiteit blijkt uit de neuronale elementen zijn minstens twee extra stappen. De eerste is de identificatie van de verschillende neuronale celtypen, die elk unieke draagt ​​bij aan de montage gedrag - letterlijk zoals leden van een orkest. De tweede en aanvullende stap is een principiële manipulatie van de spiking activiteit van cellen of geïdentificeerde groepen zodanig ingenieurs ondervragen elektronische circuits ^20. De recent ontwikkelde moleculaire optogenetic tools kunnen worden gebruikt om specifieke celpopulaties te manipuleren door de lokale lichte stimulatie ^20-22. De efficiënte combinatie grootschalige opnamen en optische methoden met siliconen sondes ²³ voorziet in de middelen voor zowel het identificeren en selectief rijden specifieke celpopulaties, waardoor deze naar de causale verbanden in de hersenen netwerken aan te pakken.