Live-cell Imaging of Migrering cellene uttrykker fluorescensmerket-merket Proteiner i en tredimensjonal Matrix

1. Generering av stabil cellelinje (f.eks MDCK celler)

1. Plate celler på 80-90% confluency i en P35 parabolen. Ikke la cellene danner 100% confluent monolayer, noe som vil redusere transfeksjon effektivitet.
2. Transfektere cellene med plasmidet av interesse å bruke Lipofectamine 2000. Optimaliser transfeksjon forhold ved hjelp av produsentens protokollen.
3. Neste dag, passasje cellene i to P150 petriskåler. Den store parabolen er anbefalt å tillate nok avstanden mellom stallen koloniene.
4. Neste dag, endre media og legge 500 mikrogram / ml G418 til hver rett. Den G418 konsentrasjon bør være optimalisert for de enkelte cellelinjer.
5. Endre media annenhver dag i ca 2 uker. Etter 2 uker, bør G418 tåler koloniene begynner å form, og vil være synlig med det blotte øye.
6. Bruke en invertert fluorescerende mikroskop, identifisere GFP positive kolonier. Mark disse kolonier på tallerkenen med en sharpie penn.
7. Til Selektivt trypsinize koloniene fra vevet kultur plate, aspirer ut media, og vaske cellene to ganger med PBS eller trypsin løsning. På den andre vasker, ikke aspirer ut alle løsningen. Legg igjen et tynt lag med flytende på undersiden av platen for å hindre at celler fra tørking.
8. For hvert merket koloni: bruk en sterilisert bomullspinne til å tørke så nært som mulig rundt kanten av kolonien. Dette vil skape en øy av våte område som inneholder cellen kolonien. Pipetter 10 mL av trypsin på kolonien. Gjenta for hver koloni, og gå raskt for å unngå uttørking. En erfaren forsker kan vanligvis plukke ~ 12 kolonier per P150 plate.
9. Inkuber plate ved 37 ° C i 5-10 minutter til cellene løsner fra platen og vises rundt.
10. For hver koloni: Pipetter 10 mL av trypsin på kolonien, og pipette opp og ned et par ganger for å løsne cellene fra platen. Så pipette alle cellene fra koloni til ett godt i en 24 godt parabolen.
<li> Etter stabile kolonier har vokst, er protein uttrykk for hver koloni analysert ved hjelp av standard western blot og immunfluorescens. Expand disse celle linjer for videre analyse.

2. Overflate modifikasjon av glassbunn parabolen for optimal kollagen binding (valgfritt)

1. For å silanize glasset, pipette 300 mL 2% 3-Aminopropyltrimethoxysilane løsning på glasset del av hver P35 parabolen med en 10 mm åpning. Se Figur 1 for silanization og cross-linking skjematisk. 3-Aminopropyltrimethoxysilane er fortynnet i filtrert vann.
2. Inkuber i 1 time ved romtemperatur.
3. Aspirer ut 3-Aminopropyltrimethoxysilane løsning og vask med filtrert vann tre ganger i 10 minutter hver.
4. Aspirer ut vannet og legg retter på varm plate satt til 50 ° C i 1,5 timer. Sett topper av retter litt av parabolen slik at fuktigheten i fatet kan unnslippe.
5. Fjern retter fra varmen og la til COOl.
6. Pipetter 300 mL 2% glutaraldehyd løsning på glasset delen av hver rett. Den glutaraldehyd er fortynnet i PBS.
7. Inkuber i 1 time.
8. Aspirer ut glutaraldehyd løsningen og vask retter med PBS tre ganger i 10 minutter hver.
9. Steriliser retter av eksponering for UV lys i 1 time. Den silanized rettene kan oppbevares i romtemperatur.

3. Utarbeidelse av 3D kollagen gel med tracer partikler

1. Vask fluorescerende tracer partikler ved Ã¥ spinne ned 100 mL av lager tracer partikler ⁽¹⁰ 10 partikler / ml) i en sentrifuge ved 15 000 rpm i 5 minutter, aspirer ut væske, og legge til 500 mL av media. Gjenta 5 ganger. Etter siste vask, resuspender partikler i 30 mL av media.
2. Trypsinize GFP uttrykker cellene som vanlig.
3. Resuspender cellepelleten til omtrent 2 x 10 ⁶ celler / ml.
4. Pipetter 240 mL av vekstmedier til en Eppendorf tube.
5. Legg til 12,6 mL av 1M Hepes, 20 mL av filtrert vann, 50 mL av celle løsning, deretter 10 mL av fluorescerende partikler.
6. Til slutt, tilsett 167 mL av storfe dermis Collagen jeg løsningen (å få en fungerende konsentrasjon på 1 mg / ml).
7. Bland oppløsningen grundig, deretter pipette 80 mL av løsningen på glasset delen av silanized glassbunn parabolen.
8. Sett fatet i kuvøse og la gel å polymerisere ved 37 ° C i 30 minutter. Se Figur 1A for typiske kollagen gel i en P35 glassbunn parabolen.
9. Tilsett 2 ml av vekstmedier nøye til hver rett.

Fire. Prosedyre for time-lapse bilde oppkjøp

1. Slå på temperaturstyring av mikroskopet kabinettet og la omfanget kammer likevekt til en steady state temperaturen til 37 ° C. Se Figur 2 for et eksempel på live-cell imaging system.
2. Endre medier til nye medier supplert med 25 mM Hepes å opprettholde en nøytral pH. ForDIC imaging, utveksling toppen av fatet med en som har et glass toppen. Ved hjelp av en tynn stripe av Parafilm, dekke siden av parabolen for å hindre media fordampning.
3. For en oljeneddyppingsobjektivet, plassere en dråpe av nedsenking væske på målet.
4. Plasser kollagen gel inneholder rett på mikroskop scenen, og sørg fatet kommer i kontakt med immersion væske.
5. Fokus prøven og søke etter celler av interesse for bildet. For å minimere scenen drift, la rett å avgjøre i ca 45 minutter før du starter en lang fange.
6. Spesifiser parametrene av bildet oppkjøpet. Minimer laser eksponering, som kan skade cellene, ved modulating laser makt, eksponeringstid, hyppighet og varighet av fanger tid. Den faktiske parametere vil variere med mikroskopet systemet og celletype.
7. Under time-lapse erverv, kan en inhibitor legges. For inhibitor tillegg forsøket, ikke forsegle fatet med Parafilm.
   1. Preper Hepes supplert media med narkotika på et ønsket arbeider konsentrasjon.
   2. Når du er klar til å legge stoffet til media, pause bildet fangst, og fjern forsiktig fatet toppen uten å forstyrre fatet.
   3. Aspirer ut media i fatet, og pipette stoffet inneholder media i formen. Deretter forsiktig erstatte fatet toppen.
   4. Prøven kan være ute av fokus på grunn av tillegg av nye medier, justere fokus.
   5. Start fangst, deretter overvåke fangst for de neste 30 minutter, og justere fokus som er nødvendig. Se Figur 4 for et eksempel på narkotika tillegg eksperiment.

5. FRAP prosedyre og analyse

1. Den FRAP oppsettet varierer mellom systemer, følg produsentens anvisninger.
2. Sett opp parametre for live-cell imaging.
3. Sett opp parametere for fotobleking. Bruk tilstrekkelig laser strøm til photobleach den fluorescerende signal uten å skade cellen. Test disse pariameters på praksis celler.
4. Begynn Image Capture, og la minst 5 bilder av fotografering før fotobleking regionen av interesse.
5. Fortsett fangst, og restitusjonstid bør være tilstrekkelig til å fange opp hele fluorescens utvinning. Se Figur 5 for et eksempel på FRAP eksperiment.
6. Analyser fluorescence utvinning ved å måle den gjennomsnittlige fluorescerende intensiteten av photobleached området (før og etter fotobleking) over tid. Ved hjelp av en statistisk analyse programvare (for eksempel Excel), passer den utvinning kurven til den eksponentielle ligning: I = I _f ^(1-e-kt), hvor jeg er intensiteten, jeg _f er den endelige intensitet, er t tid, og τ _½ er tiden det tar for intensitet for å nå halvparten av den endelige verdi: τ _½ = ln (2) / k. Halv-time er et mål på graden av mobilitet av protein.
7. Skaff parametrene, halv-time og endelig intensitet fra eksponentiell-fit kurve. Beregn the mobile brøkdel ved å ta forholdet av den endelige til innledende fluorescens intensiteter.

Seks. Representant Resultater

Et eksempel på live-cell imaging av friske epitelceller i matrisen er vist i figur 3.. Friske celler viser en jevn, sammenhengende membran, og tydelig kjernen, mens usunn celler har ofte en forstyrret membran, og en overdreven antall vakuoler. I en 3D-matrix, single epitelceller migrere ^1, og i løpet av flere dager, epitelceller danner tre-dimensjonale, sfærisk, multi-cellulære cyster i matrisen ^2. Cellene er også svært dynamisk, og migrere innenfor cyste (figur 3). Matrisen deformasjon som følge av trekk kraften som utøves av trekkende cellene er analysert gjennom forskyvning av tracer partikler innebygd i de omkringliggende matrise (figur 4). Den tracer partikkel bevegelsene vises som en maksimal projeksjon bilde av forskjelligskjellige tidspunkter, og hvert tidspunkt er pseudo-farget for å angi tid (Figur 4B). Alternativt er bildene av en individuell tracer partikkel vises som en montasje som viser bevegelse av tracer partikler over tid (Figur 4C). Alle bildeanalyse ble gjort ved hjelp ImageJ. Disse kvalitative vurderinger av matrix deformasjon, og derfor styrker som utøves av migrere celler, er nyttige første tilnærming av trekkraft distribusjon. Den kvantitative beregningen av trekkraft kreftene som utøves av trekkende celler i 3D er utenfor rammen av denne protokollen og er beskrevet i ^3,4.

En typisk fluorescens gjenoppretting etter fotobleking forsøket er vist i figur 5. Regionen av interesse må photobleached bruke optimalisert laser innstillinger slik at fluorescens intensiteten er synlig redusert sammenlignet med bakgrunn nivåer (for å maksimere signal-til-støy-forhold), og samtidig opprettholde sunne og uskadet celler. Den optimale innstillingen må be bestemmes empirisk som hver FRAP setup er forskjellig (f.eks FRAP bruker laser-scanning confocal system).

Den eksponering og tid-intervall på post-FRAP image oppkjøpet må kontrolleres nøye for å unngå bakgrunn fotobleking. Bruken av lavere laser makt, kort eksponeringstid, og bruk av sensitive kamera og høy effektiv optikk er avgjørende for høy kvalitet FRAP imaging. Hvis fluorescens bleking under bildet oppkjøpet er betydelig, må denne bakgrunn fading kvantifiseres og normalisert fra de observerte fluorescensintensitet utvinning. På grunn av 3D art miljø, kan z-komponenten av fluorescensintensitet utvinning bli betydelig. Derfor er det viktig å definere en photobleached volum ved å ta før og etter 3D-stack bilder av photobleached regionen. Videre analyse og modellering av fluorescens utvinning er diskutert andre steder ^5,6.

Den unike kombinasjonen av live-cell imaging techniques: GFP å følge dynamikken i cytoskeletal proteiner, rød fluorescens tracer partikler til å overvåke matrise deformasjon, og tillegg av hemmere, kan brukes samtidig for analyse av protein dynamikk, trekkraft og molekylær veier.

Figur 1. Utarbeidelse av kollagen gel. A) polymerisert kollagen matrise på et glass-bottom parabolen. Den rosa fargen på gel skyldes embedded fluorescerende partikler. B) Prosedyre for å behandle glasset bunnen retter tverrbindingsdannelse kollagen gel til glassflaten. Først er det glass bunnen parabolen behandlet med 3-Aminopropyltrimethoxysilane løsning, da glutaraldehyd løsning som kryssbinder kollagen matrise til glasset.

Figur 2. Schematics av confocal / FRAP mikroskop setup. Den confocalmikroskop er basert på en Zeiss AxioObserver med CoolSnap HQ II CCD-kamera og fullstendig automatisert ved Slidebook programvare (Intelligent Imaging Innovations). Den confocal Enheten er tilpasset designet og basert på Yokogawa spinnende disk enhet CSU10 og to solid-state laser (488 nm med 50 mW og 561 nm med 40 mW) med Acousto-optisk Fleksibel Filter (AOTF) å tillate millisekunder veksling mellom to lasere. Utslipp Filtrene er 525/50 nm og 620 / 60 nm (# 118661 og # 118085, Chroma Technology) og dichroic speil er 488-568 BrightLine Dual band (Semrock). Målene er en lang arbeidsavstand 40x C-Apochromat objektiv med NA 1.1 og arbeider avstand på 0,62 mm, og en 63x Plan-Apochromat objektiv med NA 1,4 og en fungerende avstand på 0,19 mm. Mikroskopet inkluderer også en FRAP photoablation system som består av en fiber optisk pumpet dye laser, en datastyrt bjelke posisjon og intensitet, og en diffraksjon begrenset spot størrelse. Videre er mikroskop utstyrt meden xy motorisert scene som inkluderer 0,1 mikron lineær encodere på hver akse. Under time-lapse imaging, er omgivelsestemperaturen vedlikeholdes av en spesialdesignet mikroskop kammer og en ovn med en tilbakemelding temperaturkontroll. Å isolere eventuelle støy og vibrasjoner, er hele mikroskopet systemet på en vibrasjonsfri bordet.

Figur 3. Live-cell imaging av epitelceller uttrykker GFP-aktin. Disse cellene dannes en cyste etter 4 dager med kultur i en 3D-kollagen matrise. Noen celler beveger seg langs overflaten av cyste (gul pilspiss), mens andre vandrer innenfor det indre av cyste (rød pilspiss). Scale bar 10 mikrometer, tid i timer.

Figur 4. Effekten av Rho-kinase hemming på trekkraft. A) DIC bilde av en trekkende MDCK celle uttrykke GFP tagget kjernefysisk markør. Bildet ble tatt umiddelbart før behandling av Rho-kinase inhibitor Y-27632. Scale bar 10 mikrometer. B) Particle forskyvning som følge av tillegg av Y-27632. Partikkel posisjoner på ulike tidspunkter (0 - 52 min) var pseudo-farget i henhold til intensiteten skala, deretter projisert på en enkelt bilde. Den hvite regionen er den GFP positive kjernen i migrere cellene. Scale bar 10 mikrometer. Tid i minutter. C) Den partikkel bevegelse i bakkant av cellen (se pil i B). Asterisk betegner den siste rammen fanget før Y-27632 tillegg. Den tracer partikkelen beveget seg mot og bort fra bakkanten av den utvandrende celle før og etter tilsetning av Y-27632, henholdsvis. Skala bar en mikrometer.

Figur 5. FRAP analyse av GFP-aktin uttrykke celle migrere i en tre-dimensjonal matrise. A) timelapse bilder av GFP-aktin uttrykke celle før og etter fotobleking. Et lite område av GFP-aktin akkumulert på cellen bak var photobleached (rød pilspiss) ved endepunktet 0. Tid i sekunder, skala bar 5 mikrometer. B) Den gjennomsnittlige fluorescensintensitet av photobleached regionen (heltrukket linje), og den eksponentielle tilpasning av fluorescens recovery (sirkler) plottet over tid. Den fluorescensintensitet ble normalisert til den opprinnelige verdien før fotobleking.

Her beskriver vi en metode for å bruke live-cell imaging for å studere mekanismer for celle migrasjon i en tre-dimensjonal matrise. Suksessen med denne teknikken er avhengig av å få "gode" kloner stabilt uttrykker GFP-merket proteiner. Det lave nivået av GFP proteiner vil kreve en egenandel eksitasjon eksponering som kompromisser celle helse, mens for høy GFP nivå vil ha uønskede bivirkninger på cellen. Dermed er vektoren valg å transfektere gener i celler viktig (f.eks promoter, fluorescens tag, etc). Det er mange fluorescerende tagger annet enn GFP, inkludert rødt fluorescerende protein (RFP) ^7,8. Disse protein tags krever spesifikk eksitasjon lys bølgelengde, og derfor ulike sett av fluorescens filtre. I tillegg forskjellige antibiotikaresistente gener (f.eks G418, hygromycin, puromycin etc) er også tilgjengelig og kan brukes til å generere stabile kloner.

For live-cell imaging, forbigående transfektert celler cen også brukes. Selv om dette reduserer tiden og innsatsen som kreves for å utvikle en stabil cellelinje, forbigående transfektert celler er generelt usunn, og derfor mindre pålitelig for bruk i eksperimenter. I tillegg er bestanden av forbigående transfektert celler en heterogen blanding av uttrykk og ikke-uttrykke celler, og de uttrykker cellene mister fluorescerende protein uttrykk over tid. Til sammenligning er stabilt uttrykker celler vanligvis klonet fra en enkelt koloni av celler og protein uttrykk må være stabilt og homogent, selv om uttrykket nivået vil bli lavere enn i forbigående uttrykke celler. Siden kolonien stabile celler er sannsynlig å ha sin opprinnelse fra en enkelt celle, er det viktig å plukke kolonier som har morfologi og atferd lik normal, untransfected celler, for å unngå fenotyper som er spesifikke bare til at klone (med mindre transfektert plasmid er laget for å forstyrre cellemorfologi). Flere kolonier bør brukes for experiments å unngå fenotyper grunn klonal variasjon. Alternativt kan viral transfeksjon eller electroporation brukes til å introdusere gener av interesse. Dette viral transfeksjon er spesielt nyttig for vanskelig å transfektere celler eller primære celler (se den detaljerte protokoller av andre transfeksjon teknikker beskrevet andre steder i dette tidsskriftet).

Den vanskeligste delen av denne prosedyren er subcloning. Stabil kloner kan plukkes med bomullspinne metoden beskrevet her, eller alternativt bruke en kloning ring. En annen metode for utvelgelse av GFP-positive cellene bruker FACS. FACS velger celler basert utelukkende på omfanget av fluorescens intensitet. Til sammenligning bruker kloning metoden beskrevet her, kan brukeren visuelt identifisere ikke bare nivået av GFP uttrykk og men også dens cellulær lokalisering ved hjelp av et mikroskop. Også resultater kloning bruker FACS vanligvis i en mer heterogen populasjon av celler. For å overvinne dette problemet, FACS-sorterte celler kanbelagt direkte inn 96 godt retter, slik at hver brønn inneholder bare én celle. Kolonier som stammer fra enkeltceller bør være en homogen befolkning.

Metoden brukes til å feste kollagen matrise til glasset bunnen parabolen (Figur 1) er kritisk for live-cell imaging og dyrking celler i en gel for en lengre periode. Det første trinnet for å feste matrise til glasset er dannelsen av en silane monolayer. Unnlatelse av silane å sette inn en monolayer vil ofte resultere i kollagen matrix løsrivelse fra glasset. Dette er fordi cellene integrert i matrisen utøve kontraktile trekkraft styrker, og føre til at matrisen til å krympe, og dermed øke sannsynligheten for matrisen løsrivelse fra fatet. Derfor er silane / glutaraldehyd behandling av parabolen avgjørende for å opprettholde gel vedlegg til parabolen. Merk at kollagen montering forhold (konsentrasjon, tid, og pH) kan behøves å være optimalisert for ulike kollagen type og batch. Itillegg kan protokollen brukes med ulike typer kollagen eller andre 3D-gels som Matrigel eller fibroblast utledet matrise ^9.

Selv om mange celler ikke viser uheldige virkninger i respons til HEPES buffer, noen celler er mer kresen. For Ã¥ opprettholde celle helse under time-lapse oppkjøpet, kan en CO ₂ inkubator legges til kontrollere pH i mikroskop kabinett. I tillegg bør laser eksponering til cellene skal minimeres. Dersom fluorescens slippes ut av cellene er for svakt, kan fluorescens hentes mer effektivt ved hjelp av en mer sensitiv kamera, eller et bedre objektiv, eller en mer effektiv filter sett, bør etc. Cell morfologi i mikroskopet kabinett bli sammenlignet med morfologi sin i CO ₂ inkubator for Ã¥ sørge for at cellene er friske og oppfører seg normalt. Siden denne metoden beskriver enkelt celle baserte analyser, er noe celle-til-celle variasjon forventet. Derfor gjentar eksperimenter og data quantification er avgjørende.