Storskalig inspelning av nervceller av lös Silicon sönder i Agera Gnagare

1. Byggandet av Microdrive

Alla enheter är gjorda av samma grundläggande element: en rörlig del, som uppbär elektroden och en fast del, som är förankrad vid skallen. En idealisk Microdrive möjliggör mjuk men tillräckligt länge förflyttning av elektroden i flera små steg, är robust nog för att förhindra oavsiktlig förflyttning av elektroden, lätt att manipulera av försöksledaren och utan att störa djurets beteende, liten storlek och låg vikt. Som ett resultat av dessa konkurrerande krav, olika enheter passar olika tillämpningar.

Endast 4 delar behövs för att bygga vår grundläggande enhet: en mässing platt huvud skruv, en matchande mutter, en plast bro framställd av en enda rad stift och två anpassade skurna plattor mässing.

1. Bryt en 3-stifts bit från huvudet
2. Dra försiktigt ut i mitten stiftet.
3. Förstora hålet som borras genom den med en borrkrona storlek # 55.
4. Skär en eLäs med 00-90 kranen.
5. Klipp två bitar ur mässingsplåt.
6. Fil kanter av plattorna med en Dremmel.
7. Borra ett hål i mitten av båda delarna med hjälp av en borr storlek # 65.
8. Montera driv bitar så att mässingsplåtarna vidrör stiften. För att åstadkomma detta sätt i mässing skruven genom, efter varandra, den mässingsplatta, det gängade stift hål, det andra mässingsplatta, och muttern. Dra åt skruven försiktigt så att enheten blir stabil.
9. Löd stiftet slutar till mässingsplåtarna.
10. Fil den utskjutande änden av skruven.
11. Lod muttern till skruven. Var noga med att inte löda muttern till mässing plattan.
12. Testa rörelse enheten: Vrid skruven medurs för att höja plasten bron.

2. Förbereda kisel proben

Innan du fäster sonden till enheten, lägga till extra isolering för att bindningen område sonden för att förhindra Cerebrospinal vätska (CSF) eller fukt från att producera kortslutning:

1. Väga och blanda Sylgard Elastomer komponenterna i ett förhållande 10:1.
2. Med hjälp av en vässad bomull applikator, tillämpa Sylgard i den övre änden av sonden.
3. Låta det torka i en ugn som förvärmts vid 60 ° C under 2 timmar.

För att säkerställa att inspelningen platserna saknar eventuellt skräp, de sondspetsama behöver rengöras:

4. Förbered en 4% utspädning av Contrad tvättmedel.
5. Låta sonden ligga i blöt i detergent vid 63 ° C under minst 2 timmar.
6. Skölj detergenten bort genom doppning av sonden upprepade gånger i destillerat vatten.

Innan du fäster sonden till enheten bör impedansen hos varje inspelning plats kontrolleras:

7. Doppa sonden i 0,9% koksaltlösning, och anslut den till en impedans-mätare. Om alltför många inspelningar webbplatser har fel impedans, upprepar du steg 2,4-2,6 eller överväga att använda en annan sond.Här använder vi en impedans Conditioning Module från Frederick Haer, Co (FHC), kombinerat med en hemmagjord kanalväljare. Alternativt kan en niPOD genom NeuroNexus, Inc. eller NanoZ genom Neuralynx, Inc. övervakning av impedansen hos alla sond kanaler samtidigt.

3. Fästa sonden till Microdrive

1. Användning av ett rakblad, skära flera spår i bryggan för att skapa en robust yta.
2. Appose sonden till bron av enheten. Detta förfarande görs bäst under ett operationsmikroskop, genom att hålla enheten med en klämma och justering sonden med en mikromanipulator så att skaften är helt parallellt med drivskruven. Detta säkerställer att under utveckling, sonden skaften flytta in hjärnvävnaden utan "skära" genom den. Det exakta djupet av sondspetsarna relativt basen av enheten bör bestämmas i detta skede, med hänsyn till djupet av målstrukturen från ytan av denskalle.
3. Sonden fixeras sedan till bryggan med grip cement.
4. Valfritt: för visualisering sonden spår i hjärnan, kan Dil lösning (1-2% utspädd i etanol) appliceras till baksidan av sonden i detta skede.

4. Förbereda skallen

Före kirurgi, är referenskammarinsatsema och jordelektroderna och de delar av den på-huvudet Faradays bur framställdes:

1. Skär två 2 "-långa bitar av koppartråd och lodet en ände av varje isolerad koppartråd i ca 1 mm.
2. Med hjälp av en nål, skrapa huvudet av en 00-90, 1/8 "skruv av rostfritt stål och löd en bit koppartråd till det. Lödning sådana rostfria jordskruv-elektroder kräver en lämplig flöde (t.ex. N-3 alla ändamål Flödet från La-Co) och höga lödningstemperaturen spets. undvika noga alla lod från att strömma in i spåret på skruven. Detta kommer att användas som jordelektroden. Upprepa med en annan skruv och koppartråd för att förberedareferenselektroden.
3. Klipp trapeziodal bitar från koppar mesh. Dessa bitar kommer att monteras för att skydda huvudsteg.

Kirurgiska instrument och beredning är samma som användes i många små djur operationer. Hela operationen görs under djupt isoflurananestesi, med hjälp av aseptiska förhållanden, enligt NIH godkända riktlinjer. Observera att (mock) operation visas i den här videon är för demonstration syfte. För lämpliga synlighet och filmning ändamål, flera förberedande steg, kirurgiska försiktighetsåtgärder och postoperativa rutiner visas inte / synliga eller diskuteras.

Före operation bör alla komponenter och leveranser steriliseras, efter lämpliga förfaranden (se Riktlinjer för överlevnad Rodent kirurgi, http://oacu.od.nih.gov/ARAC/surguide.pdf~~HEAD=NNS). Under operation, är ett sterilt område på skallen framställdes och isolerades genom sterila dukar. Vid slutet operationen, är ett bredspektrumantibiotika enpplied lokalt och en långverkande smärtstillande ges intramuskulärt (t.ex. buprenorfin, [Buprenex] 0,05 mg / kg). Dessutom, (t.ex. ibuprofen) smärtstillande medel ges i dricksvattnet vid ca 60 mg/kg/24 timmar för 5 dagar. För att få rätt kirurgiska och anestesi förfaranden, kontakta lämpliga källor ^12.

4. Installera djuret i stereotaxisk apparat, raka och rengör hårbotten ^13.
5. Skära in i huden längs mittlinjen och tryck undan hårbotten. Ta bort periostet, rengör och torka skallen.
6. Mät plats och avståndet mellan bregma och lambda, och bestämma x-och y-koordinater av sonden implantationsstället därför med hjälp av en stereotaktisk atlas ^14. Markera platsen genom att skrapa ett kors på skallen med en skalpell.
7. Borra skallen med ett runt lite huvud borr (storlek ¼) och kör skruvar stöd (rostfritt stål, 000-120, 1/16 ") halvvägs in i benet, på olika benplattor på toppen ennd på sidan av skallen. Skruvarna kommer att ge ankare för att säkert binda huvudbonaden till skallen.
8. Borra hål ovanför lillhjärnan och sätt i marken och referenselektroder beredda i steg 4,2. För inspelning lokala fältpotentialer (LFP), är valet av referens platsen kritisk. Denna sida har valts eftersom cerebellär LFP är den minsta av alla kortikala regioner och artefakter muskel är minimal på denna mittlinjen plats.
9. Tillämpas dentin aktivator (Metabond kit) med användning av en liten borste över hela ytan av skallen. Skölj med 0,9% saltlösning.
10. Applicera dentalcement (Metabond set, följ tillverkarens anvisningar för blandning) på skallen, försiktigt täcker ankare skruvar och jord och elektroder referens, men lämnar sonden implantationsstället klar.
11. Fäst de fyra flikarna kopparnät (framställd i steg 4,3) till skallen. För detta, cement den smala basen av varje av dem till den främre, vänster, höger och bakre sidorna av skallen. The koppar ska aldrig vara i direkt kontakt med benet men alltid åtskilda av ett lager cement.

5. Förbereda hjärnans yta

1. Användning av en runt huvud borrskär, borra runt platsen för implantatet i flera steg, medan ofta bevattning av benet med saltlösning.
2. Ta försiktigt bort benet fliken och spola hjärnan ytan.
3. För införing av ett multipel-skaft sond, är en stor remsa av dura avlägsnas. Två verktyg behövs för att ta bort dura: en skalpell och en krok framställd av en insekt nål (alternativt en standard volfram mikroelektrod). Böj nålspetsen genom att trycka mot en hård yta (t.ex. glas objektglas), och bifoga det till ett handtag (här, en bit trä Q-tip, alternativt en microdissecting nål).
4. Lyft dura med kroken, och skär den med en skalpell. Särskild försiktighet vidtas för att undvika skador på pia, fartyg och yta neocortex. Små blödningar kan lösasav saltlösning bevattning. Om större blödning inträffar eller neocortex äventyras på något sätt, bör man överväga att avsluta operationen och förbereda ett annat djur.

6. Implantation sonden

Vid detta stadium är det densiteten och orienteringen av kortikala ytfartyg noggrant. Stereotaktiska koordinater bör justeras, eftersom sonden måste penetrera hjärnan i ett område fritt från större fartyg.

För implantering, kan drivmonteringen hållas med en fästklämma fäst vid stereotaktisk hållaren. Oavbruten synlighet hjärnans yta och tips av sonden är kritiska för en framgångsrik penetration.

1. Långsamt sänka sonden ned till ungefär 1 mm ovanför det avsedda målet, medan konstant spolning av kraniotomi med saltlösning. För neokortikal inspelning, är sondspetsarna sänks in i cortex approximativt 0,5 mm och lyfts tillbaka nära ytan. Försegla kraniotomi genom att applicera en varm smält blandning av vax och paraffinolja genom en nål (10-20g av vax i 10 ml paraffinolja, värmdes vid 65 ° C). Före applicering, kyla blandningen till 30 ° C och testa tätheten. Det bör vara tillräckligt mjukt för att möjliggöra enkel sond rörelse). För att underlätta fullständig täckning, kan blandningen smältas in situ genom framställningar till det härdade vaxet med spetsen på en mikro-cauterizer.
2. Fäst botten av enheten till skallen med handtag cement, var noga med att lämna muttern fritt att vända. Det är av yttersta vikt att undvika varje oavsiktlig "bula" av enheten i detta skede, på annat sätt sonden kommer att skada cortex. Efter att enheten är fastsatt på skallen, bör jämn rörelse av sonden verifieras.
3. Cementera kopplingsdelen av sonden till skallen.

7. Bygga på huvudet Faradays bur

1. Dra upp och montera flikarna kopparnät i ett skyddande cylinder runt sonden och drive. Cylindern fungerar också som en elektrisk sköld mot omgivningsbuller och långsamma artefakter våg som produceras av de laddade whiskers i beter djuret.
2. Justera höjden cylindern genom att skära bort överskottsmaterial så kopparnät är i nivå med den övre delen av sonden kontaktdonet.
3. Lod trådarna från referens-och skruvar malda till de lämpliga stift på kontaktdonet. Även löda angränsande kopparnät flikar tillsammans för att säkerställa deras elektriska kontinuitet och löda jordledningen till koppar nätet.
4. Applicera ett skikt av greppet cement på kopparnät för att förstärka den och för att förhindra varje direkt kontakt mellan metall och djurets hud. Valfritt applicera ett skikt av epoxiharts för att ytterligare förstärka huvudbonader.
5. Testa rörelse drivskruven.
6. Täcka den övre delen av huvudbonaden med en bit skuren från en gummihandske.

8. Inspelning i den fritt rörliga djur

1. Efter lämpåt postoperativ vård, anslut djuret till inspelningen systemet med en hög impedans huvudsteg och ett lätt, ultraflexibla multi-strängen kabel. Balansera vikten av huvudbonaden.
2. Testa inspelningskvalitet varje dag i homecage. Positionen för inspelning områden bedöms av både mönster enhet bränning och formen på det lokala fältet potential. Sänk sonden successivt genom att vrida skruven genom små steg (typiskt 1/8 till 1/4 varv per dag, dvs 35-70 mikrometer) tills målstrukturen uppnås.

9. Representativa resultat

Elektrofysiologiska signaler (lokal fältpotential och enhet aktivitet) varierar beroende på det inspelade struktur och nuvarande beteende hos djuret. Figur 1 visar exempel på 32-kanals CA1 hippocampus inspelningar medan råttan undersöker ett öppet fält. Notera framstående 8 Hz (theta band) svängning det lokala fältet potential under prospektering med stöderimposed tillsatta på flera skaft och platser (exempel på spikar indikeras av pilspetsar). För att analysera neuronal enhet aktivitet, spikes detekteras och sorteras i enskilda enheter med hjälp av klusteranalys av deras vågformer ^15-16.

Figur 1. CA1 Hippocampala inspelningar i beter råtta med en 4 skaft x 8 platser kisel sond. Inspelningar är wideband och samplad vid 20 000 Hz, vilket gör det möjligt att studera både lokala fältpotential svängningar (t.ex. "theta" band 8 Hz rytm) och neuronal spiking aktivitet.

Tabell 1. Alternativ till reagens och utrustning som används.

Denna film visar implantation förfarandet för kisel prober för kroniska stora inspelningar i beter råtta. Kritiska åtgärder för att säkerställa kvalitet på inspelningar av nervaktivitet uppstå genom bräcklighet både biologiska (hjärnvävnad) och tekniska (kisel sond) material. Särskild försiktighet bör iakttas vid hantering sonden att undvika kontakt skaft med någon på distans "hård" yta (till exempel skulle skaften gå sönder om man försökte att implantera dem i hjärnan utan att ta bort dura). På liknande sätt skulle skada på hjärnvävnad (vid utarbetandet av hjärnans yta för implantering, eller från att stöta in i sonden eller enheten när den är implanterad) resultera i skada cellerna och äventyrar inspelning av enheten aktivitet. Dessutom bör den elektriska vägen för jordning kontrolleras, som alla kretsen avbrott mellan cerebrospinalvätskan, marken skruven, koppartråd, koppar flikarna mesh och marken stiftet på Connector, skulle resultera i en stor rörelse artefakter och / eller ledningen brus (50 Hz eller 60 Hz). Om Faradays bur inte är tillräckligt hög, kan den utskjutande mikro-enhet fungerar som en antenn. Antennen effekten kan förhindras genom att jorda enheten också (lod annat koppartråd mellan frekvensomriktaren och koppar-mesh). Hänvisningen signalvägen ska på motsvarande sätt kontrolleras.

Vi illustrerade implantation av en enda kisel sond, men flera platser inspelningar med flera sonder och enheter lätt kan åstadkommas efter lite övning. Dessutom använder vi liknande men mindre enheter för att implantera silikon sonder i musen hjärnan. De kommersiellt tillgängliga kisel sonder och probe-flex kabel-kontakt komponenter, tillsammans med små flerkanaliga förförstärkare har drastiskt förenklat förberedelserna jämfört med tidigare tekniker. Idag är det lika enkelt att spela in från 64 till 128 platser samtidigt i ett beter gnagare från 2 platser medtrådelektroder bara ett decennium sedan.

Kisel sond tekniken är stadd i snabb utveckling och utbredd användning ^17. Förförstärkare kan integreras med sönder ^18, och mindre headstages, multiplexorer eller telemetriska system håller på att tillverkas kommersiellt driva gränserna för fysiologiska inspelningar till ytterligare gränser.

Nya teoretiska och experimentella studier med kisel sonder tyder ^17,19 att med rätt raffinerade storskaliga inspelning metoder, i kombination med nya matematiska insikter och studier modellering, kommer man att kunna spela in från en representativt stor del eller kanske alla neuron från hjärnan volymen övervakas av en multipel skaft kisel sond (tusentals celler i ~ 1 m ^{3, 5-17).} Med tanke på Correlational karaktären av dessa mätningar förblir orsakssamband mellan neuronal aktivitet mönster oundvikligen tvetydig. En grundlig förståelse avHur samordnad ensemble verksamheten framgår sina neuronala komponenter kräver minst två ytterligare steg. Den första är att identifiera de multipla neuronala celltyper, vilka var och en unikt sätt bidrar till montering beteende - bokstavligen som medlemmar av en orkester. Den andra, och kompletterande steg är en principiell manipulation av tillsatta aktiviteten av identifierade celler eller grupper cell på ett sätt som ingenjörer förhöra elektroniska kretsar ^20. De nyligen utvecklade molekylära optogenetic verktyg kan användas för att manipulera specifika cellpopulationer genom lokal ljus stimulering ^20-22. En effektiv kombination storskaliga inspelningar och optiska metoder med silikon sonder ²³ ger möjlighet för både identifiera och selektivt köra specifika cellpopulationer därför gör det möjligt att ta itu med de kausala sambanden i hjärnan nätverk.