Imagerie des cellules vivantes des cellules exprimant des protéines par fluorescence Migration-étiquetés dans une matrice tridimensionnelle

1. Génération d'une lignée cellulaire stable (par exemple des cellules MDCK)

1. Cellules de la plaque à 80-90% de confluence dans un plat à p35. Ne laissez pas les cellules sous forme de 100% monocouche confluente, ce qui réduira l'efficacité de la transfection.
2. Transfecter les cellules avec le plasmide d'intérêt en utilisant Lipofectamine 2000. Optimiser les conditions de transfection utilisant le protocole du fabricant.
3. Le lendemain, le passage des cellules dans deux boîtes de Pétri p150. Le grand plat est recommandé pour permettre à l'espacement suffisant entre les colonies stables.
4. Le lendemain, changer les médias et ajouter 500 pg / ml de G418 à chaque plat. La concentration du G418 devrait être optimisé pour les lignées de cellules individuelles.
5. Changer les médias chaque jour pendant environ 2 semaines. Après 2 semaines, G418 colonies résistantes devraient commencer à se former, et sera visible à l'œil nu.
6. En utilisant un microscope inversé fluorescentes, identifier les colonies GFP-positives. Marquer ces colonies sur la plaque à l'aide d'un stylo Sharpie.
7. Pour sélectivement trypsiniser les colonies de la plaque de culture de tissus, aspirer à la presse, et laver les cellules deux fois avec du PBS ou solution de trypsine. Sur le second lavage, ne pas aspirer à toute la solution. Laisser une mince couche de liquide sur le fond de l'assiette pour empêcher les cellules de séchage.
8. Pour chaque colonie a marqué: utilisez un coton-tige stérile pour essuyer le plus proche possible sur le pourtour de la colonie. Cela va créer une île de la zone humide contenant de la colonie de cellules. Pipeter 10 pl de la trypsine sur la colonie. Répétez l'opération pour chaque colonie, et de procéder rapidement pour éviter le séchage. Un chercheur expérimenté peut généralement prendre ~ 12 colonies par p150 assiette.
9. Incuber la plaque à 37 ° C pendant 5-10 minutes jusqu'à ce cellules se détachent de la plaque et paraître rond.
10. Pour chaque colonie: pipette 10 ul de la trypsine sur la colonie, et la pipette monter et descendre une ou deux fois pour détacher les cellules de la plaque. Puis la pipette toutes les cellules de la colonie en un seul puits dans un plat à 24 puits.
<li> Après colonies stables ont augmenté, l'expression des protéines de chaque colonie est analysée en utilisant la norme western blot et immunofluorescence. Développer ces lignées de cellules pour une analyse ultérieure.

2. Modification de la surface du plat à fond de verre pour la liaison de collagène optimale (facultatif)

1. Pour silaniser le verre, pipette 300 pi de 2% 3-aminopropyltriméthoxysilane solution sur la partie vitrée de chaque plat p35 avec une ouverture de 10 mm. Voir Figure 1 pour la silanisation et réticulation schématique. 3-aminopropyltriméthoxysilane est dilué dans de l'eau filtrée.
2. Incuber pendant 1 heure à température ambiante.
3. Aspirer la solution 3-aminopropyltriméthoxysilane et laver avec de l'eau filtrée trois fois pour 10 minutes chacune.
4. Aspirer les plats d'eau et placer sur une plaque chaude réglé à 50 ° C pendant 1,5 heures. Lieu de sommets plats légèrement du plat afin que l'humidité dans le plat ne peut échapper.
5. Retirez les plats du feu et laisser à gazouillerl.
6. Pipeter 300 pi de solution de glutaraldéhyde à 2% sur la partie en verre de chaque plat. Le glutaraldéhyde est dilué dans du PBS.
7. Incuber pendant 1 heure.
8. Aspirer la solution de glutaraldéhyde et laver la vaisselle avec du PBS à trois reprises pendant 10 minutes chacun.
9. Stériliser les plats par une exposition aux rayons UV pendant 1 heure. Les plats silanisé peut être conservée à température ambiante.

3. Préparation du gel de collagène 3D avec des particules traceurs

1. Laver les particules traceur fluorescent en faisant tourner en baisse de 100 ul de particules traceurs de stock ⁽¹⁰ 10 particules / ml) dans une centrifugeuse à 15 000 rpm pendant 5 minutes, aspirer le liquide, et ajouter 500 ul de médias. Répéter 5 fois. Après dernier lavage, les particules de remettre en suspension dans 30 pl de médias.
2. Trypsiniser cellules GFP exprimer comme d'habitude.
3. Resuspendre le culot cellulaire d'environ 2 x 10 ⁶ cellules / ml.
4. Pipeter 240 ul de milieu de croissance dans un tube Eppendorf.
5. Ajouter 12,6 ul d'HEPES 1M, 20 pl d'eau filtrée, 50 pl de solution de la cellule, puis 10 ul de particules fluorescentes.
6. Enfin, ajouter 167 l de collagène du derme bovin J'ai solution (pour obtenir une concentration de travail de 1 mg / ml).
7. Mélanger une solution à fond, puis la pipette 80 ul de la solution sur la partie en verre du plat à fond de verre silanisé.
8. Vaisselle Placer dans l'incubateur et permettre au gel de polymériser à 37 ° C pendant 30 minutes. Voir Figure 1A pour le gel de collagène dans un plat typique de p35 à fond de verre.
9. Ajouter 2 ml de milieu de croissance avec soin pour chaque plat.

4. Procédure à suivre pour l'acquisition d'image time-lapse

1. Allumez le contrôle de la température de l'enceinte de microscope et de laisser la chambre de la portée s'équilibrer à une température état d'équilibre à 37 ° C. Voir Figure 2 pour un exemple de système d'imagerie des cellules vivantes.
2. Changer les médias aux nouveaux médias complété avec 25 mM de HEPES à maintenir un pH neutre. PourDIC imagerie, de l'échange au sommet de la parabole avec un qui a un dessus en verre. En utilisant une mince bande de parafilm, couvrir le côté du plat pour éviter l'évaporation des médias.
3. Pour un objectif à immersion d'huile, déposer une goutte de liquide d'immersion sur l'objectif.
4. Placer le gel de collagène contenant plat sur la platine du microscope, et assurez le plat en contact avec le liquide d'immersion.
5. Axer la recherche d'échantillon et les cellules d'intérêt pour l'image. Pour minimiser la dérive scène, permettent de régler plat pendant environ 45 minutes avant de commencer une capture longtemps.
6. Spécifiez les paramètres d'acquisition des images. Minimiser l'exposition au laser, ce qui pourrait endommager les cellules, en modulant la puissance du laser, le temps d'exposition, la fréquence et la durée du temps de capture. Les paramètres réels varient avec le système de microscope et le type de cellule.
7. Lors de l'acquisition time-lapse, un inhibiteur peut être ajouté. Pour l'expérience de plus inhibiteur, ne pas sceller le plat avec du parafilm.
   1. Préparationsont complétées Hepes médias avec la drogue, à une concentration de travail désirée.
   2. Lorsque vous êtes prêt à ajouter des médicaments aux médias, mettre en pause la capture d'image, et enlever soigneusement le dessus plat sans déranger le plat.
   3. Aspirer à la presse dans le plat, et une pipette contenant le médicament des médias dans le plat. Puis, soigneusement remplacer le dessus plat.
   4. L'échantillon peut être hors-de-foyer à cause de l'ajout de nouveaux médias, réajuster la mise au point.
   5. Redémarrez la capture, puis de surveiller les captures pour les 30 prochaines minutes, et réajuster la mise au point si nécessaire. Voir Figure 4 pour un exemple de l'expérience de plus de drogue.

5. Procédure de FRAP et de l'analyse

1. La configuration du PAF varie entre les systèmes, suivre les instructions du fabricant.
2. Mettre en place des paramètres pour imagerie des cellules vivantes.
3. Mettre en place des paramètres pour photoblanchiment. Utilisez la puissance du laser suffit à photobleach le signal fluorescent sans endommager les cellules. Testez ces nominaleameters sur les cellules pratique.
4. Démarrer la capture d'image, et attendre au moins 5 images de la capture d'image avant photoblanchiment la région d'intérêt.
5. Continuer la capture, et le temps de récupération devrait être suffisant pour capturer le plein rétablissement de fluorescence. Voir Figure 5 pour un exemple de l'expérience de FRAP.
6. Analyser la récupération de fluorescence en mesurant l'intensité moyenne de fluorescence de la zone photobleached (avant et après photoblanchiment) au cours du temps. L'utilisation d'un logiciel d'analyse statistique (Excel par exemple), l'ajustement de la courbe de récupération de l'équation exponentielle: I = _f ^(1-e-kt), où I est l'intensité, je _f est l'intensité finale, t le temps, et τ _½ est le temps qu'il faut pour l'intensité pour atteindre la moitié de la valeur finale: τ _½ = ln (2) / k. La mi-temps est une mesure du taux de mobilité de la protéine.
7. Obtenir les paramètres, à mi-temps et l'intensité finale de la courbe exponentielle ajustement. Calculer ee fraction mobile en prenant le rapport de la finale à la première intensités de fluorescence.

6. Les résultats représentatifs

Un exemple de l'imagerie des cellules vivantes des cellules épithéliales saines au sein de la matrice est montré dans la figure 3. Les cellules saines présentent une surface lisse, membrane continue, et noyau distinct, tandis que les cellules malsaines ont souvent une membrane perturbé, et un nombre excessif de vacuoles. Dans une matrice 3D, seule la migration des cellules épithéliales ^1, et au cours de plusieurs jours, les cellules épithéliales forme tridimensionnelle, sphérique, multi-cellulaire des kystes au sein de la matrice ^2. Les cellules sont également très dynamiques, et de migrer dans le kyste (figure 3). La déformation de matrice à la suite des forces de traction exercée par les cellules migrent sont analysées par le déplacement de particules traçantes noyées dans la matrice environnante (figure 4). Les mouvements des particules traceurs sont affichés comme une image de projection maximale de varierpoints de temps différentes, et chaque moment est une pseudo-couleur pour indiquer le temps (figure 4B). Sinon, les images d'une particule traceur individuels sont affichées comme un montage pour montrer le mouvement de la particule traceur au cours du temps (figure 4C). Toutes analyse d'image a été réalisée en utilisant ImageJ. Ces évaluations qualitatives de la déformation matrice, et donc les forces exercées par les cellules migrent, sont utiles en première approximation de la répartition de la force de traction. L'estimation quantitative des forces de traction exercée par les cellules migrent en 3D est au-delà de la portée de ce protocole et est décrit ailleurs ^3,4.

Une reprise typique de fluorescence après photoblanchiment expérience est montré dans la figure 5. La région d'intérêt doivent être photobleached utilisant des paramètres laser optimisés de sorte que l'intensité de fluorescence est visiblement diminué par rapport aux niveaux de fond (pour maximiser signal-bruit), tout en préservant les cellules saines et en bon état. Le réglage optimal doit be déterminée empiriquement que chaque configuration est différente FRAP (par exemple, le FRAP en utilisant le système de balayage laser confocal).

L'exposition et intervalle de temps d'acquisition des images post-FRAP doit être soigneusement contrôlée pour éviter photoblanchiment fond. L'utilisation de faible puissance laser, temps d'exposition court, et l'utilisation de la caméra sensible et optique haute efficacité sont essentiels pour une qualité d'image haute FRAP. Si la fluorescence de blanchiment lors de l'acquisition d'image est importante, ce fondu de fond doivent être quantifiés et normalisés de la reprise de l'intensité de fluorescence observée. En raison de la nature 3D de l'environnement, la composante z de la reprise d'intensité de fluorescence peuvent devenir importants. Par conséquent, il est important de définir un volume photobleached en prenant pré-et post-stack images 3D de la région de photobleached. Une analyse plus poussée et la modélisation de la récupération de fluorescence est discutée ailleurs ^5,6.

La combinaison unique d'imagerie des cellules vivantes techniques: GFP de suivre la dynamique des protéines du cytosquelette, la fluorescence rouge particules traceur pour surveiller la déformation de matrice, et l'addition d'inhibiteurs, peuvent être utilisés simultanément pour l'analyse de la dynamique des protéines, la force de traction et de voies moléculaires.

Figure 1. Préparation du gel de collagène. A) la matrice de collagène polymérisé sur un plat à fond de verre. La couleur rose du gel est due à des particules fluorescentes intégré. B) Procédure pour traiter les plats à fond de verre pour réticuler le gel de collagène à la surface du verre. Tout d'abord, le plat à fond de verre est traitée avec 3-aminopropyltriméthoxysilane solution, une solution de glutaraldéhyde alors que la matrice de collagène réticule sur le verre.

Figure 2. Schéma de configuration microscope confocal / FRAP. Le confocalemicroscope est basé sur un AxioObserver Zeiss avec une caméra CCD Coolsnap HQ II et complètement automatisé par Slidebook logiciels (Intelligent innovations en imagerie). L'unité est conçue sur mesure confocale et basé sur l'unité Yokogawa disque rotatif CSU10 et deux lasers à état solide (488 nm à 50 mW et 561 nm avec 40 mW) avec acousto-optique à filtre accordable (AOTF) pour permettre la commutation entre deux millisecondes lasers. Les filtres d'émission sont nm 525/50 et 620/60 nm (# 118661 et # 118085, technologie Chroma) et miroir dichroïque est Brightline 488-568 bi-bande (Semrock). Les objectifs sont une longue distance de travail 40x C-Apochromat objectif avec NA 1.1 et distance de travail de 0,62 mm, et un 63x Plan-Apochromat objectif avec NA 1,4 et une distance de travail de 0,19 mm. Le microscope comprend également un système de photoablation FRAP qui se compose d'une fibre laser à colorant pompé optiquement, une position du faisceau contrôlé par ordinateur et d'intensité, et une taille de tache de diffraction limitée. Par ailleurs, le microscope est équipéune platine XY motorisée, qui comprend 0,1 microns encodeurs linéaires sur chaque axe. Au cours de l'imagerie time-lapse, la température ambiante est maintenue par une chambre du microscope conçu sur mesure et un appareil de chauffage avec un contrôle de température retour. Pour isoler le bruit et les vibrations, le système de microscope entier est sur une table de vibrations.

Figure 3. Direct imagerie cellulaire de cellules épithéliales exprimant la GFP-actine. Ces cellules forment un kyste au bout de 4 jours de culture dans une matrice de collagène 3D. Certaines cellules se déplacent le long de la surface du kyste (flèche jaune), tandis que d'autres migrent à l'intérieur de kystes (rouge pointe de flèche). La barre d'échelle 10 microns, le temps en heures.

Figure 4. L'effet de l'inhibition de la Rho-kinase sur la force de traction. A) l'image DIC d'une cellule de migration MDCK exprimant GFP taggés marqueur nucléaire. L'image a été prise immédiatement avant le traitement de l'inhibiteur de la Rho-kinase Y-27632. La barre d'échelle 10 microns. B) Le déplacement des particules résultant de l'addition de Y-27632. Les positions des particules à différents temps (0 - 52 min) ont été pseudo-colorée en fonction de l'échelle d'intensité, puis projetée sur une seule image. La zone blanche est le noyau GFP-positives dans les cellules en migration. La barre d'échelle 10 microns. Temps en minutes. C) Le mouvement des particules sur le bord de fuite de la cellule (voir flèche en B). Astérisque indique la dernière image capturée avant Y-27632 plus. La particule traceur déplacé vers et loin du bord de fuite de la cellule migration avant et après l'ajout de Y-27632, respectivement. Échelle barre de 1 um.

Figure 5. Analyse du PAF de GFP-actine exprimer la migration de cellules dans une matrice tridimensionnelle. Images Timelapse A) de la GFPactine cellule exprimant des avant et après le photoblanchiment. Une petite région de la GFP-actine accumulée à l'arrière des cellules a été photobleached (rouge pointe de flèche) au point de temps 0. Temps en secondes, barre d'échelle 5 um. B) L'intensité moyenne de fluorescence de la région photobleached (ligne continue), et l'ajustement exponentiel de la reprise de fluorescence (cercles) en fonction au cours du temps. L'intensité de fluorescence a été normalisée à la valeur initiale avant photoblanchiment.

Nous décrivons ici une méthode pour utiliser imagerie des cellules vivantes pour étudier les mécanismes de la migration de cellules dans une matrice tridimensionnelle. Le succès de cette technique dépend de l'obtention de "bons" clones exprimant de façon stable la GFP-tagged protéines. Le faible niveau de protéines GFP, il faudra une exposition d'excitation en excès qui compromet la santé des cellules, alors que le niveau trop élevé GFP aura des effets secondaires indésirables sur la cellule. Ainsi, le choix vecteurs pour transfecter des gènes dans les cellules est important (par exemple, le promoteur, l'étiquette de fluorescence, etc.) Il ya beaucoup de balises fluorescentes autres que la GFP, dont les protéines fluorescentes rouges (RFP) ^7,8. Ces balises protéines spécifiques nécessitent longueur d'onde lumineuse d'excitation, et définit donc différent de filtres de fluorescence. En outre, les différents gènes résistants aux antibiotiques (par exemple, G418, hygromycine, puromycine, etc) sont également disponibles et peuvent être utilisés pour générer des clones stables.

Pour imagerie des cellules vivantes, les cellules transfectées transitoirement cune également être utilisés. Bien que cela minimise le temps et l'effort requis pour développer une lignée cellulaire stable, les cellules transfectées de façon transitoire sont généralement malsain, et donc moins fiable pour une utilisation dans des expériences. En outre, la population de cellules transfectées de façon transitoire est un mélange hétérogène d'exprimer et non les cellules exprimant, et les cellules exprimant perdra l'expression des protéines fluorescentes dans le temps. En comparaison, les cellules exprimant de façon stable sont généralement cloné à partir d'une seule colonie de cellules et d'expression des protéines doit être stable et homogène, bien que le niveau d'expression sera plus faible que dans les cellules exprimant de manière transitoire. Depuis la colonie de cellules stables est susceptible de provenir d'une seule cellule, il est important de choisir des colonies qui ont une morphologie et un comportement semblable à la normale, les cellules non transfectées, pour éviter de phénotypes qui sont spécifiques à cette clone (sauf si le plasmide est transfecté conçus pour perturber la morphologie cellulaire). Colonies multiples devraient être utilisés pour l'exriences pour éviter phénotypes due à la variation clonale. Alternativement, la transfection virale ou électroporation peut être utilisée pour introduire des gènes d'intérêt. Cette transfection virale est particulièrement utile pour les cellules difficiles à transfecter ou des cellules primaires (voir les protocoles détaillés des techniques de transfection d'autres décrits ailleurs dans ce journal).

La partie la plus délicate de cette procédure est sous-clonage. Clones stables peuvent être ramassés en utilisant la méthode décrite ici coton tige, ou alternativement, à l'aide d'un anneau de clonage. Une autre méthode pour sélectionner la GFP-positives est d'utiliser les cellules FACS. FACS sélectionne les cellules basées uniquement sur l'ampleur de l'intensité de fluorescence. En comparaison, en utilisant la méthode de clonage décrite ici, l'utilisateur peut visuellement identifier non seulement le niveau d'expression de GFP et mais aussi sa localisation cellulaire en utilisant un microscope. En outre, le clonage en utilisant FACS entraîne généralement une population plus hétérogène de cellules. Cellules Pour surmonter ce problème, FACS peuvent être triésplaquées directement dans 96 plats bien, de sorte que chaque puits contient une seule cellule. Colonies provenant de cellules unique devrait être une population homogène.

La méthode utilisée pour fixer la matrice de collagène pour le plat à fond de verre (figure 1) est essentiel pour imagerie des cellules vivantes et les cellules en culture dans un gel pour une période de temps prolongée. La première étape pour fixer la matrice du verre est la formation d'une monocouche de silane. Le défaut de silane de déposer dans une monocouche se traduit souvent par un détachement matrice de collagène de la vitre. C'est parce que les cellules intégrées dans la matrice exercent des forces de traction contractiles, et causer la matrice de rétrécir, augmentant ainsi la probabilité de détachement de matrice de l'antenne. Par conséquent, le traitement silane / glutaraldéhyde de l'antenne est essentielle pour le maintien de l'attachement de gel pour le plat. Notez que les conditions de montage du collagène (la concentration, du temps et du pH) peuvent avoir besoin d'être optimisé pour le collagène de type différent et par lots. DansDe plus, le protocole peut être utilisé avec différents types de collagène ou d'autres gels 3D tels que Matrigel ou fibroblastes dérivés matrice ^9.

Bien que de nombreuses cellules ne montrent pas d'effets néfastes en réponse à tampon HEPES, certaines cellules sont plus capricieux. Pour maintenir la santé cellulaire au cours de time-lapse d'acquisition, _un incubateur à CO2 peuvent être ajoutés pour contrôler le pH dans l'enceinte du microscope. En outre, l'exposition au laser pour les cellules doit être minimisé. Si la fluorescence émise par les cellules est trop faible, la fluorescence peut être collectée plus efficacement en utilisant une caméra plus sensible, ou un meilleur objectif, ou un ensemble plus efficace de filtre, la morphologie cellulaire etc dans l'enceinte de microscope doit être comparée à sa morphologie dans l'incubateur à CO ₂ pour s'assurer que les cellules sont saines et de se comporter normalement. Puisque cette méthode décrit des dosages seule cellule basée, une certaine variation de cellule à cellule est attendue. Par conséquent, répéter des expériences et des données quantification est essentielle.