Steigerung der apoptotischen und autophagische Induktion durch eine neuartige synthetische C-1-Analogon von 7-deoxypancratistatin in die menschliche Muttermilch Adenokarzinom und Neuroblastomzellen mit Tamoxifen

Einführung

Apoptose, oder geben Sie mir den programmierten Zelltod, ist ein physiologischer Prozess, der extrinsisch arbeiten kann, über die Bindung eines Liganden an einen Tod death receptor, oder intrinsisch. Der intrinsische Weg der Apoptose wird durch intrazelluläre Stress wie DNA-Schäden und mitochondriale Dysfunktion initiiert, dies führt letztendlich zu der Permeabilisierung der Mitochondrien, die Ableitung des mitochondrialen Membranpotentials (MMP), Freisetzung von apoptogene Faktoren aus dem mitochondrialen Intermembranraum, und die anschließende Ausführung der Apoptose ^ein.

Autophagie ist ein Verfahren, bei dem eine Zelle bricht, verschlechtert, und führt ihre eigenen intrazellulären Komponenten unter Beibehaltung Plasmamembranintegrität und wird von verschiedenen Typen von zellularen Spannungen einschließlich der oxidativen Stress, Hypoxie, Proteinaggregate, Nährstoffmangel, Wachstumsfaktor-Entzug ausgelöst, und beschädigte Organellen ^2. In den Anfangsstadiendieses Verfahren wird cytosolischen Material durch Autophagosomen Doppelklicken mit Membran-Vesikel, die in die Lysosomen zu fusionieren autolysosomes bilden verschlungen. Beitrag lysosomalen Fusion, sind cytosolische Materialien zuvor von Autophagosomen genommen von lysosomalen Hydrolasen abgebaut ^2. Umfangreiche Aktivierung dieses Signalwegs führt zu umfangreichen Abbau intrazellulärer Komponenten, die zu autophagischen Zelltod oder ^Typ-II-3 programmierten Zelltod führen kann.

Ausweichen des Zelltodes wurde als eines der Kennzeichen von Krebs ^4. Krebs ist eine Krankheit, die durch unkontrolliertes Zellwachstum und Proliferation ⁵ gekennzeichnet. Insbesondere ergibt sich aus den Entwicklungsländern Neuroblastom Nervenzellen des sympathischen Nervensystems aus der Neuralleiste ^6. Es ist der häufigste solide Tumor bei jungen Kindern, einem Anteil von rund 9% aller Krebserkrankungen im Kindesalter ^7. Obwohl viele Fortschritte zu Tag als geleistet, bleibt diese Krankheit problematischsowohl Grundlagenforscher und Kliniker. Auf der anderen Seite ist Brustkrebs die häufigste Krebserkrankung bei Frauen ^8. Tamoxifen (TAM) wurde häufig für die Therapie in Hormon-responsive Brustkrebs verwendet als Östrogenrezeptor (ER)-Antagonisten ^9. Dennoch bieten andere Berichte Erkenntnisse über einen zusätzlichen unabhängigen Mechanismen der Apoptose-Induktion durch TAM. Insbesondere interagiert TAM mit Komplex I der mitochondrialen Atmungskette (MRC) an seinem Flavinmononukleotid (FMN) Grundstück ^10.

PST ist eine natürliche Verbindung aus der Pflanze isoliert Hymenocallis littoralis. Im Kontrast von vielen derzeit verwendeten Chemotherapeutika, hat sich gezeigt, um Apoptose zu induzieren, in einer nicht-genotoxischen Weise selektiv in verschiedenen Arten von Krebszellen über mitochondriale Targeting ^11-15. Allerdings hat die präklinische und klinische Arbeit von seiner Verfügbarkeit behindert worden, es ist in sehr geringen Mengen in der natürlichen Quelle und viele complic vorhandenations Belastung seine chemische Synthese. Wir haben synthetisiert und deren synthetische Analoga von 7-deoxypancratistatin gesiebt und beobachtet ähnliche Anti-Krebs-Aktivität in einem C-1 Acetoxymethyl-Derivat, JC-TH-acetat-4 (JCTH-4) ^16. Wir haben jetzt in der Hand ein synthetisches Analogon mit PST potente Anti-Krebs-Aktivität. Seine Synthese wurde standardisiert und kann skaliert werden, um ausreichende Mengen für die präklinische und klinische Arbeit zu produzieren. Da natürliche PST und TAM sowohl Ziel die Mitochondrien, wäre es interessant, um die kombinierte Wirkung von ein synthetisches Analogon von PST am menschlichen Brustkrebszellen und Neuroblastom-Zellen untersuchen, in Kombination mit TAM.

Hier berichten wir über die selektive Zytotoxizität von JCTH-4 in humanen Neuroblastom (SH-SY5Y) und Brust-Adenokarzinom (MCF7-Zellen). JCTH-4 war in der Lage, Apoptose in beiden Zelllinien durch mitochondriale Targeting zu induzieren; JCTH-4 verursachte Verlustleistung von MMP und eine Erhöhung der reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) Produktion in isolierten mitochondria von diesen Krebszellen. Darüber hinaus wurde durch Autophagie JCTH-4 in MCF7-Zellen induziert. Interessanterweise ist die Zugabe von TAM zu JCTH-4 Beleidigung die vorgenannten Auswirkungen der JCTH-4 in SH-SY5Y und MCF7-Zellen verbessert. Morphologische Veränderungen durch JCTH-4 und TAM allein und in Kombination in MCF7-Zellen induziert wurden über Zeitraffer-Mikroskopie von Phasenkontrast oder Hellfeld-Bildern überwacht. Normale menschliche fötale Fibroblasten (NFF), eine deutliche Abnahme in der Empfindlichkeit gegenüber JCTH-4 allein oder in Kombination mit TAM. Daher deuten diese Beobachtungen JCTH-4, allein und in mit TAM, um ein sicheres und wirksames Chemotherapeutikum gegen Brustkrebs und Neuroblastom sein.

Materialien und Methoden

1. Cell Culture

1. Wachsen und Kultur SH-SY5Y humanen Neuroblastom-Zellen (ATCC, Cat. Nr. CRL-2266, Manassas, VA, USA) mit Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium F-12 HAM (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON, Kanada) mit 2 mM ergänzt L-GlutaminE, 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 10 mg / ml Gentamycin (Gibco BRL, VWR, Mississauga, ON, Kanada). Pflegen Zellen bei 37 ° C und 5% CO _2.
2. Wachsen und Kultur MCF7 menschlichen Brust-Adenokarzinom-Zellen (ATCC, Cat. Nr. HTB-22, Manassas, VA, USA) in RPMI-1640 Medium (Sigma-Aldrich Kanada, Mississauga, ON, Kanada) mit 10% FBS-Standard (Thermo ergänzt Scientific, Waltham, MA) und 10 mg / ml Gentamycin (Gibco BRL, VWR, Mississauga, ON, Kanada). Pflegen Zellen bei 37 ° C und 5% CO _2.
3. Wachsen und Kultur die scheinbar normale menschliche fetale Fibroblasten (NFF)-Zelllinie (Coriell Institut für medizinische Forschung, Cat. No AG04431B, Camden, NJ, USA) in Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium, High Glucose (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA ) mit 15% FBS und 10 mg / ml Gentamycin (Gibco BRL, VWR, Mississauga, ON, Kanada) ergänzt. Pflegen Zellen bei 37 ° C und 5% CO _2.

2. Arzneimittelzubereitung

1. Abwiegen Tamoxifen (TAM) Citratsalz (Sigma-Aldrich, Cat. Nr. T9262, Mississauga, ON, Kanada) und löst ihn in DMSO bis zu einer 10 mM Stammlösung werden. Lagerung der Stammlösung bei -20 ° C bis zur Verwendung. Alle Fahrzeug-Kontrollen in dieser Studie enthaltenen DMSO bei weniger als 0,5% verwendet.
2. Wiederholen Sie Schritt 2,1, um eine 1 mM Stammlösung in DMSO von JC-TH-Acetat-4 (JCTH-4), durch chemoenzymatische Synthese von Brombenzol hergestellt wie zuvor ¹⁶ beschrieben aufgelöst vorzubereiten. Lagerung der Stammlösung bei -20 ° C bis zur Verwendung. Alle Fahrzeug-Kontrollen in dieser Studie enthaltenen DMSO bei weniger als 0,5% verwendet.

3. Zeitraffer-Mikroskopie

1. Platte ca. 2,0 x 10 ⁵ MCF7-Zellen in 35 mm Glasboden Kulturschalen (MatTek Corporation, Cat. No P35G-014-C, Ashland, MA, USA) unter sterilen Bedingungen einer Klasse II Biosicherheitswerkbank und es ihnen ermöglichen, bei wachsen 37 ° C und 5% CO _2.
2. Wenn die Zellen 60 bis 70% Konfluenz erreichen, behandeln sie mit 1 uM JCTH-4 mit einem 1 mmStammlösung in DMSO und 10 &mgr; M TAM mit einer 10 mM Stammlösung in DMSO gelöst, allein und in Kombination in einer Klasse II Biosicherheitswerkbank aufgelöst.
3. Nach der Behandlung der Zellen für 48 Stunden, statt Zellen in einer beheizten Kammer bei 37 ° C mit 5% CO ₂ auf einer Stufe einer Leica DMI6000 Fluoreszenzmikroskops (Leica Microsystems, Wetzlar, Deutschland).
4. Mit LAS AF6000 Software, stellen Sie das Mikroskop zu Phasenkontrast oder Hellfeld-Aufnahmen bei 400-facher Vergrößerung nehmen alle 5 Minuten für 18 Stunden.

4. Kernfärbung

1. Tafel etwa 2,0 x 10 ⁵ MCF7 oder SH-SY5Y-Zellen in jeder Vertiefung einer 6-Well-Gewebekulturplatten klare Platte in einer Klasse-II-Biosicherheitswerkbank und damit sie bei 37 ° C und 5% CO ₂ wachsen.
2. Wenn die Zellen 60 bis 70% Konfluenz erreichen, behandeln sie mit 1 uM JCTH-4 mit einer 1 mM Stammlösung in DMSO gelöst und 10 uM TAM mit einer 10 mM Stammlösung in DMSO gelöst, beideallein und in Kombination in einer Klasse II Biosicherheitswerkbank.
3. Inkubieren von Zellen mit den oben genannten Behandlungen bei 37 ° C und 5% CO ₂ für 48 Stunden (SH-SY5Y-Zellen) oder 72 Stunden (MCF7-Zellen).
4. Nach der Behandlung und Inkubation von Zellen mit Drogen, direkt hinzufügen Hoechst 33342 Farbstoff (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) zu den Medien der behandelten Zellen zu einer Endkonzentration von 10 uM, um die Kerne zu färben.
5. Inkubieren Sie die Zellen mit dem Farbstoff Hoechst für 5 bis 10 Minuten vor Licht geschützt.
6. Die Platte auf der Bühne eines Leica DM IRB invertierten Fluoreszenzmikroskop (Leica Microsystems, Wetzlar, Deutschland).
7. Nehmen Leuchtstoff-und Phase-Aufnahmen bei 400-facher Vergrößerung.

5. Annexin V-Bindungstest

1. Platte ca. 5,0 x 10 ⁵ MCF7, SH-SY5Y oder NFF Zellen in 10 ml Gewebekultur-Platten in einer Klasse II Biosicherheitswerkbank und es ihnen ermöglichen, bei 37 ° C und 5% CO ₂ wachsen.
2. WHenne Zellen erreichen 60 bis 70% Konfluenz, behandeln sie mit 1 uM JCTH-4 mit einer 1 mM Stammlösung in DMSO und 10 &mgr; M TAM mit einer 10 mM Stammlösung in DMSO gelöst, sowohl allein als auch in Kombination in einer Klasse-II-Biosicherheit aufgelöst Schrank.
3. Inkubieren von Zellen mit den oben genannten Behandlungen bei 37 ° C und 5% CO ₂ für 48 Stunden (SH-SY5Y-Zellen) oder 72 Stunden (MCF7 und NFF Zellen).
4. Planen Annexin V Bindungspuffer in ddH ₂ O mit 10 mM HEPES, 10 mM NaOH, 140 mM NaCl und 1 mM CaCl ₂ bei pH 7,6 und bei 4 ° C bis zur Verwendung.
5. Nach der Behandlung und Inkubation von Zellen mit Drogen, entfernen Sie die Medien aus den Platten, die suspendierten Zellen und legen Sie sie in einen separaten 15 ml konischen Röhrchen für jede unterschiedliche Behandlung Gruppe mit der richtigen Behandlung beschriftet.
6. Trennen adhärenten Zellen von den Platten unter Verwendung von Trypsin.
7. Nachdem die Zellen von der Platte als Ergebnis des Trypsin angehoben, Absaugen der Medien in der 15 ml konischen platziertal Rohr in Schritt 5,4 und setzen Sie ihn wieder in ihrer ursprünglichen Platten mit den Trypsin suspendierten Zellen.
8. Mit der elektronischen Pipette Füllstoff und serologischen Pipetten, mischen Sie die Medien mit dem Trypsin-Zell-Lösung und setzen diese Mischung wieder in den entsprechenden 15 ml konischen Röhrchen.
9. Zentrifugation der Zellen bei 600 × g für 5 Minuten bei 4 ° C, Entfernen des Überstandes aus jedem Röhrchen, und resuspendieren Zellen in PBS.
10. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 600 xg für 5 Minuten, entfernen Sie den Überstand aus jedem Röhrchen und Resuspendieren Sie die Zellen in beschrifteten Mikrozentrifugenröhrchen mit etwa 50 bis 70 ul Annexin V Bindungspuffer.
11. Fügen Sie Annexin V AlexaFluor-488 (1.50) (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON, Kanada) und Hoechst-Farbstoff in einer Endkonzentration von 10 uM und inkubieren für 15 Minuten vor Licht geschützt.
12. Nach der Inkubation Wirbel eines der Mikrozentrifugenröhrchen, fügen Sie 7 bis 10 ul der Zelle Mischung auf einen Objektträger, legen Sie ein Deckglas überragen der Zelle Mischung auf dem Mikroskope Dia-und Fluoreszenz-Aufnahmen nehmen, Bilder sowohl Annexin V und Hoechst für jede Ansicht, bei 400-facher Vergrößerung auf einem Leica DM IRB invertierten Fluoreszenzmikroskop (Leica Microsystems, Wetzlar, Deutschland). Wiederholen für jede experimentelle Probe in jeder der verbleibenden Mikrozentrifugenröhrchen.

6. Wasserlösliche Tetrazoliumsalz (WST-1)-Assay für die Zellviabilität

1. Trypsinieren eine konfluente T75-Flasche oder 10 cm Gewebekulturschale von MCF7, SH-SY5Y oder NFF Zellen in einem Klasse-II-Biosicherheitswerkbank.
2. Nachdem die Zellen aufgehoben worden, fügen Sie 5 bis 10 ml der Medien auf die Trypsin und legen Sie die Medien Zellsuspension in einem 15 ml konischen Röhrchen.
3. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 600 xg für 5 Minuten, legen Sie den Schlauch wieder in die Biosicherheitswerkbank, entfernen Sie den Überstand aus jeder Röhre, und die Zellen in etwa 1 bis 3 ml Medium je nach Größe Zellpellet.
4. Platz 10 ul der Zellsuspension in einem Mikrozentrifugenröhrchen, fügen Sie 10 l Trypanblau (SIGMA-Aldrich, Mississauga, ON, Kanada), und mischen Sie mit der Pipette.
5. Legen Sie 10 l Trypanblau suspendierten Zellen auf einem Hämocytometer (Hausser Scientific, USA), zählen Sie die Zellen, und berechnen Sie die Konzentration der Zellen der Zellsuspension im Original 15 ml konischen Röhrchen.
6. Mit dieser Konzentration, um die Menge der ursprünglichen Zellsuspension benötigt wird, um verdünnten Zellsuspensionen mit Konzentrationen von 1,5 x 10 ⁵ Zellen / ml für MCF7 und SH-SY5Y und 5,0 x 10 ⁴ Zellen für NFF zum Plattieren Bedarf zu erstellen bestimmen.
7. Verwenden Sie die verdünnten Zellsuspensionen auf Platte 15 x 10 ³ MCF7 oder SH-SY5Y Zellen / Well bzw. 5,0 x 10 ³ NFF Zellen / Well durch Zugabe von 100 ul der verdünnten Zellsuspensionen in jede Vertiefung einer 96-Well klarem Boden Gewebekulturplatte. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C und 5% CO ₂ über Nacht.
8. Behandeln Sie die Zellen mit 1 uM JCTH-4 und 10 uM TAM sowohl alleine als auch in Kombination in einer Klasse II Biosicherheitswerkbank für 72 Stundens für MCF7 und NFF-Zellen, und für 48 Stunden für SH-SY5Y-Zellen.
9. Nach der Behandlung und Inkubation von Drogen, fügen Sie 10 l WST-1 Reagenz (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA) in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte für 4 Stunden bei 37 ° C und 5% CO _2.
10. Nehmen Absorptionswerte bei 450 nm auf einem Wallac Victor ³ 1420 Multilabel Counter (PerkinElmer, Woodbridge, ON, Kanada) und drückt sie als Prozentsatz der Lösungsmittel Kontrollgruppen.

7. Tetramethylrhodamin Methylester (TMRM) Färbung

1. Legen Sie ein Deckglas in jedes Well einer 6-Well-clear bottom Gewebekulturplatte Platte und MCF7-Zellen in jede Vertiefung einer 6-Well-Gewebekulturplatten in einer Klasse II Biosicherheitswerkbank. Lassen Sie sie wachsen bei 37 ° C und 5% CO _2.
2. Wenn die Zellen 60 bis 70% Konfluenz erreichen, behandeln sie mit 1 uM JCTH-4 mit einer 1 mM Stammlösung in DMSO gelöst und 10 uM TAM mit einer 10 mM Stammlösung in DMSO gelöst,sowohl alleine als auch in Kombination in einer Klasse II Biosicherheitswerkbank.
3. Inkubieren von Zellen mit den oben genannten Behandlungen bei 37 ° C und 5% CO ₂ für 72 Stunden.
4. Nach der Behandlung und Inkubation von Zellen mit Drogen, direkt hinzufügen Hoechst 33342 Farbstoff (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) zu den Medien der behandelten Zellen zu einer Endkonzentration von 10 uM, um die Kerne sowie Tetramethylrhodamin Methylester (TMRM Fleck ) (Gibco BRL, VWR, Mississauga, ON, Kanada) in einer Endkonzentration von 200 nM.
5. Inkubieren Sie die Zellen mit den Farbstoffen bei 5% CO ₂ und 37 ° C für 45 Minuten vor Licht geschützt.
6. Pipette 8 &mgr; l PBS Medien oder auf einen Objektträger und Deckglas einen aus der 6-Well-Platte und legen Sie es auf der Oberseite der Medien oder PBS auf dem Objektträger mit den Zellen nach unten mit einer Pinzette.
7. Nehmen fluoreszierende Aufnahmen, sowohl Hoechst und TMRM Aufnahmen für jede Ansicht, mit einem Leica DM IRB invertierten Fluoreszenzmikroskop (Leica Microsystems, Wetzlar, Deutschland) bei 400-facher Vergrößerung.

8. Mitochondriale Isolation

1. Bereiten Sie etwa 10 ml hypotonischen Puffer (1 mM EDTA, 5 mM Tris-HCl, 210 mM Mannitol, 70 mM Saccharose, 10 uM Leu-PEP, 10 uM Pep-A, und 100 uM PMSF) und Reaktionspuffer und halten beide Lösungen auf Eis.
2. Mit etwa 8 bis 10 konfluenten T75 Gewebekulturflaschen der SH-SY5Y-Zellen, die Zellen trypsinieren, Medien hinzufügen, um das Trypsin zu neutralisieren, sammeln die Zellsuspensionen in 50 ml konischen Röhrchen und zentrifugieren bei 600 × g für 5 Minuten bei 4 ° C.
3. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Zellpellets in etwa 10 bis 20 ml kaltem PBS, zentrifugieren bei 600 xg für 5 Minuten bei 4 ° C, und wiederholen Sie diesen Waschvorgang einmal.
4. Entfernen Sie den Überstand und die Zellen in kalten hypotonischen Puffer. Homogenisieren Zellen manuell mit einem Glas Gewebe Mühle und zentrifugieren Sie die Zelllysat bei 600 xg für 5 Minuten bei 4 ° C

9. Amplex Red Assay

1. Nach der Isolierung von Zellen Mitochondrien, eine Schätzung der Konzentration von Protein der Probe isolierter Mitochondrien unter Verwendung einer Standardkurve von bekannten Konzentrationen von 1 mg BSA (Bovine Serum Albumin) mit dem BioRad-Protein-Assay (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA USA) .
2. Wenn der geschätzte Konzentration des Proteins der isolierten Mitochondrien-Lösung, berechnet das Volumen dieser Lösung auf 20 pg Protein zu ergeben. Pipettieren Sie dieses Volumen in jede Vertiefung von einem undurchsichtigen 96-Well-Platte auf 20 ug Protein / Vertiefung zu laden.
3. Füllen Sie jede Vertiefung in der Platte zu einem Gesamtvolumen von 100 ul mit Reaktionspuffer, medikamentöse Behandlung (mit einer Endkonzentration von 1 uM JCTH-4, und / oder 10 uM TAM, oder 250 uM PQ (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON , Canada) als positive Kontrolle verwendet), Amplex Red-Reagenz bei einer Endkonzentration von 50 pM und Meerrettichperoxidase (HRP) (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON, Kanada) im Verhältnis von 6 U/200 ul.
4. Nach einer Inkubation von 2 Stunden, nehmen Fluoreszenz-Messungen bei Ex. 560 nm und Em. 590 nm auf einem Spektrofluorometer (XPS SpectraMax Gemini, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).

10. Zelllysat Vorbereitung

1. MCF7-Zellen wachsen auf 60 bis 70% Konfluenz in 10 cm Gewebekulturplatten.
2. Gönnen Zellen mit 1 uM JCTH-4 und 10 uM TAM allein und in Kombination für 72 Stunden mit etwa 10 bis 15 Platten pro Behandlungsgruppe.
3. Bereiten Zell-Lyse-Puffer (10 mM Tris-HCl bei pH 7,2, 5 mM KCl, 1 mM MgCl _2, 1 mM EGTA, 1% Triton-X-100, 10 uM Leu-PEP, 10 uM Pep-A, und 100 uM PMSF ) und lagern bei 4 ° C bis zur Verwendung.
4. Mechanisch entfernen Zellen von den Plattenoberflächen mit einem Zellschaber gesammelt und markierten Zellen in 50ml konische Röhrchen.
5. Die Röhrchen bei 600 xg für 5 Minuten bei 4 ° C, entfernen den Überstand und resuspendieren Zellpellets in etwa 10 bis 20 ml kaltem PBS, Zentrifugieren bei 600 xg für 5 Minuten bei 4 ° C, und wiederholen Sie diesen Waschvorgang einmal.
6. Entfernen Sie den Überstand und die Zellen in kalten Zelllysepuffer. Homogenisieren Zellen manuell mit einem Glas Gewebe Mühle und zentrifugieren Sie die Zelllysat bei 600 xg für 5 Minuten bei 4 ° C
7. Entsorgen Sie die Pellets und speichern die Zelllysate bei -20 ° C bis zur Verwendung.

11. Western-Blot-Analysen

1. Bestimmung der Proteinkonzentration von Zelllysaten unter Verwendung des BioRad Protein Assay (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA USA). Betreff der Proteinproben einer SDS-PAGE und Transfer-Protein auf eine Nitrocellulosemembran.
2. Nach der Übertragung Block Membranen mit einer 5% w / v Milch TBST (Tris-gepufferte Kochsalzlösung Tween-20) Lösung für 1 Stunde.
3. Probe-Membranen mit einer Ameisei-LC3 Antikörper in Kaninchen angehoben (1:500) (Novus Biologicals, Cat. No NB100-2220, Littleton, CO, USA), oder ein Anti-β-Aktin-Antikörper in der Maus (1:1000) (Santa Cruz erhoben Biotechnology, Inc., Cat. No sc-81178, Paso Robles, CA, USA) über Nacht bei 4 ° C.
4. Betrifft Membranen einem 15 Minuten und zwei 5-minütige Waschungen in TBST inkubiert und mit einem anti-Maus (1:2000) oder einem Anti-Kaninchen (1:2000) Meerrettich-Peroxidase-konjugierten sekundären Antikörper (Abcam, Cat No. Ab6728 & ab6802, Cambridge, MA, USA) für 1 Stunde bei 4 ° C
5. Betreff Membranen zu drei aufeinander folgenden 5 Minuten Waschen in TBST und visualisieren Proteinbanden mit verstärkter Chemilumineszenz-Reagenz (Sigma-Aldrich, CPS160, Mississauga, ON, Kanada).
6. Densitometrie durchgeführt Analysen mit ImageJ-Software.

12. Monodansylcadaverine (MDC) Färbung

1. Legen Sie ein Deckglas in jedes Well einer 6-Well-clear bottom Gewebekulturplatte Platte und MCF7-Zellen in jede Vertiefung einer 6auch klar, Bottom Gewebekulturplatte in einer Klasse II Biosicherheitswerkbank. Lassen Sie sie wachsen bei 37 ° C und 5% CO _2.
2. Wenn die Zellen 60 bis 70% Konfluenz erreichen, behandeln sie mit 1 uM JCTH-4 mit einer 1 mM Stammlösung in DMSO gelöst und 10 uM TAM mit einer 10 mM Stammlösung in DMSO gelöst, sowohl allein als auch in Kombination in einer Klasse-II-Biosicherheit Schrank.
3. Inkubieren von Zellen mit den oben genannten Behandlungen bei 37 ° C und 5% CO ₂ für 72 Stunden.
4. Nach der Behandlung und die Inkubation von Zellen mit Medikamenten, direkt hinzugefügt Monodansylcadaverine (MDC) (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON, Kanada) bis zu einer Endkonzentration von 0,1 mM zu jeder Vertiefung für 15 min.
5. Inkubieren der Zellen mit dem Farbstoff bei 5% CO ₂ und 37 ° C für 15 Minuten vor Licht geschützt.
6. Pipettieren Sie 30 ul Medium oder PBS auf einen Objektträger und Deckglas einen aus der 6-Well-Platte und legen Sie es auf der Oberseite der Medien oder PBS auf dem Objektträger mit den Zellen FACIng nach unten mit einer Pinzette.
7. Nehmen fluoreszierende MDC und Phase-Aufnahmen, für jede Ansicht, mit einem Leica DM IRB invertierten Fluoreszenzmikroskop (Leica Microsystems, Wetzlar, Deutschland) bei 400-facher Vergrößerung.

13. Repräsentative Ergebnisse

Selektive Induktion von Apoptose in humanen Brust-Adenokarzinom und Neuroblastomzellen durch JCTH-4: Verbesserung der Aktivität von TAM

Selektive Induktion der Apoptose wurde in verschiedenen Krebszellen durch natürliche PST (Abb. 1a) ^11-13 gezeigt. Aufgrund der geringen Verfügbarkeit von PST, haben wir Analoga von 7-deoxypancratistatin (JCTH-4, Abb. 1b) synthetisiert und sie nach ähnlichen Anti-Krebs-Aktivität in humanen Brust-Adenokarzinom (MCF7) und Neuroblastomzellen (SH-SY5Y). In der ersten Phase von Experimenten, wollten wir morphologischen Veränderungen im Laufe der Zeit nach der Behandlung mit JCTH-4 und TAM allein überwachen und in Kombination in MCF7-Zelles. MCF7-Zellen wurden für 18 Stunden überwacht, wie in 1 durch Video Zeitraffer-Mikroskopie mit Phasenkontrast Bilder produziert gesehen, mit dem Lösungsmittel behandelt (Kontrolle) für 48 Stunden, wobei diese Zellen zeigten keine wesentlichen Veränderungen in der Morphologie. Im Gegensatz dazu nach 48 Stunden von 1 uM JCTH-4-Behandlung zeigten diese Zellen morphologische Veränderungen, die mit Apoptose assoziiert, wie Schrumpfung, blebbing, apoptotische Körper Bildung, wie in Bild 2 zu sehen. Auf der anderen Seite, hergestellt TAM-Behandlung allein in MCF7-Zellen eine sehr unterschiedliche Morphologie einschließlich punktförmige Einschlüsse anzeigt Autophagosomen mit Autophagie (Video 3) zugeordnet ist. Sehr minimal apoptotische Morphologie beobachtet wurde und Zellen in der Regel ausgestellt gesunden Morphologie vergleichbar mit dem Lösungsmittel behandelt Kontrolle MCF7-Zellen. Interessanterweise, in Gegenwart von TAM, wurde die Apoptose-Induktion durch JCTH-4 drastisch erhöht, wie durch erhöhte apoptotische Morphologie in MCF7-Zellen nach 48 Stunden als illustrat angegebened in Video 4.

In der zweiten Phase von Experimenten verwendeten wir Fluoreszenzfarbstoffe, die Induktion von Apoptose zu bewerten. Nach 72 Stunden und 48 Stunden von 1 uM JCTH-4-Behandlung in MCF7-und SH-SY5Y-Zellen bzw. Hoechst-Farbstoff verwendet wurde und die nukleare Morphologie zu überwachen. Die Ergebnisse zeigten, Kondensmilch, hell gefärbten Zellkernen durch apoptotische Körper in MCF7-und SH-SY5Y-Zellen, was auf Apoptose-Induktion (Abb. 2a, b) begleitet. TAM-Behandlung allein ergab minimale apoptotischen Kernmorphologie in MCF7-und SH-SY5Y-Zellen; Kerne waren groß, rund, dunkel gefärbt und mit Hoechst vergleichbar mit Lösungsmittel Kontrollgruppe (Abb. 2a, b). Im Einvernehmen mit Video 4, Kerne von MCF7-und SH-SY5Y Zellen angezeigt ein deutlicher Anstieg der apoptotischen Morphologie mit der kombinierten Behandlung nach 72 Stunden (Abb. 2a, b).

Um Apoptoseinduktion zu überprüfen, wurden die Zellen für p bewertetenhosphatidylserine Externalisierung, ein Marker für Apoptose, über ein Annexin V Bindungsassay ^17. MCF7 und SH-SY5Y-Zellen für 72 bzw. 48 Stunden mit 1 uM JCTH-4 allein oder in Kombination mit 10 pM TAM waren positiv für Annexin V-Bindung, die durch die grüne Fluoreszenz, bestätigt die Induktion von Apoptose (Fig. 3a, b behandelten ). Kein großer Externalisierung von Phosphatidylserin in MCF7 beobachtet und SH-SY5Y-Zellen mit TAM allein behandelt, als auch in Zellen mit NFF allen genannten Behandlungsgruppen nach 72 Stunden (3c) behandelt. Daher JCTH-4 allein oder in Kombination mit TAM selektiv induziert Apoptose in MCF7 und SH-SY5Y-Zellen.

Um die Wirkung der JCTH-4 alleine quantifizieren und in Kombination mit TAM ein WST-1-Basis kolorimetrischen Assay für die Lebensfähigkeit der Zellen, ein Indikator der aktiven Stoffwechsel der Zellen, wurde durchgeführt und MCF7-Zellen, die NFF für 72 Stunden und SH-SY5Y-Zellen behandelt für 48 Stunden.Im Vergleich zu den Kontrollgruppen Lösungsmittel, verringerte 1 uM JCTH-4 aktiven Zellstoffwechsel um über 50%, während 10 uM TAM allein zeigte keinen signifikanten Unterschied sowohl in MCF7-und SH-SY5Y-Zellen (Abb. 4a, b). Interessanterweise in MCF7-und SH-SY5Y-Zellen führte die Zugabe von TAM zu JCTH-4 Beleidigung zu einer synergistischen Rückgang im Zellstoffwechsel. NFF-Zellen waren drastisch weniger empfindlich sowohl JCTH-4 allein und JCTH-4 mit TAM (Abb. 4c). Daher demonstriert JCTH-4 selektiv synergistische Aktivität mit TAM in MCF7-und SH-SY5Y-Zellen.

Mitochondriale Targeting von JCTH-4

Um zu sehen ob JCTH-4 zielt auf die Mitochondrien zur Apoptose mitochondrialen Membranpotentials in ganzen Zellen und ROS in isolierten Mitochondrien ausgelöst wurde überwacht. MCF7-Zellen wurden für 72 Stunden behandelt und gefärbt mit TMRM. 1 uM JCTH-4 verminderte MMP, die durch den Verlust der roten Fluoreszenz (Abb. 5a) angegeben. Doch mit the Zugabe von 10 uM TAM wurde eine größere Verlustleistung von MMP beobachtet, während 10 uM TAM allein hatte keinen Effekt auf die MMP klar.

Wie erhöht ROS Generation zu mitochondrialen Membranpermeabilisierung und Apoptose-Induktion verbunden gewesen, wurde die Produktion von ROS mit Amplex Red Farbstoff in isolierten Mitochondrien von SH-SY5Y-Zellen mit 1 uM JCTH-4 und 10 uM TAM, allein behandelt wurden und in Kombination ¹⁸ beurteilt ^-20. Fluoreszenz-Messwerte wurden als relative Fluoreszenz (RFU) angegeben. Erhöht die in ROS Generation wurden mit JCTH-4 und TAM allein (Abb. 5b) beobachtet. Interessanterweise ergab eine Kombinationsbehandlung eine größere Zunahme der ROS-Produktion. Ein bekanntes Induktor von ROS in den Mitochondrien, PQ, wurde als positive Kontrolle verwendet.

Die Induktion der Autophagie durch JCTH-4 und TAM

Autophagische Induktion hat zu chemotherapeutischen Beleidigung wurde von vielen verschiedenen Verbindungen verbunden (Abb. 6a) behandelt. Bemerkenswerterweise war die Intensität der Färbung MDC größten bei der kombinierten Behandlung, gefolgt von TAM allein und JCTH-4 allein.

Während Autophagie, Mikrotubuli-assoziierten Protein 1 light chain 3 (LC3), die normalerweise im Cytosol (LC3-I) liegt, mit Phosphatidylethanolamin lipidiert und anschließend zu den lokalisierten autophagosomalen Membranen (LC3-II) ^2. Um die Induktion von Autophagie zu verifizieren, wurden Ebenen LC3-II in MCF7-Zellen für 72 Stunden über Western-Blot-Analysen unter Therapie. 1 uM JCTH-4 leicht die Umwandlung von LC3-I bis LC3-II induziert, während 10 uM TAM erzeugt eine größere autophagischen Reaktion (Abb.6b). Interessanterweise führte die Kombination der Behandlung in der größten Induktion von Autophagie, was eine LC3-II LC3-I-Verhältnis größer als 3 ist. Daher zeigen diese Ergebnisse, autophagischen Induktion in MCF7-Zellen durch JCTH-4 und TAM allein und in Kombination mit der größten Reaktion in Zellen mit der Kombination behandelt.

Zusätzliche Video 1. Zellmorphologie von MCF7-Zellen mit Lösungsmittel-Kontrolle behandelt. MCF7-Zellen wurden beobachtet zwischen 48 und 66 Stunden nach der Behandlung Kontrolle Lösungsmittel (DMSO) mit Zeitraffer-Mikroskopie mit Phasenkontrast-Bilder. Die Zellen wurden bei 37 ° C und 5% CO _2. Die Bilder wurden bei 400-facher Vergrößerung aufgenommen. Hier klicken, um Video anzuschauen .

Zusätzliche Video 2. Induktion von Apoptose zelluläre Morphologie in MCF7-Zellen mit JCTH-4 behandelt. MCF7-Zellen wurden zwischen 48 und 66 Stunden nach der Behandlung überwacht Witzh 1 uM JCTH-4 mit Zeitraffer-Mikroskopie mit Phasenkontrast-Bilder. Die Zellen wurden bei 37 ° C und 5% CO _2. Die Bilder wurden bei 400-facher Vergrößerung aufgenommen. Hier klicken, um Video anzuschauen .

Zusätzliche Video 3. Induktion von Autophagie Zellmorphologie in MCF7-Zellen mit TAM behandelt. MCF7-Zellen wurden zwischen 48 und 66 Stunden nach der Behandlung mit 10 uM TAM mit Zeitraffer-Mikroskopie mit Phasenkontrast-Bilder überwacht. Die Zellen wurden bei 37 ° C und 5% CO _2. Die Bilder wurden bei 400-facher Vergrößerung aufgenommen. Hier klicken, um Video anzuschauen .

Zusätzliche Video 4. Verbesserte apoptotische Morphologie von JCTH-4 mit TAM in MCF7-Zellen. MCF7-Zellen wurden beobachtet zwischen 48 und 66 Stunden nach der Behandlung sowohl mit 1 uM JCTH-4 und 10 &mgr; M TAM mit Zeitraffer-Mikroskopie mit PHASE CONTRast Bilder. Die Zellen wurden bei 37 ° C und 5% CO _2. Die Bilder wurden bei 400-facher Vergrößerung aufgenommen. Hier klicken, um Video anzuschauen .

Abbildung 1. Strukturelle Vergleich von PST auf einem synthetischen 7-desoxy-Analogon. (A) Chemische Struktur von Pancratistatin (PST). (B) Chemische Struktur von JC-TH-Acetat-4 (JCTH-4).

Abbildung 2. JCTH-4 induziert nuklearen apoptotische Morphologie mit erhöhter Aktivität mit TAM. Kernmorphologie von (a) MCF7 und (b) SH-SY5Y-Zellen für 72 bzw. 48 Stunden mit den angegebenen Konzentrationen von TAM und JCTH-4 gefärbt mit Hoechst-Farbstoff behandelt. Kontrollgruppen wurden mit Lösungsmittel (D behandeltMSO). Bilder wurden bei 400-facher Vergrößerung auf einem Fluoreszenzmikroskop gemacht. Balken = 15 um.

Abbildung 3. JCTH-4 Ursachen Phospholipide der allein und in Kombination mit TAM selektiv in Krebszellen. Annexin V-Bindung an Phosphatidylserin externalisiert wurde evaluiert, um die Induktion der Apoptose-Induktion in (a) MCF7 (72 Stunden), (b) SH-SY5Y (48 Stunden), und (c) NFF (72 Stunden) Zellen mit JCTH-4 behandelt überprüfen und TAM in den angegebenen Konzentrationen. Kontrollgruppen wurden mit Lösungsmittel (DMSO) behandelt. Bilder wurden bei 400-facher Vergrößerung auf einem Fluoreszenzmikroskop gemacht. Balken = 15 um.

Abbildung 4. TAM steigert Rentabilität Rückgang um JCTH-4 selektiv in Krebszellen. 96-Well-Platten ausgesät with (a) MCF7, (b)-SH-SY5Y, und (c) NFF Zellen und mit JCTH-4 und TAM in den angegebenen Konzentrationen. MCF7 und NFF Zellen wurden für 72 Stunden behandelt und SH-SY5Y wurden für 48 Stunden behandelt. Stellen Sie Behandlung und Inkubation wurde das WST-1-Reagenz in jede Vertiefung gegeben, und einer Extinktion bei 450 nm gemessen und ausgedrückt als Prozentsatz der Kontrolle (DMSO). Statistiken wurden unter Verwendung GraphPad Prism Version 5.0. Die Werte werden als Mittelwert ± Standardabweichung von quadruplicates von 3 unabhängigen Experimenten zum Ausdruck gebracht. MCF7: * p <0,001, ** p <0,0001 im Vergleich zur Kontrollgruppe; # p <0,05 im Vergleich zu 1 uM JCTH-4; † p <0,0001 im Vergleich zu 10 uM TAM. SH-SY5Y: * p <0,0005 im Vergleich zur Kontrollgruppe; # p <0,005 im Vergleich zu 1 uM JCTH-4; † p <0,005 im Vergleich zu 10 uM TAM. NFF: * p <0,005 im Vergleich zu 10 uM TAM + 1 uM JCTH-4 in MCF7-Zellen; # p <0,01 im Vergleich zu 10 uM TAM + 1 uM JCTH-4 in SH-SY5Y-Zellen.

Bild 5. JCTH-4 und TAM wirken auf den Mitochondrien. (A) MCF7-Zellen wurden auf Deckgläsern gezüchtet und mit den angegebenen Konzentrationen von Medikamenten für 72 Stunden und gefärbt mit TMRM MMP bewerten. Die Zellen der Kontrollgruppe wurden mit Lösungsmittel (DMSO) behandelt. Bilder wurden bei 400-facher Vergrößerung an einem Fluoreszenzmikroskop erfasst. Maßstabsbalken = 15 um. (B) isolierter Mitochondrien von SH-SY5Y-Zellen wurden mit JCTH-4 und TAM in den angegebenen Konzentrationen behandelt und ROS-Produktion wurde mit Amplex Red Substrat in Gegenwart von Meerrettich-Peroxidase (HRP) beurteilt. Die Kontrollgruppe Zellen wurden mit Lösungsmittel (DMSO) behandelt. Paraquat (PQ) wurde bei einer Konzentration von 250 pM als positive Kontrolle verwendet. Fluoreszenz Messungen wurden nach 2 Stunden nach der Behandlung zu Ex. erhalten. 560 nm und Em. 590 nm und als relative fluorescence (RFU). Statistiken wurden unter Verwendung GraphPad Prism Version 5.0. Daten sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente mit ähnlichen Trends. Die Werte sind als Mittelwert ± Standardabweichung von quadruplicates von 1 unabhängigen Experiment ausgedrückt. * P <0,05, ** p <0,005, *** p <0,001 im Vergleich zur Kontrollgruppe; # p <0,05 im Vergleich zu 1 uM JCTH-4; † p <0,05 im Vergleich zu 10 uM TAM; @ p <0,05 im Vergleich zu 250 uM PQ.

6. TAM erhöht autophagischen Induktion von JCTH-4. (A) MCF7-Zellen wurden auf Deckgläsern gezüchtet und einer JCTH-4 und TAM Beleidigung in den angegebenen Konzentrationen für 72 Stunden. Kontrollgruppe Zellen wurden mit Lösungsmittel (DMSO) behandelt. Nach der Behandlung wurden MCF7-Zellen mit MDC gefärbt, um autophagischen Vakuolen zu erkennen. Bilder wurden bei 400-facher Vergrößerung an einem Fluoreszenzmikroskop erfasst. Balken = 15 um. (b) Western-Blot-Analysen wurden für LC3 und β-Actin an Zelllysaten von MCF7-Zellen mit den angegebenen Konzentrationen von Medikamenten für 72 Stunden behandelt durchgeführt. Densitometrische Analysen wurden mit der Software ImageJ. Statistiken wurden unter Verwendung GraphPad Prism Version 5.0. Die Werte sind als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt. * P <0,05, ** p <0,005, *** p <0,0005 im Vergleich zur Kontrollgruppe; # p <0,001 vs 1 uM JCTH-4; † p <0,001 vs 10 uM TAM.

Liste der Abkürzungen.

PST und ähnliche Verbindungen wurde gezeigt, eine anti-Krebs-Eigenschaften ^11-15,21. Wir haben zuvor natürlich PST gemeldet, um die Mitochondrien selektiv in Krebszellen destabilisieren, die dadurch induziert Apoptose durch die Freisetzung von Faktoren apoptogene ^12,14. Es ist sehr wahrscheinlich, dass JCTH-4 wirkt über den gleichen Mechanismus; JCTH-4 verursacht MMP Zusammenbruch in MCF7-Zellen als mit TMRM Färbung (Abb. 5a) gesehen, und erhöhte Bildung von ROS in isolierten Mitochondrien von SH-SY5Y-Zellen (Abb. 5b), was auf mitochondriale Dysfunktion. Somit ist die Induktion von Apoptose durch JCTH-4 wahrscheinlich durch mitochondriale Targeting in den Krebszellen.

Zahlreiche Unterschiede zwischen nicht-krebsartigen und Krebszellen, die als Grundlage für Krebs Selektivität JCTH-4 dienen könnte. Krebszellen sind stark abhängig von Glykolyse und weniger auf die Mitochondrien zur Energiegewinnung, wird dieses Phänomen genannt, eins die Warburg-Effekt ^22. Solche metabolischen Aktivität in den Krebszellen führt zu hohen Säuregehalt im Cytosol. Folglich trägt die saure Umgebung cytosolische Krebszelle Mitochondrien Hyperpolarisation, die zu einer verbesserten Fähigkeit zur Invasion und Apoptose ²³ ausweichen in Verbindung gebracht wurde. Hyperpolariztion der Krebszelle Mitochondrien können jedoch Krebszellen anfälliger für JCTH-4 machen, einmal in die Zelle aufgenommen, kann JCTH-4 eine positive Ladung durch enzymatische Verarbeitung zu erwerben und können wahlweise bis zu Krebszelle Mitochondrien aufgrund ihrer hyperpolarisierten Natur entnommen werden. Darüber hinaus haben eine Reihe von Mitochondrien zugehörigen antiapoptotischen Proteinen wurde gezeigt, dass stark in Krebszellen, die Mitochondrienmembran Permeabilisierung und anschließende Ausführung von Apoptose, wie antiapoptotischen Proteinen der Bcl-2-Familie von Proteinen ^24-26 untersagt ausgedrückt werden.

In Gegenwart von verschiedenen Formen von zellulären Stress, wird als Autophagie ausgelöstein pro-Überleben Reaktion, so dass Zellen unter ungünstigen Bedingungen zu überleben ^2. Über Stimulation dieses Weges kann jedoch umfangreiche Abbau von wichtigen intrazellulären Komponenten, die zu autophagischen Zelltod ³ führen. Sowohl die pro-Überleben und die pro-Tod autophagischen Antworten haben zu chemotherapeutischen Beleidigung ³ in Verbindung gebracht. Mitochondriale Dysfunktion durch JCTH-4 führt zu oxidativem Stress auslösen könnten eine automatische Voreinstellung autophagischen Antwort. In der Tat beobachten wir taten etwas autophagischen Induktion zusammen mit Apoptose mit JCTH-4-Behandlung (Abb. 2a, b 3a, b 6a, b). Obwohl TAM wurde sowie eine ER-Antagonist in ER-positiven Brustkrebszellen etabliert hat sich kürzlich gezeigt, dass mit den Mitochondrien, die Bindung an die FMN Website von Komplex I ¹⁰ zu interagieren. Darüber hinaus ist TAM ein bekannter Induktor der Autophagie in vielen Arten von Krebszellen ^3. Tatsächlich tat TAM zu einem Anstieg der ROS-Generation in isolierten mitochondria (Abb. 5b). Allerdings erwies sich diese Interaktion nicht ausreichen, um MMP Kollaps (Abb. 5a), aber ausreichend, um eine typische Pro-Überleben autophagischen Antwort induzieren verursachen. Umfangreiche autophagischen Induktion wurde beobachtet, wenn JCTH-4 und TAM wurden in Kombination (Abb. 6a, b) verwendet, was durch eine verstärkte zytotoxische Reaktion (Abb. 4a, b), was auf eine pro-Tod autophagischen Reaktion begleitet, trotzdem die Krebszellen sterben schließlich ab Apoptose als Folge der mitochondrialen Permeabilisierung und apoptogene Faktor Release. Eine solche Sensibilisierung durch TAM auf JCTH-4 Beleidigung kann zum Anstieg der ROS-Generation von TAM zugeschrieben werden. Da sowohl TAM und JCTH-4 in der Lage, oxidativem Stress zu erzeugen sind, kann der kombinatorischen Herstellung solcher Stress mit beiden Verbindungen zu umfangreichen autophagischen Induktion was zu einer nachteiligen Reaktion autophagischen und / oder umfangreiche mitochondriale Permeabilisierung und anschließender Apoptose führen. Thist eine kombinierte Behandlung hat keinen Einfluss auf die Lebensfähigkeit von noncancerous Fibroblasten (Abb. 4c). Diese Ergebnisse zeigen, dass JCTH-4 allein oder in Kombination mit TAM effizient eingesetzt werden kann, um Brustkrebs und Neuroblastom ohne nachteilige Auswirkungen auf nicht-krebsartigen Zellen zu behandeln.