Live-cell imaging at migrere celler, der udtrykker fluorescens-mærkede Proteiner i en tre-dimensionel Matrix

1. Generering af stabile cellelinje (f.eks MDCK celler)

1. Plate celler på 80-90% confluency i en P35 fad. Lad ikke celler danner 100% sammenflydende monolag, hvilket vil reducere transfektion effektivitet.
2. Transfect cellerne med plasmidet af interesse ved hjælp af Lipofectamine 2000. Optimer transfektion betingelser ved hjælp af producentens protokol.
3. Næste dag, passage cellerne i to P150 petriskåle. Det store fad anbefales at give tilstrækkelig afstand mellem den stabile kolonier.
4. Næste dag, ændre medierne og tilsættes 500 mg / ml G418 til hvert fad. Den G418 koncentration bør være optimeret til de enkelte cellelinjer.
5. Skift medier hver anden dag i ca 2 uger. Efter 2 uger, bør G418-resistente kolonier begynder at danne, og vil være synlig med det blotte øje.
6. Ved hjælp af en omvendt fluorescerende mikroskop, identificere GFP positive kolonier. Mark disse kolonier på pladen ved hjælp af en Sharpie pen.
7. Til Selektivt trypsinize kolonierne fra vævskultur pladen, aspireres mediet ud, og vask de celler to gange med PBS eller trypsin løsning. På den anden vask, Aspirér ikke ud hele opløsningen. Efterlader et tyndt lag væske på bunden af ​​pladen for at forhindre cellerne i at tørre.
8. For hver mærket koloni: brug en steriliseret vatpind til at fjerne så tæt som muligt rundt i kanten af ​​kolonien. Dette vil skabe en ø af vådt område, der indeholder cellen koloni. Afpipetteres 10 μl af trypsin på koloni. Gentag for hver koloni, og gå hurtigt for at undgå udtørring. En erfaren forsker kan normalt vælge ~ 12 kolonier pr P150 plade.
9. Inkubér pladen ved 37 ° C i 5-10 minutter, indtil cellerne løsnes fra pladen og vises rundt.
10. For hver koloni: afpipetteres 10 μl af trypsin på koloni, og pipette op og ned et par gange for at løsne celler fra pladen. Så pipette alle celler fra kolonien til et enkelt godt i en 24 godt fad.
<li> Efter stabilt kolonier er vokset, er protein udtryk for hver koloni analyseres ved hjælp af standard Western Blot og immunofluorescens. Udvid disse cellelinjer til yderligere analyse.

2. Overfladebehandling af glas nederste skaal for optimal kollagen bindende (valgfrit)

1. For at silanize glasset, pipette 300 μl på 2% 3-Aminopropyltrimethoxysilane løsning på glasset del af hver P35 fad med en 10 mm åbning. Se figur 1 for silanization og krydsbinding skematisk. 3-Aminopropyltrimethoxysilane fortyndes i filtreret vand.
2. Inkuber 1 time ved stuetemperatur.
3. Aspirer den 3-Aminopropyltrimethoxysilane løsning og vaskes med filtreret vand tre gange i 10 minutter hver.
4. Aspirer vandet ud og placer retter på varmeplade indstillet til 50 ° C i 1,5 timer. Læg toppe af retter lidt væk fra fadet, så fugt i fadet kan undslippe.
5. Fjern retter fra varmen og lad det kølel.
6. Pipette 300 μl på 2% glutaraldehyd løsning på glasset del af hver tallerken. Den glutaraldehyd fortyndes i PBS.
7. Inkubér i 1 time.
8. Aspirer ud glutaraldehyd løsning og vaske op med PBS tre gange i 10 minutter hver.
9. Steriliseres retter ved udsættelse for UV-lys i 1 time. Det silaniseres retter kan opbevares ved stuetemperatur.

3. Udarbejdelse af 3D-kollagen gel med sporstof partikler

1. Vask fluorescerende sporstof partikler ved at dreje ned 100 μl af materiel sporstof partikler ⁽¹⁰ 10 partikler / ml) i en centrifugeres ved 15.000 rpm i 5 minutter, aspirat ud væske, og der tilsaettes 500 μl af medier. Gentag 5 gange. Efter sidste vask. Resuspender partikler i 30 μl af medier
2. Trypsinize GFP udtrykke celler som sædvanlig.
3. Resuspender cellepelleten til ca 2 x 10 ⁶ celler / ml.
4. Pipette 240 μl af vækstmedier i et eppendorfrør.
5. Tilsæt 12,6 μl af 1M HEPES, 20 μl af filtreret vand, 50 μl af cellernes løsning, derefter 10 μl af fluorescerende partikler.
6. Til sidst tilsættes 167 μl af kvæg dermis Collagen I-løsning (for at få en fungerende koncentration på 1 mg / ml).
7. Bland opløsningen grundigt, så pipette 80 μl af opløsningen på glasset del af silaniseres glasbund fad.
8. Placer fadet i kuvøse og lad gelen til at polymerisere ved 37 ° C i 30 minutter. Se figur 1A for typiske kollagen gel i en P35 glasbund fad.
9. Tilsæt 2 ml vækstmedier omhyggeligt til hver ret.

4. Procedure for time-lapse billedoptagelse

1. Tænd for temperaturkontrol af mikroskopet kabinettet og lad omfanget kammeret afbalancere til en steady state temperaturen til 37 ° C. Se figur 2 for et eksempel på live-cell imaging system.
2. Skift medier til de nye medier suppleret med 25 mM HEPES at opretholde en neutral pH. ForDIC billedbehandling, udveksling toppen af ​​skålen med en, der har en glasplade. Ved hjælp af en tynd strimmel af parafilm, den side af skålen dække for at forhindre medierne fordampning.
3. For en olieimmersion mål, placere en dråbe fordybelse væske på målsætningen.
4. Placer kollagen gel indeholder parabol på mikroskop scenen, og sørg for fadet får kontakt med fordybelse væske.
5. Fokus prøven og søge efter celler af interesse til billede. For at minimere fase afdrift, lad parabol at slå sig ned i ca 45 minutter før du starter en lang capture.
6. Angiv parametre billedet erhvervelse. Minimer laser eksponering, som kan beskadige celler, ved at modulere lasereffekten, eksponeringstid, hyppighed og varighed af fange tid. De faktiske parametre vil variere med mikroskop system og celletype.
7. I løbet af time-lapse virksomhedsovertagelse, kan en inhibitor blive tilføjet. For de hæmmer desuden eksperimentet, ikke forsegling fadet med parafilm.
   1. Preper HEPES suppleret medier med stoffet ved en ønsket brugskoncentration.
   2. Når du er klar til at tilføje lægemidlet til medierne, pause image capture, og fjern forsigtigt fadet toppen uden at forstyrre fadet.
   3. Aspirer mediet ud i skålen, og pipette lægemidlet indeholder medier i fadet. Derefter forsigtigt erstatte fadet toppen.
   4. Prøven kan være ude af fokus som følge af tilsætning af nye medier, justere fokus.
   5. Genstart indfangning, så overvåger fange de næste 30 minutter, og justere fokus som det er nødvendigt. Se figur 4 for et eksempel af narkotika Desuden eksperiment.

5. FRAP procedure og analyse

1. Den FRAP setup varierer mellem systemer, producentens anvisninger følges.
2. Opsætning af parametre for live-cell imaging.
3. Opsætning af parametre for fotoblegning. Brug tilstrækkelig laser magt til photobleach det fluorescerende signal uden at beskadige cellen. Teste disse parameters på praksis celler.
4. Start billedoptagelse, og giver mindst 5 billeder af billedoptagelse før fotoblegning regionen interesse.
5. Fortsæt med at fange, og recovery tid bør være tilstrækkeligt til at indfange hele fluorescens opsving. Se figur 5 for et eksempel på FRAP eksperiment.
6. Analyser fluorescens opsving ved at måle den gennemsnitlige fluorescerende intensiteten af ​​Lysblegede område (før og efter fotoblegning) over tid. Ved hjælp af en statistisk analyse software (fx Excel), passer inddrivelsen kurven til den eksponentielle ligning: I = I _f ^(1-e-kt), hvor jeg er den intensitet, jeg _f er den sidste intensitet, t er tid, og τ _½ er den tid det tager for intensiteten for at nå halvdelen af den endelige værdi: τ _½ = ln (2) / k. Den halve tid er et mål for graden af ​​mobilitet af proteinet.
7. Anskaf de parametre, på halv tid og endelig intensiteten fra den eksponentielle-fit kurve. Beregn the mobile fraktion ved at tage forholdet mellem den endelige til indledende fluorescens intensitet.

6. Repræsentative resultater

Et eksempel på live-cell imaging af raske epitelceller i matrix er vist i figur 3. Raske celler udviser en jævn, kontinuerlig membran, og forskellige kerne, mens usunde celler har ofte en forstyrret membran, og et uforholdsmæssigt stort antal vacuoles. I en 3D-matrix, migrere enkelt epitelceller ^1, og i løbet af flere dage, form epitelceller tre-dimensionelle, kugleformede, flercellede cyster i Matrix ^2. Cellerne er også meget dynamisk, og migrere inden for cyste (Figur 3). Matricen deformation som følge af den trækkraft kræfter ved at migrere celler er analyseret via fortrængning af sporstof partikler er indlejret i det omgivende matrix (Figur 4). Af røbestoffet partikel bevægelser vises som et maksimum projektion billede af forskelligeskellige tidspunkter, og hver gang punkt er pseudo-farvet for at angive den tid (figur 4B). Alternativt, er de billeder af en individuel sporstof partikel vises som en montage for at vise bevægelsen af ​​sporstof partikel over tid (figur 4C). Alle billede analyse blev udført ved hjælp af ImageJ. Disse kvalitative vurderinger af matrix deformation, og derfor de kræfter, der udøves af vandrende celler, er nyttige første tilnærmelse af trækkraft distribution. Den kvantitative estimering af trækkraft kræfter ved at migrere celler i 3D er uden for rammerne af denne protokol og er beskrevet andetsteds ^3,4.

En typisk fluorescens bedring efter fotoblegning eksperiment er vist i figur 5. Regionen interesse skal være Lysblegede hjælp optimeres laser indstillingerne, således at fluorescensintensitet er synligt indskrænket i forhold til baggrunds-niveauer (for at maksimere signal-støj-ratio), samtidig med at opretholde en sund og ubeskadiget celler. Den optimale indstilling skal be bestemmes empirisk som hver FRAP setup er anderledes (f.eks FRAP ved hjælp af laser-scanning konfokal system).

Eksponeringen og tidsinterval af post-FRAP Image Acquisition skal nøje kontrolleret for at undgå baggrund fotoblegning. Brugen af ​​lavere lasereffekten, korte eksponeringstid, og brugen af ​​følsomme kamera og højeffektive optik er afgørende for høj kvalitet FRAP billeddannelse. Hvis fluorescens blegning under billedet erhvervelsen er væsentlig, skal denne baggrund fading kvantificeres og normaliseret fra de observerede fluorescensintensitet opsving. På grund af 3D karakteren af ​​miljøet, kan z-komponent i fluorescensintensitet opsving bliver betydelig. Derfor er det vigtigt at definere en Lysblegede volumen ved at tage før og efter 3D-stak billeder af Lysblegede regionen. Yderligere analyser og modellering af fluorescens opsving er omtalt andetsteds ^5,6.

Den unikke kombination af live-cell imaging techniques: GFP til at følge dynamikken i cytoskeletal proteiner, rød fluorescens sporstof partikler til at overvåge matrix deformation, og tilføjelsen af ​​inhibitorer, der kan bruges samtidig til analyse af protein dynamik, trækkraft og molekylær veje.

Figur 1. Forberedelse af kollagen gel. A) polymeriseret Kollagenmatrix'en på et glas-bund fad. Den lyserøde farve gelen skyldes indlejret fluorescerende partikler. B) Procedure for behandling af glasbund retter til krydsbindinger kollagen gel til glasoverfladen. For det første er glasbund fadet behandlet med 3-Aminopropyltrimethoxysilane løsning, da glutaraldehyd løsning, der krydsbindinger Kollagenmatrix'en til glasset.

Figur 2. Schematics af konfokal / FRAP mikroskop setup. Den konfokalemikroskopet er baseret på en Zeiss AxioObserver med en CoolSnap HQ II CCD kamera og helt automatisk ved Slidebook software (Intelligent Imaging Innovations). Den konfokal Enheden er specialdesignede og baseret på Yokogawa spinning disk enhed CSU10 og to solid state-lasere (488 nm med 50 mW og 561 nm med 40 mW) med Acousto-optisk Afstemmelige Filter (AOTF) at tillade millisekunder skifte mellem to lasere. Emissionen filtre er 525/50 nm og 620/60 nm (# 118661 og # 118085, Chroma teknologi) og dichroic spejlet er 488-568 BrightLine Dual band (Semrock). Målene er en lang arbejdsdag afstand 40x C-Apochromat mål med NA 1,1 og arbejder afstand på 0,62 mm, og en 63x Plan-Apochromat mål med NA 1,4 og en arbejdsgruppe afstand på 0,19 mm. Mikroskopet også en FRAP photoablation system, der består af en fiber optisk pumpet dye laser, en computerstyret stråle position og intensitet, og en diffraktion begrænset spot størrelse. Desuden er mikroskop udstyret medet xy-motoriseret etape, der omfatter 0,1 mikron længdemålesystemer på hver akse. I løbet af time-lapse billeddannelse, er de miljømæssige temperaturen vedligeholdes af en special designet mikroskop kammer og en radiator med en feedback temperaturkontrol. At isolere eventuelle støj og vibrationer, hele mikroskop systemet er på en vibrationsfri bordet.

Figur 3. Live cell imaging af epitelceller udtrykker GFP-aktin. Disse celler dannes en cyste efter 4 dage med kultur i en 3D-collagen matrix. Nogle celler bevæger sig langs overfladen af ​​cyste (gul pilespids), mens andre vandrer i det indre af cyste (rød pilespids). Skala bar 10 ìm, i timer.

Figur 4. Effekten af Rho-kinase hæmning på trækkraft. A) DIC billede af en vandrende MDCK cellen, som udtrykker GFP tagged nukleare markør. Billedet blev taget umiddelbart før behandlingen af ​​Rho-kinase inhibitor Y-27632. Skala bar 10 ìm. B) Partikel forskydning fra tilsætning af Y-27632. Partiklen positioner på forskellige tidspunkter (0 - 52 min) var pseudo-farvede i henhold til den intensitet skala, så projiceret op på et enkelt billede. Den hvide region er den GFP positive kerne i de vandrende celler. Skala bar 10 ìm. Tid i minutter. C) partikel bevægelse på bagkanten af ​​cellen (se pil i B). Asterisk angiver det sidste billede taget til fange, før Y-27632 tilføjelse. Af røbestoffet partiklen bevægede sig mod og væk fra bagkanten af ​​de vandrende cellen før og efter tilsætning af Y-27632, hhv. Skala bar 1 μm.

Figur 5. FRAP analyse af GFP-actin udtrykke celle vandrer ud i en tre-dimensionel matrix. A) Timelapse billeder af GFP-aktin udtrykke celle før og efter fotoblegning. En lille region i GFP-actin ophobet i cellens bageste var Lysblegede (rød pilespids) på Tidspunkt 0. Tid i sekunder, skala bar 5 m. B) Den gennemsnitlige fluorescensintensitet af Lysblegede regionen (fuldt optrukket linie), og den eksponentielle fit for fluorescens genopretning (cirkler) afbildes over tid. Den fluorescensintensitet blev normaliseret til den oprindelige værdi, før fotoblegning.

Her beskriver vi en metode til at bruge live-cell imaging at studere de mekanismer af celle migration i en tre-dimensionel matrix. Succesen med denne teknik er afhængig af at opnå "god" kloner stabilt udtrykker GFP-taggede proteiner. Det lave niveau for GFP proteiner vil kræve et overskud excitation eksponering, der kompromiser celle sundhed, mens for højt GFP niveau vil have uønskede bivirkninger på cellen. Således vektoren valg til transfect gener i celler er vigtig (f.eks initiativtageren, fluorescens-tag, etc). Der er mange fluorescerende tags andet end GFP, herunder rødt fluorescerende protein (RFP) ^7,8. Disse proteiner tags kræve specifik excitation lys bølgelængde, og derfor forskellige sæt af fluorescens filtre. Desuden er forskellige antibiotikaresistente gener (f.eks G418, hygromycin, puromycin osv.) også tilgængelige og kan bruges til at generere en stabil kloner.

For live-cell imaging, transfekteret forbigående celler cen også bruges. Selv om dette minimerer tid og kræfter, der kræves for at udvikle et stabilt cellelinie, forbigående transfekterede celler er generelt usundt, og derfor mindre pålidelige til brug i forsøg. Desuden er befolkningen i forbigående transfekterede celler en heterogen blanding af udtrykke og ikke udtrykke celler, og det udtrykker cellerne mister fluorescerende protein udtryk over tid. Til sammenligning er stabilt udtrykker celler typisk klonet fra en enkelt koloni af celler og protein udtryk skal være stabilt og homogent, selv om udtrykket niveauet vil være lavere end i forbigående udtrykke celler. Siden koloni af stabile celler er sandsynligvis at stamme fra en enkelt celle, er det vigtigt at vælge kolonier, som har morfologi og adfærd, der ligner normale, untransfected celler, for at undgå fænotyper, der er specifikke kun til at klone (medmindre transfekteret plasmid er designet til at forurolige celle morfologi). Flere kolonier bør anvendes til exeksperimenter for at undgå fænotyper på grund af klonede variation. Alternativt kan viral transfektion eller elektroporation bruges til at indføre gener af interesse. Denne viral transfektion er især nyttigt for vanskelige at transfect celler eller primærelementer (se den detaljerede protokoller for andre transfektion teknikker beskrevet andetsteds i dette tidsskrift).

Den vanskeligste del af denne procedure er subcloning. Stabil kloner kan afhentes ved hjælp af vatpind, der er beskrevet her, eller alternativt, ved hjælp af en kloning ring. En anden metode til valg af GFP-positive celler bruger FACS. FACS vælger celler udelukkende er baseret på omfanget af fluorescensintensitet. Til sammenligning ved hjælp af kloning metode, der er beskrevet her, kan brugeren visuelt identificere ikke blot niveauet for GFP udtryk og men også dets cellulære lokalisering ved hjælp af et mikroskop. Også kloning ved hjælp af FACS typisk resulterer i en mere heterogen population af celler. For at overvinde dette problem, FACS-sorteret celler kanbelagte direkte ind i 96 brønde retter, således at hver brønd indeholder kun en celle. Kolonier fra enkelte celler skal være en homogen befolkning.

Metoden anvendes til at fastgøre Kollagenmatrix'en at glasset nederste skaal (figur 1) er kritisk for live-cell imaging og dyrkning af celler i en gel i en længere periode. Det første skridt til fastgørelse af matrix til glasset er dannelsen af ​​en silan éncellelag. Svigt i silan til indskuddet til en monolag vil ofte resultere i Kollagenmatrix'en løsrivelse fra glasset. Dette skyldes, at cellerne indlejret i den matrix øve kontraktile trækkraft kræfter, og få matrix til at skrumpe, hvilket øger sandsynligheden for, matrix løsrivelse fra fadet. Derfor silan / glutaraldehyd behandling af parabol er kritisk for at opretholde gel tilknytning til fadet. Bemærk, at kollagen samling forhold (koncentration, tid og pH) kan være nødvendigt at være optimeret til forskellige kollagen type og batch. IDerudover kan den protokol anvendes med forskellige typer af collagen eller andre 3D-geler såsom Matrigel eller fibroblast afledt matrix ^9.

Selv om mange celler ikke viser skadelige virkninger som svar på HEPES buffer, nogle celler er mere kræsne. For at opretholde cellens sundhed under time-lapse erhvervelsen, kan en CO ₂ inkubator tilføjes at styre pH i mikroskop kabinet. Desuden bør laser eksponering til cellerne blive minimeret. Hvis fluorescens, der udsendes af celler er for svagt, kan fluorescens blive indsamlet mere effektivt ved hjælp af et mere følsomt kamera, eller en bedre mål, eller et mere effektivt filter sæt skal osv. cellemorfologi i mikroskopet kabinettet sammenlignes med dets morfologi i CO ₂ inkubator for at sikre, at cellerne er sunde og opfører sig normalt. Da denne metode beskrives enkelt celle baseret assays, er nogle celle-til-celle variation forventet. Derfor gentage eksperimenter og data quantification er afgørende.