Medição Translocação Peptide em grandes vesículas Unilamelares

1. Preparação de grandes vesículas lipídicas Unilamelares (luvs)

1. Prepare luvs para servir como membrana celular imita para o ensaio ^19.
2. Fosfatidilcolina Mix (POPC, 760,10 g / mol), fosfatidilglicerol (POPG. 770,99 g / mol), 5-dimethylaminonaphthalene-1-sulfonil fosfatidiletanolamina (DNS-PAPA, 994,350 g / mol) (Avanti Polar Lipids) dissolvido em clorofórmio a 50 : taxa de 45:5. Como todo ensaio requer a preparação separada de luvs tanto experimental e controle, dois frascos de bolo de lipídios deve ser preparado. 0,376 mg de lipídio total (0,188 mg POPC, 0,169 mg POPG e 0,019 mg DNS-POPE) é geralmente suficiente para fazer vesículas suficientes para um julgamento translocação único.
3. Evaporar o clorofórmio através de um fluxo de gás N _2.
4. Secar o bolo de lipídios 14/09 horas num exsicador de vácuo.
5. Prepare um estoque de 10 mM tampão HEPES (10 mM HEPES, 238,3 g / mol, 45 mM NaCl, 58,44 g / mol, 1 mM EDTA, 372,24 g / mol pH 7,4). Tampão HEPES é stORed a 4 ° C.
6. Prepare uma solução estoque de 0,4 mM de tripsina suína (23,3 kg / mol) em 10 mM tampão HEPES preparado acima. Tripsina é armazenada a -20 ° C e, em nossa prática, geralmente não passam por mais de dois ciclos de congelamento e descongelamento antes de usar.
7. Prepare uma solução estoque de 4,0 mM Bowman-Birk inibidor de tripsina (8 kg / mol) em 10 mM tampão HEPES e armazenar a -20 ° C. Em nosso uso, esse estoque é reabastecido mensais e, normalmente, não sofre mais de 3 congelamento / degelo antes que seja feita novamente.
8. Reconstituir experimental vesículas multilamelares (MLVs) em uma solução de tripsina 0,2 mM, adicionando um volume igual de 0,4 mM de ações de tripsina e 10 mM tampão HEPES para o bolo de lipídios secas. Para uma única amostra de 0,376 mg de lipídeos totais, uma mistura de 150 mL de solução de tripsina e 150 mL de tampão HEPES é suficiente.
9. Reconstituir MLVs controle em uma solução com 0,2 mM e 2,0 mm de tripsina Bowman-Birk inibidor de tripsina, adicionando um volume igual a 0.4 mM estoque de tripsina e 4,0 mM inibidor de tripsina para os bolos secos de lipídios. Para uma única amostra de 0,376 mg de lipídeos totais, uma mistura de 150 mL de solução de tripsina e 150 mL de inibidor de tripsina é suficiente.
10. Soluções de transferência de MLV de frascos de vidro com 1,7 ml tubo de microcentrífuga.
11. Assunto MLV soluções a 5 congelamento / descongelamento em nitrogênio líquido.
12. Prepare lipídica extrusora (Avanti Polar Lipids), colocando dois suportes de filtro umedecido em solução tampão HEPES em cada pedaço extrusora Teflon. Coloque uma membrana track Nuclepore gravado com 0,1 mM poros (Whatman, Reino Unido), entre as duas peças Teflon extrusora, e coloque os pedaços dentro do canister extrusora extrusor metal. Coloque o espaçador donut sobre as duas peças extrusora antes de apertar a tampa de metal da caixinha extrusora e colocando-o no suporte.
13. Preencher o volume vazio dentro da extrusora com 500 10 mM tampão HEPES mL usando uma seringa de vidro 250 mL para evitar perda de amostra de vesícula. </ Li>
14. Carga cada amostra MLV na extrusora e empurre a amostra através da membrana pelo menos 21 vezes para garantir o tamanho das vesículas unilamelares uniforme. Luvs são obtidos a partir da extrusão seguinte solução MLV.
15. Luvs armazenar a 4 ° C e usar dentro de 48 horas.

2. Quantificar LUV Concentração

1. LUV concentração foi quantificada através da determinação do teor total de fósforo na amostra ^20.
2. Prepare 8,9 NH ₂ SO ₄ em água NanoPure e armazenar em temperatura ambiente.
3. Prepare um w 2,5% / v molibdato de amônio VI (588,04 g / mol) solução em água NanoPure. Prepare um ácido ascórbico 10% w / v (176,1 g / mol) solução em água NanoPure. Proteger a solução de ácido ascórbico a partir de exposição à luz, cobrindo o tubo com papel alumínio. Loja ambas as soluções a 4 ° C por até 2 meses.
4. Prepare 0,65 mM tampão fosfato (fosfato de sódio monobásico anidro, 120 g / mol).
5. Prepare seis tu padrãobes. Normas devem conter 0,0 mL, 50 mL (0,0325 μmoles), 100 L (0,065 μmoles), 175 mL (0,114 μmoles), 250 mL (0,163 μmoles), ou 350 mL (0,228 μmoles) de solução de fósforo.
6. Prepare LUV tubos de amostra em triplicata. Cada tubo de amostra deve conter cerca de 0,1 μmoles de luvs. Experimental e controle LUV concentrações devem ser medidas separadamente.
7. Para corrigir os sais de fósforo secas no pó inibidor Bowman-Birk, um controle LUV em branco deve ser preparado. O espaço em branco deve conter o mesmo volume do 0,2 mM mM trypsin/2.0 solução inibidor Bowman-Birk como foi colocado no controle LUV tubo de amostra.
8. ML lugar 450 de 8,9 NH ₂ SO ₄ em cada uma das amostras, padrão e tubos em branco.
9. Amostras de calor, padrões e espaços em branco por 25 minutos a 175-210 ° C em um forno.
10. Remova todos os tubos e deixe esfriar. Adicionar 150 mL de 30% H ₂ O ₂ a cada um dos tubes.
11. Amostras de calor, padrões e espaços em branco durante 30 minutos a 175-210 ° C.
12. Remove as amostras, padrões e espaços em branco do calor. Se qualquer uma das soluções ainda não são incolor, adicionar 50 mL H ₂ O ₂ a todos os tubos e calor por mais 15 minutos a 175-210 ° C.
13. Adicionar 3,9 mL NanoPure H ₂ O, 0,5 mL de solução de molibdato de amônio e 0,5 mL de solução de ácido ascórbico para cada tubo.
14. Todos os tubos de calor por 5-7 minutos em um banho de água fervente.
15. Medir a absorvância de cada padrão e amostra em 820 nm usando um espectrofotômetro Agilent 8453 UV-Visível. O tubo contendo 0,0 mmoles de fósforo deve ser usado como o espaço em branco para todos os padrões e experimental LUV amostras. O tubo contendo o 0,2 mM mM trypsin/2.0 solução inibidor Bowman-Birk deve ser usado como o espaço em branco para o controle LUV amostra.
16. A absorbância linear vs fósforo curva padrão de conteúdo podem ser produzidos e utilizados para calcular o total de phosphOrus conteúdo e LUV concentração das amostras.

3. Preparando Solutions Peptide

1. Dissolver peptídeo em NanoPure H ₂ O. Peptídeos usados ​​neste ensaio, como descrito deve conter um resíduo de triptofano.
2. Medir a absorvância da solução em 282 nm peptídeo em triplicata. Calcular a concentração de peptídeos usando o coeficiente de extinção molar de triptofano de 5700 M ^-1 cm ^-1.
3. Dilua em água peptídeo NanoPure a uma concentração final de 30 mM. Armazenar a -20 ° C

4. Quantificação de translocação

1. Preparar amostras experimental e controle em 1,7 mL tubos de microcentrífuga. Adicionar luvs suficiente para cada solução para uma concentração final de 250 mM. Adicionar o suficiente Bowman-Birk solução inibidora de modo que é inibidor de uma concentração final de 10X superior à concentração de tripsina. Adicionar o suficiente 10 mM tampão HEPES para trazer o volume de solução final para 450 mL.
<li> Coloque 50 mL de solução de peptídeo em uma célula fluorímetro Starna micro quartzo. A relação entre luvs e peptídeo é alta o suficiente para garantir que praticamente todos os peptídeos intactos são próximas o bastante para um grupo dansyl para dar um sinal FRET mesmo que nenhum deles translocado na vesícula. Isto é consistente com o semelhante FRET observado em condições de controle de peptídeos que fazem e não translocate em vesículas.
2. Adicionar a amostra experimental ou de controle para a solução de peptídeo na cuvete. Isso deve reduzir a concentração de peptídeo final, a 3 mM.
3. Iniciar um 25 minutos de cinética fluorescentes imediatamente após a adição de experimental ou controle LUV solução, tendo uma leitura de fluorescência pelo menos uma vez por segundo. Definir o comprimento de onda de excitação a 280 nm, o comprimento de onda de emissão a 525 nm, ea temperatura a 25 ° C. Usando um Cary Eclipse Espectrofotômetro de Fluorescência, vamos definir a sensibilidade PMT para alta.

5. Gerando um Índice de Translocação Quantitative

1. Definir a fluorescência inicial (F _o) como a leitura de fluorescência após quinze segundos de coleta de dados. Em nossa configuração do instrumento, nós descobrimos que os primeiros quinze segundos de dados de fluorescência coletados não são confiáveis ​​devido à mistura, fechando a câmara de amostra, e outras perturbações do sistema após a adição da amostra. Divida cada leitura subseqüente por F _o de obter fluorescência relativa (F / F ₀₎ em cada momento.
2. Média de todas as leituras relativa de fluorescência de último minuto do experimento para obter uma média final de fluorescência relativa .
3. Divida o para amostras de controle pelos para amostras experimentais para obter um valor final corrigido fluorescência.

A Figura 2 mostra os resultados deste ensaio para um peptídeo representante que mostraram translocação robusto. O sinal neste experimento (preto traço) mostra uma queda acentuada no FRET sinal ao longo do tempo. No entanto, é importante para controlar a potencial perda de sinal FRET devido à inibição de tripsina incompleta ou outros fatores não relacionados à capacidade de translocação. Para este fim, nós sempre também medir o FRET sinal entre peptídeos e luvs contendo tanto tripsina Bowman-Birk e inibidor de tripsina (cinza traço, Figura 2). Em nossas mãos, tem sido importante a realização desse controle para cada peptídeo cada vez que um experimento é executado. Isto permite-nos claramente correta para quaisquer alterações no sinal devido a eventuais diferenças entre preparações lipídicas vesícula ou ruído do instrumento, que pode ser significativa para os sinais relativamente fracos fluorescentes normalmente observadas nas concentrações.

A importância do controle de expeexperiencia usando luvs contendo inibidor de tripsina é destacada pelos dados mostrados na Figura 3. Neste caso, o sinal peptídeo diminuíram um valor semelhante ao da Figura 2 na amostra experimental (traço preto). No entanto, a amostra de controle mostra uma queda mais rápida para esse peptídeo, por isso sua translocação líquida é menor.

Ponto 5 do nosso protocolo descreve um método simples para quantificar a translocação deste experimento. Índices mais elevados são indicativos de translocação de peptídeos que translocar eficientemente; a razão para a translocação de peptídeos célula penetrante mostrado na Figura 2, é de 1,16, enquanto fracamente peptídeos translocação têm relações translocação mais próximo de 1. Em nossa experiência, o erro padrão de três experimentos independentes realizados com preparações diferentes vesícula está na faixa de 0,01 a 0,06.

Figura 1. Esquemática de translocation ensaio. LUV Experimental amostras (A) são dopados com fluorescentes PAPA dansyl (barras pretas) e contêm encapsulado tripsina (tesouras). Inibidor de tripsina (círculo vermelho) é usado para inibir tripsina fora do luvs. O luvs estão expostos a peptídeo (roxo). Peptídeo associação com LUV membranas produz um sinal FRET (verde), que diminui à medida que os peptídeos translocting encontro tripsina interna desinibida. Ambos tripsina e inibidor de tripsina são encapsulados no controle LUV amostras (B) para medir a diminuição do sinal FRET alheios a translocação.

Figura 2. Dados representativos para um peptídeo de células-penetrante. Um representante translocação pepide antimicrobiana mostra uma queda significativa na FRET sinal em comparação com o seu controle.

Figura3. Dados representativos destacando a importância do controle. Inibição incompleta da digestão tríptica de um peptídeo não-translocação leva a uma queda na FRET sinal ao longo do tempo, tanto experimental e controle LUV soluções. Porque a diferença entre o controle e traços experimentais é relativamente pequeno, o mutante é caracterizado como um peptídeo fracamente translocação.

O protocolo aqui apresentadas podem ser usados ​​para avaliar a mudança relativa na concentração de peptídeos dentro e fora de vesículas lipídicas. Estas mudanças estão relacionadas à capacidade de translocação. Este protocolo pode ser usado para identificar células-penetrante peptídeos com potencial como vetores de entrega de drogas. Como o interesse na célula-penetrantes peptídeos cresce, ela vai ser interessante ver como os métodos que medem diretamente o evento de translocação são desenvolvidas e utilizadas de forma quantitativa.

Em nosso laboratório, descobrimos que a consistência do ensaio pode ser melhorada através da monitorização cuidadosa alguns aspectos particulares do experimento. Em primeiro lugar, a quantificação de vesículas tanto experimental e controle melhora a consistência dos resultados obtidos usando esse protocolo. Este ensaio também depende da capacidade de detectar um precisa de fluorescência inicial antes do início de translocação de proteínas e digestão. Portanto, é essencial para a fluorecoleção scence sinal para começar assim que a proteína ou peptídeo é exposto à solução LUV. Este ensaio também é sensível ao inibidor de tripsina particular usado; até à data, temos obtido os resultados mais consistentes com o inibidor de tripsina Bowman-Birk (Sigma T-9777). Importante, o grau de degradação observado em cenários de controle parece variar significativamente entre os peptídeos (como em destaque na Figuras 2 e 3) e, em alguns casos entre as preparações vesícula diferentes para o mesmo peptídeo. Este enfatiza ainda mais a necessidade de executar um controle com cada replicação experimental. Como um controle adicional, pode-se também medir a resposta FRET para peptídeo expostos a uma amostra de vesícula que não contenham tripsina nem inibidor de tripsina. No entanto, esse controle não fornece qualquer informação adicional que é necessário para avaliar os dados para a translocação de peptídeos.

Uma preocupação é que a membrana-lítica de peptídeos poderia permeabilizar a membrana o suficiente parapermitir tripsina ou inibidor de tripsina de viajar através da membrana. Os peptídeos usado para exemplos neste documento foram mostrados para causar permeabilização da membrana pouco. No entanto, muitos membrana lítico-peptídeos também são passíveis a esta e ensaios de translocação similares ^9,16,21,22. Isto é provável porque o volume é muito maior fora do que dentro das vesículas. Assim, qualquer tripsina que vaza da vesícula pode ser inibida pelo inibidor de tripsina em excesso, impedindo qualquer clivagem de peptídeo fora da vesícula. Assim, um resultado positivo obtido neste ensaio provavelmente denota um peptídeo que transloca enquanto causando ruptura da membrana relativamente mínima, impedindo inibidor vaze para as vesículas. Independentemente disso, uma caracterização completa das propriedades de peptídeos deve incluir uma avaliação de permeabilização da membrana.

Este ensaio é passível de adaptação para uma ampla variedade de circunstâncias experimentais. Dado que a translocação é medido como uma diversãoction de FRET sinal entre proteínas e membranas, como descrito neste ensaio é mais adequado para proteínas e peptídeos que, espontaneamente, associar luvs aniônicos, contêm um resíduo de triptofano e tem sítios de corte de tripsina perto do resíduo de triptofano. A proximidade do triptofano para um site garante que corte o fragmento que contém triptofano tem uma afinidade insignificante membrana e, portanto, uma insignificante FRET sinal. No entanto, pode-se usar também peptídeos contendo tirosina ou outros quimicamente conjugados moities fluorescentes, juntamente com as vesículas contendo um adequado FRET aceitador. Da mesma forma, a tripsina, poderia ser substituída por outra protease que tem como alvo sites de corte alternativos em um peptídeo de interesse. Contudo, alterar a enzima e inibidor pode exigir otimização adicional uma vez que alguns trypsins disponíveis comercialmente e inibidores de tripsina levou a agregação ou a instabilidade das amostras de vesícula. Alterando a composição lipídica da luvs, este ensaio pode também ser usado para determinar o papelque cobram de lipídios ou joga estrutura na determinação translocação de peptídeos. Além disso, este ensaio pode também ser facilmente adaptado para oferecer alto rendimento medições de translocação em uma abordagem semelhante à de Wimley e colegas de trabalho _^9.