La translocación de péptidos en la medición de grandes vesículas unilamelares

1. Preparación de grandes vesículas de lípidos unilamelares (LUVs)

1. Prepare LUVs para servir como membrana de la célula imita para el ensayo ^19.
2. Fosfatidilcolina Mix (POPC, 760,10 g / mol), fosfatidilglicerol (POPG. 770,99 g / mol), 5-dimethylaminonaphthalene-1-sulfonil fosfatidiletanolamina (DNS-PAPA, 994.350 g / mol) (Avanti Polar Lipids) disuelto en cloroformo en un 50 : relación de 45:5. Como cada ensayo requiere la preparación por separado de LUVs experimentales y control, dos viales de la torta de lípidos debe estar preparado. 0.376 mg de lípidos totales (0,188 mg POPC, 0.169 POPG mg, 0.019 mg y DNS-PAPA) suele ser suficiente para que las vesículas suficientes para un juicio translocación única.
3. Se evapora el cloroformo con una _corriente de N2 gas.
4. Secar la torta de lípidos 14.09 horas en un desecador de vacío.
5. Prepare una solución stock 10 mM tampón HEPES (10 mM HEPES, 238,3 g / mol, 45 mM NaCl, 58.44 g / mol, 1 mM EDTA, 372,24 g / mol pH 7,4). Tampón HEPES es stOR a 4 ° C.
6. Prepare una solución madre de 0,4 mM tripsina porcina (23,3 kg / mol) en tampón HEPES 10 mM preparada anteriormente. Tripsina se almacenan a -20 ° C y, en nuestra práctica, por lo general no pasan por más de dos ciclos de congelación-descongelación antes de su uso.
7. Prepare una solución madre de 4,0 mM inhibidor de Bowman-Birk tripsina (8 kg / mol) en 10 mM solución tampón HEPES y almacenar a -20 ° C. En nuestro uso, esta población se abastece mensualmente y por lo general no sufre más de 3 de congelación / deshielo antes de que se hizo de nuevo.
8. Reconstituir experimental vesículas multilamelares (MLV) en una solución 0.2 mM de tripsina mediante la adición de un volumen igual de 0,4 mM de valores de tripsina y 10 mM solución tampón HEPES a la torta seca de lípidos. Para una sola muestra de 0.376 mg de lípidos totales, una mezcla de 150 ml de solución de tripsina y 150 l de tampón HEPES es suficiente.
9. MLV reconstituir el control en una solución con 0,2 mM de tripsina y 2,0 mM de Bowman-Birk inhibidor de la tripsina mediante la adición de un volumen igual de 0.4 mM tripsina de acciones y 4,0 mM de inhibidor de tripsina de las tortas de lípidos secos. Para una sola muestra de 0.376 mg de lípidos totales, una mezcla de 150 ml de solución de tripsina y 150 l de inhibidor de tripsina es suficiente.
10. Transferencia de MLV soluciones de frascos de vidrio de 1,7 ml tubo de microcentrífuga.
11. Asunto MLV soluciones al 5 de congelación / deshielo en nitrógeno líquido.
12. Prepare lípidos extrusora (Avanti Polar Lipids) mediante la colocación de dos soportes de filtro humedecido en una solución tampón HEPES en cada pieza de teflón extrusora. Colocar una membrana pista Nuclepore grabado con 0,1 micras poros (Whatman, Reino Unido) entre las dos piezas de teflón extrusora, y colocar las piezas del extrusor dentro del recipiente de metal extrusora. Coloque el espaciador dona más de las dos piezas del extrusor antes de apretar la tapa de metal de la lata del extrusor y colocarlo en el soporte.
13. Llenar el volumen vacío dentro de la extrusora con 500 l tampón HEPES 10 mM usando una jeringa de vidrio de 250 l para evitar la pérdida de la muestra de la vesícula. </ Li>
14. Cargar cada muestra MLV en la extrusora y empuje la muestra a través de la membrana por lo menos 21 veces para asegurarse de tamaño uniforme de vesículas unilamelares. LUVs se obtienen a partir de la extrusión siguientes MLV solución.
15. LUVs se almacena a 4 º C y utilizar dentro de las 48 horas.

2. La cuantificación de la concentración LUV

1. LUV concentración se cuantificó mediante la determinación del contenido total de fósforo en la muestra ^20.
2. Prepare 8,9 NH ₂ SO ₄ en agua Nanopure y almacenar a temperatura ambiente.
3. Prepare un 2,5% w / v de amonio molibdato VI (588,04 g / mol) disolución en agua Nanopure. Prepare un 10% w / v de ácido ascórbico (176,1 g / mol) disolución en agua Nanopure. Proteger a la solución de ácido ascórbico de la exposición a la luz por la que cubre el tubo con papel de aluminio. Tienda de ambas soluciones a 4 º C durante un máximo de 2 meses.
4. Prepare 0,65 mM de fosfato solución tampón (fosfato monobásico de sodio anhidro, 120 g / mol).
5. Preparar seis estándar tubes. Las normas deben contener 0,0 l, 50 l (0,0325 moles), 100 L (0,065 moles), 175 l (0,114 moles), 250 l (0,163 moles), o 350 l (0,228 moles) de solución de fósforo.
6. Prepare LUV tubos de muestras por triplicado. Cada tubo de ensayo debe contener aproximadamente 0,1 moles de LUVs. Experimentales y de control LUV concentraciones deben medirse por separado.
7. Para corregir las sales de fósforo en el polvo seco inhibidor de Bowman-Birk, un control de LUV en blanco debe estar preparado. El blanco debe contener el mismo volumen del 0,2 mM mM trypsin/2.0 solución de inhibidor de Bowman-Birk que fue colocado en el control LUV tubo de muestra.
8. Colocar 450 l de 8,9 NH ₂ SO ₄ en cada una de las muestras, estándar, y los tubos de vacío.
9. Muestras de calor, las normas y los espacios en blanco durante 25 minutos a 175-210 ° C en un horno.
10. Retire todos los tubos y deje que se enfríen. Añadir 150 ml de 30% de H ₂ O ₂ a cada uno de los tubes.
11. Muestras de calor, las normas y los espacios en blanco durante 30 minutos a 175-210 º C.
12. Quitar las muestras, las normas y los espacios en blanco del fuego. Si alguna de las soluciones aún no son incoloros, se añaden 50 l H ₂ O ₂ a todos los tubos y el calor durante 15 minutos a 175-210 º C.
13. Añadir 3,9 ml Nanopure H ₂ O, 0,5 ml de solución de molibdato de amonio y 0,5 mL de solución de ácido ascórbico a cada tubo.
14. Todos los tubos de calor durante 5-7 minutos en un baño de agua hirviendo.
15. Medir la absorbancia de cada estándar y muestra a 820 nm utilizando un Agilent 8453 espectrofotómetro UV-Visible. El tubo que contiene 0,0 mmol de fósforo se debe utilizar como blanco de todas las normas y experimental LUV muestras. El tubo que contiene el 0,2 mM mM trypsin/2.0 Bowman-Birk solución de inhibidor debe ser utilizado como blanco para el control de la muestra LUV.
16. Un contenido de fósforo lineal absorbancia frente a la curva estándar puede ser producido y utilizado para calcular el total de phosphOrus contenido y la LUV concentración de las muestras.

3. La preparación de soluciones de péptidos

1. Disolver péptido en Nanopure H ₂ O. Los péptidos utilizados en este ensayo como se describe debe contener un residuo de triptófano.
2. Medir la absorbancia de la solución de péptido a 282 nm por triplicado. Calcular la concentración de péptido mediante el coeficiente de extinción molar de triptófano de 5700 M ^-1 cm ^-1.
3. Diluir en agua Nanopure péptido a una concentración final de 30 micras. Almacenar a -20 ° C

4. Translocación de cuantificación

1. Preparar muestras experimentales y de control en el 1,7 mL tubos de microcentrífuga. Añadir LUVs suficiente para cada solución, para una concentración final de 250 mM. Agregar suficiente Bowman-Birk solución de inhibidor de modo que es inhibidor de una concentración final 10 veces mayor que la concentración de tripsina. Agregar suficiente tampón HEPES 10 mM para llevar el volumen de la solución final a 450 mL.
<li> Lugar 50 l solución del péptido en una célula Starna micro fluorómetro de cuarzo. La relación entre LUVs y el péptido es lo suficientemente alta para asegurar que prácticamente todos los péptidos intactos están muy cerca como para un grupo dansilo para dar una señal de FRET, aunque ninguno de ellos ha translocado en la vesícula. Esto es consistente con la observada en el FRET similares condiciones de control de péptidos que hacer y no trasladar en vesículas.
2. Añadir la muestra experimental o de control para la solución de péptido en la cubeta. Esto debería reducir la concentración de péptido final a 3 micras.
3. Comenzar un experimento de 25 minutos cinética de fluorescencia inmediatamente después de la adición de experimental o de control LUV solución, teniendo una lectura de la fluorescencia por lo menos una vez por segundo. La longitud de onda de excitación a 280 nm, la longitud de onda de emisión a 525 nm, y la temperatura a 25 ° C. El uso de un espectrofotómetro de fluorescencia Cary Eclipse, que ajustar la sensibilidad a la PMT de alta.

5. Generación de una Relación de translocación cuantitativos

1. Definir fluorescencia inicial (F _o) como la lectura de fluorescencia después de quince segundos de la recopilación de datos. En nuestra configuración del instrumento, hemos encontrado que los primeros quince segundos de los datos de fluorescencia recogidos no son fiables debido a la mezcla, cerrar la cámara de la muestra, y otras perturbaciones en el sistema con la adición de la muestra. Divide cada lectura posterior por F _o para obtener la fluorescencia relativa (F / F ₀₎ en cada momento.
2. Promedio de todas las lecturas de fluorescencia relativa de la última hora del experimento para obtener una final de fluorescencia relativa media .
3. Divida el para las muestras de control por parte del para muestras experimentales para obtener un valor corregido de fluorescencia final.

La Figura 2 muestra los resultados de este ensayo para un péptido representante que mostró translocación robusto. La señal en este experimento (negro traza) muestra un marcado descenso de la señal de FRET en el tiempo. Sin embargo, es importante controlar la posible pérdida de la señal de FRET debido a la inhibición de tripsina incompleta o otros factores no relacionados con la capacidad de desplazamiento. Con este fin, siempre también medir la señal de FRET entre los péptidos y LUVs que contiene tanto la tripsina y Bowman-Birk inhibidor de la tripsina (gris traza, figura 2). En nuestras manos, ha sido importante para llevar a cabo este control para cada péptido cada vez que se ejecute un experimento. Esto nos permite corregir claramente cualquier cambio en la señal debido a las diferencias entre las preparaciones de vesículas de lípidos o el ruido del instrumento, que puede ser significativo para las señales fluorescente relativamente débil suele observarse en estas concentraciones.

La importancia de las experiencias de controlriment con LUVs que contiene inhibidor de la tripsina se destaca por los datos mostrados en la Figura 3. En este caso, el péptido señal de disminución de una cantidad similar a la de la Figura 2 en la muestra experimental (rastro negro). Sin embargo, la muestra de control muestra una disminución más rápida de este péptido, por lo que su desplazamiento neto es inferior.

La sección 5 de nuestro protocolo describe un método sencillo para cuantificar la translocación de este experimento. Mayores relaciones de translocación son indicativos de los péptidos que trasladar de manera eficiente, la relación de la translocación de los péptidos penetrantes de células se muestra en la Figura 2 es de 1,16, mientras que translocación débilmente péptidos tienen índices de desplazamiento más cercano a 1. En nuestra experiencia, el error estándar de tres experimentos independientes realizados con preparados de diferentes vesícula está en el rango de 0,01 a 0,06.

Figura 1. Esquemática de translocatanálisis de iones. Experimental LUV muestras (A) son dopados con fluorescentes PAPA dansilo (barras de color negro) y contienen encapsulado tripsina (tijeras). Inhibidor de la tripsina (círculo rojo) se utiliza para inhibir la tripsina fuera de la LUVs. El LUVs están expuestas al péptido (morado). Péptido junto con los rendimientos de las membranas LUV un traste de la señal (verde), que disminuye a medida que los péptidos translocting encuentro tripsina internos sin inhibiciones. Tanto la tripsina y el inhibidor de tripsina se encapsulan en el control de las muestras LUV (B) para medir la disminución de la señal de FRET no relacionados con la translocación.

Figura 2. Datos representativos de un péptido penetran en las células. Un representante de la translocación pepide antimicrobianos muestra un descenso significativo en FRET señal en comparación con su control.

Figura3. Datos representativos destacando la importancia del control. Inhibición incompleta de la digestión tríptica de un péptido de translocación no conduce a una caída en el FRET señal con el tiempo, tanto experimentales y de control LUV soluciones. Debido a la diferencia entre el control y la traza experimental es relativamente pequeño, este mutante se caracteriza por ser un péptido débilmente translocación.

El protocolo que aquí se presenta puede ser utilizado para evaluar el cambio relativo en la concentración de péptidos dentro y fuera de las vesículas lipídicas. Estos cambios están relacionados con la capacidad de desplazamiento. Este protocolo se puede utilizar para identificar penetran en las células péptidos con potencial como vectores de la administración de fármacos. Como el interés en la celda de penetración de los péptidos crece, será interesante ver cómo los métodos que miden directamente el caso de translocación se desarrollan y utilizan de una manera cuantitativa.

En nuestro laboratorio, hemos encontrado que la consistencia de la prueba se puede mejorar mediante un seguimiento de algunos aspectos particulares del experimento. En primer lugar, la cuantificación de las vesículas experimentales y de control mejora la consistencia de los resultados obtenidos con este protocolo. Este ensayo también depende de la capacidad de detectar una fluorescencia inicial precisa antes del comienzo de la translocación de proteínas y la digestión. Por lo tanto, es esencial para el Fluorecolección scence señal para comenzar tan pronto como la proteína o péptido está expuesta a la solución de LUV. Este ensayo también es sensible a los inhibidores de tripsina particular utilizado, hasta la fecha, hemos obtenido los resultados más consistentes con Bowman-Birk inhibidor de la tripsina (Sigma T-9777). Es importante destacar que el grado de degradación observada en los escenarios de control parece variar de forma significativa entre los péptidos (como se destaca en las figuras 2 y 3) y en algunos casos entre las preparaciones de vesículas diferentes para el mismo péptido. Este destaca además la necesidad de ejecutar un control con cada replicación experimental. Como un control adicional, también se podría medir la respuesta de FRET para el péptido expuesto a una muestra de la vesícula que no contienen ni tripsina, ni inhibidor de la tripsina. Sin embargo, este control no proporciona ninguna información adicional que sea necesaria con el fin de evaluar los datos para la translocación de péptidos.

Una preocupación es que la membrana lítica-péptidos podría permeabilizar la membrana lo suficiente como parapermitir que la tripsina o inhibidor de la tripsina para viajar a través de la membrana. Los péptidos utilizados para los ejemplos en este trabajo se ha demostrado que causa poca permeabilización de la membrana. Sin embargo, muchos lítica de membrana péptidos también se prestan a esto y ensayos similares translocación ^9,16,21,22. Esto es probablemente debido a que el volumen es mucho mayor fuera que dentro de las vesículas. Por lo tanto, cualquier tripsina que se escapa de la vesícula puede ser inhibida por el exceso de inhibidor de tripsina, previniendo cualquier ruptura del péptido fuera de la vesícula. Por lo tanto, un resultado positivo de este ensayo probablemente denota un péptido que se transloca al mismo tiempo causando disrupción de la membrana relativamente mínima, la prevención de inhibidor de fugas en las vesículas. No obstante, una completa caracterización de las propiedades del péptido debe incluir una evaluación de la permeabilización de la membrana.

Este ensayo es susceptible de adaptación a una amplia variedad de circunstancias experimentales. Teniendo en cuenta que translocación se mide como una diversióncción de la señal de FRET entre la proteína y la membrana, como se describe este ensayo es el mejor adaptado a las proteínas y péptidos que espontáneamente se asocia con LUVs aniónicos, contiene un residuo de triptófano y tienen sitios de corte cerca de la tripsina residuo de triptófano. La proximidad del triptófano a un sitio de corte asegura que el fragmento que contiene triptófano tiene una afinidad insignificante membrana, y por lo tanto una señal de FRET insignificante. Sin embargo, también se podría utilizar péptidos que contienen tirosina o moities fluorescente químicamente conjugada junto con las vesículas que contienen una adecuada FRET aceptor. Del mismo modo, la tripsina puede ser sustituida por otra de la proteasa que se dirige a los sitios alternativos de corte en un péptido de interés. Sin embargo, la alteración de la enzima y el inhibidor puede requerir una optimización adicional, ya que algunos tripsinas disponibles en el mercado y tripsina conllevaron a la agregación o la inestabilidad de las muestras de vesícula. Mediante la alteración de la composición lipídica de la LUVs, este ensayo también se puede utilizar para determinar el papelque la carga de lípidos o juega en la determinación de la estructura de la translocación de péptidos. Además, este ensayo también puede ser fácilmente adaptado para proporcionar alto rendimiento de las mediciones de desplazamiento de un enfoque similar a la de Wimley y compañeros de _^trabajo-9.