를 사용하여 화합물 Bioactivity위한 이점 Nanoinjection 및 화면에 대한 전기 생리학 분석 Drosophila melanogaster 거대 섬유 시스템

1. 전기 생리학 조작 설정 - 업

1. 전기 생리학의 장비 설정을위한 필수 장비는 오거 스틴 외 의해 자세하게 설명되어 있습니다. 이 저널 ^14인치 필요한 electrophysiological apparatuses의 자세한 설명은이 문서를 참조하십시오.
2. nanoinjector을 보유하고 육분의 일 micromanipulator을 추가하여 이전에 설명한 전기 생리학 장비 설정 ¹⁴ 수정합니다. 그림 2에 표시된대로 그것은 두 개의 자극 전극 마이크로 사이에 위치해야 동물의 머리에 쉽게 액세스할 수.
3. 실험을 시작하기 전에, 당신은 모든 마이크로와 회전의 모든 축에 편안한 범위를 가지고 있는지 확인하고, 모든 전극뿐만 아니라 사출 micropipette은 (단계 2 참조) 동물에 도달할 수있다.

2. Nanoinjection 설정

1. nanoinjection는 설정 Nanoliter2000 (세계 Precisi 필요합니다계측기에, 사라소타, FL, 미국) 또는 nanoliter 수량에 제어된 주입을 허용 인젝터 비슷한 유형입니다.
2. 전극 풀러와 MΩ 80-100의 저항에 벗어서 주입기와 함께 제공된 유리 micropipettes를 사용하여 주사 바늘을 준비합니다.
3. 부드러운 주사의 경우 그것은 베벨 각도는 45도 이내에서 11-17 μm의 개구 (그림 3)에 micropipettes을해야합니다.
4. 천천히 Nanoliter2000 설명서의 지시에 따라 합성 오일은 기포가 존재하지 않는다는 보장, 해밀턴 주사기를 이용한 사출 micropipette를 backfill.
5. 조심스럽게 nanoinjector에 micropipette를 확보하고 Nanoliter2000 설명서의 지시에 따라 여분의 기름을 비우는하여 화합물을로드하기 위하여 그것을 준비합니다.
6. micromanipulator에 주입기를 삽입하고 Nanoliter2000 설명서에 지시에 따라 혼합물을로드합니다. micropipette의 일각이 도중에 침입하지 않도록절차.
7. Nanoliter2000 설명서의 지시에 따라 인젝터의 제어 상자에 주입되는 nanoliters의 원하는 금액을 설정합니다. 총 금액의 주입 100 NL을 초과하지 말아야합니다. 우리는 식염수 제어 솔루션의 큰 수량은 GFS 회로의 기능에 영향을 미칠 수있는 것으로 나타났습니다.
8. 그것은 nanoinjector의 전원 공급 장치가 배경 잡음 (그림 4)로 표시 음반, 방해 때문에 인젝터가 분사 자체의 예외로 녹화 수집하는 동안 컨트롤 박스에서 분리해야하는 것이 중요합니다. 그것을 다시 설정합니다 그러나 컨트롤 박스에 전원 공급 장치를 분리하지 않습니다.

3. Drosophila melanogaster 준비

1. 이전에 ^14,15을 설명한대로 CO _2와 함께 또는 얼음 2-6일 오래된 파리를 마취.
2. 일단 고정되어 있으며, 작은 접시 부로 동물을 전송하는 족집게 한 켤레를 사용그 다리에서 데리러하여 일 소프트 치과 왁스. 남성 과일 파리가 1.0에 대한 MG 무게와 암컷 과일 파리가 1.2 밀리그램에 대해 무게, 따라서 화합물 - 투 - 체중 비율은 남성 대 여성의 파리에서 다르다는 것을 유의하시기 바랍니다. 따라서, 그것은 실험을 위해 단 한 성별을 사용하는 것이 좋습니다.
3. 이전에 ^14,15을 설명한 바와 같이, 신중 플라이 지느러미 측면을 탑재하고 흉부와 머리가 몸 주위에 배치 부드러운 치과용 왁스로 고정되어 있는지 확인하십시오. 조심스럽게 그들이 흉부 (그림 2, C)에 수직 누워 있도록 날개를 펼쳐. 파리는 가능한 한 작은 손상으로 함께 장착되어야합니다.

4. 이점 Nanoinjection / 전기 생리학

1. 자극 전극쪽으로 머리와 전기 생리학의 장비에 탑재된 파리를 놓습니다.
2. 이전에 ^14,15 (F를 설명하는 것처럼 해당 자극, 지상 및 녹음 전극과 동물을 찌르려고igure 2, C). TTM 근육에 DLM 및 기타에 달리 원하는 않는 한, 한 기록 전극. DLM 근육은 앞쪽에 Dorso - 중앙 머리카락과 파리의 중간선 사이의 흉부에 위치하고 있습니다. TTM 근육은 플라이 ^7의 뒷부분과 앞부분 위에 - 날개의 머리카락 사이에 날개 첨부 근처에 위치하고 있습니다.
3. 머리 중간 후부 부분에 위치하고 있지만 (그림 2, C) 아직 주입되지 않는 세 ocelli의 중심에있는 화합물을 포함하는 사출 micropipette을 맞춥니다.
4. 복합 주입 뇌 자극을 통한 거대 섬유 시스템 (GFS, 그림 1)의 경로를 DLM하는 TTM과 GF에 GF의 기준 녹음을 구하십시오. 전에 이렇게하려면, 10 자극의 10 열차 (40-50 MV) 열차 ^14,15 (그림 4) 사이에 일초 지연이 100 Hz에서에서 0.03 MS의 기간 동안 주어진 각각 자이언트 섬유 (GFS) 활성화합니다. 야생 유형 sh를 날아ould는 DLM 및 TTM 경로 모두에 자극이 비율로 일대일을 수행하실 수 있습니다. TTM 경로에 DLM과 GF에 GF가 1:1 비율에서 100 Hz에서의 자극을 수행하지 않을 경우 즉시 폐기하십시오.
5. 하나의 Hz에서에서 단일 펄스 (그림 4)와 GF의 지속적인 자극으로 전환합니다.
6. 신속하게 제어 상자에 주입기를 연결합니다. 배경 잡음은 1 Hz에서 자극의 녹음에 방해가됩니다하더라도, 그것을 중단하지 않습니다.
7. 단지 cuticule 아래 플라이의 머리 캡슐로 사출 micropipette를 신중을 삽입하고, 1 Hz로의 자극 (그림 4)을 유지하면서 플라이의 hemolymph으로 화합물의 원하는 금액을 투입. 파리의 개방 순환 시스템으로 인해, 전체 신경계는 초 이내에 화합물에 노출됩니다. 특정 분사 사이트 hemolymph로 화합물을 제공하는 중요한 아니지만, 우리가 집중되는 ocelli의 영역을 찾아D 화합물의 신속하고 심지어는 배포판에 이르게 쉽게 주사를 허용 편리한 사이트로 헤드 캡슐의 가장 지느러미 옆으로에서 중간.
8. 즉시 주사의 사이트에서 사출 micropipette를 제거하고 최대 주입 후 1 분 (그림 4)에 1 Hz에서 GF의 자극을 계속하는 동안 컨트롤 상자에서 인젝터를 뽑습니다.
9. GFS에 대한 화합물의 더 미묘한 효과를 공개하기 위해서는 열차 사이의 일초 지연이 100 Hz에서 10 자극의 10 열차와 자이언트 섬유 (GFS)을 강조. 최대 15 분 (그림 4)이 패러다임은 5 분 간격으로 GF 경로의 기능을 테스트하기 위해 계속합니다. 그러나, 짧은 간격 이상 모니터링 기간도 가능합니다.
10. 화합물 GFS의 신경근육학 분기점 (NMJs)에서 효과를 가지고 있으며, 가능한 화합물의 효과를 좁혀 여부를 테스트하기 위해서는 모터 뉴런 direc를 활성화하기 위해 진행tly 흉부 자극에 의​​해. 100 Hz에서 10 자극의 10 전차와 모터 뉴런을 자극하기 위해 이런 내용 눈에서 자극 전극을 제거하고 흉부의 앞부분 양쪽에 그들을 대체합니다.

참고 : 동영상에 표시되는 전기 생리학의 흔적은 순수한 염료 주입의 효과에 해당하지 않습니다.

5. 대표 결과

거대한 광섬유 시스템의 시냅스를 DLM하는 PSI에 대한 길항제의 영향

Methyllycaconitine 구연산 (행방이 묘연)는 α7 nAChR의 subtypes 특정입니다 nAChR 길항제이다. Dα7 nAChR의 나눠 봤는데요의 유전자 제거 GF-TTM 경로 ^5,6에 아무런 영향을 미치지 않습니다 동안 GF-DLM 경로에서 시냅스를 DLMn하는 PSI는 적절한 기능을 위해 Dα7 nAChR에 나눠 봤는데요에 따라 다릅니다. 우리의 분석의 특이성과 감도를 입증하기 위해 우리는 다양한 농도 (0, 0.02, 0.04, 0에서 행방이 묘연 주입.식염수 치료를 위해 N = 15); 08, 0.12 NG / MG 46 NL들은 동물의 머리 (N = 10 화합물 처리 당에) 주입. 오직 수컷 파리는 (야생 유형 유전자형 야생 10E의)이 사용되었으며, 화합물의 효과는 주사 후 15 분 총 감시되었다.

그림 5는 기준 주입하기 전에 얻은 녹음과 행방이 묘연하고 염분 제어 솔루션에 대한 응답으로 주입 후 얻은 이들의 차이를 묘사. 우리는 행방이 묘연의 주입은 GF-TTM 경로가 영향을받지 남아있는 동안 두뇌에 GFS의 stimulations 100 Hz에서에서 일대일을 따르도록 GF-DLM 경로의 무능력 결과 발견. (그림 5, 상위 및 중간 추적, 데이터가 아닌 파라메 트릭 [테스트 정상과 동등한 차이]가있는 경우를 제외 염분 조절 [0 NG / MG]과 각 시점에서 행방이 묘연의 서로 다른 농도 사이의 수행한 T-테스트, 그렇지 않으면 우리가 사용하는 맨 - 휘트니 순위 합 테스트. * P <0.001). 그러나 일대일 R모터 뉴런은 (그림 5, 하단 트레이스)에 직접 자극을 때 DLM의 esponse은 DLM과 TTM의 NMJ 함수가 행방이 묘연의 영향을받지 않는 것을 보여주 관찰되었다. 행방이 묘연은 더 이상 큰 변화는 시험 기간 중 다음과 같은 십오분 동안 언급되지 않았습니다로서, 0.04, 0.08 및 0.12 NG / 주입 행방이 묘연의 MG에 대한 주입 후 최대 효과 1 분 도달하는 것처럼 보였다. 강한 반응은 0.12 NG / MG의 높은 복용량에 관찰되지 않은 이후 더욱이 화합물은 0.08 NG / MG에서 최대 효과에 도달했습니다.

1 그림. 거대 섬유 시스템 자이언트 섬유 시스템 (GFS)의 다이어그램. (녹색으로 표시 PSI) 자이언트 섬유 (빨간색으로 표시된 GFS) 전기적 시냅스 (갭 분기점)뿐만 아니라 화학적 (cholinergic)쪽으로 주변 Synapsing의 Interneuron과 Tergo Trochanteral 근육 신경 세포 (TTMn, 노란색으로 표시) ^5. PS나는 DLMn (파란색으로 표시된 지느러미 세로 근육 신경 세포) 연결로 Dα7 nAChR의 나눠 봤는데요 ⁶ 달려 있습니다. 마지막 점프 (TTM, 자주색으로 표시)과 비행 근육쪽으로 TTMn 및 DLMn (DLM, 보라색에 표시된)의 신경근육학 접합 (NMJ)는 glutamatergic입니다.

참고 : PSI 연결에 GF는 전기 화학 모두이다. 그러나 shakB 뮤턴트 (갭 분기점이 결여되어있는)에 응답은 전기적 연결의 부재의 화학 구성 요소의 동작 가능성을 연상하기에 충분 아니라는 것을 보여주는, 두뇌에있는 GFS의 자극에 따라 DLM에서 녹화한 수 없습니다 PSI ^5,16-18. PSI 연결에 GF가 갭 접합에 의존하기 때문에,이 그림은 단순상의 이유로 시냅스에서 유일한 갭 접합을 보여줍니다.

그림 2.

마이크로의동부 표준시 - 업.

1. 이전에 다음 ID로 출판 프로토콜 ¹⁴ 수정된 설정은 동시 nanoinjections와 결합하여 GFS 녹음을위한 사출 micromanipulator에 맞도록 사용됩니다. 탑재 비행 준비는 실험자쪽으로 플라이의 머리를 지향하고 있습니다. 사출 micromanipulator은 (# 1) 텅스텐 자극 전극 (2 #와 # 3)에 대한 두 manipulators 사이 실험자 앞에 위치합니다. 유리 기록 전극 (# 4, # 5)에 대한 두 개의 마이크로는 각각 왼쪽과 오른쪽에 배치됩니다. 텅스텐 접지 전극 (# 6)에 대한 micromanipulator이 중 왼쪽 (여기서는 그림 참조) 또는 오른쪽 뒤로 멀리 배치됩니다.
2. 다양한 전극 및 사출 micropipette의 배열의 맨에서 가까이가 볼 수 있습니다.
3. 제대로 마운트 디 melanogaster은 전극과 주사 준비 사출 micropipette에 찔려 죽은. 주의 그 동물의 사체수평의 흉부 및 그 날개와 함께 장착되어 밖으로 퍼졌다. 왁스는 안전하게 이동에서 동물을 방해하고 그 몸을 감싸됩니다. 또한 접지 전극 (# 6, 복부), 유리 기록 전극 (짙은 윤곽선으로 강조 흉부의 # 4, # 5,,), 그리고 자극 전극 (# 2, # 3, 각각의 눈을 한 이전 ¹⁴ 설명된대로), 장소에 찔려 죽은됩니다. 사출 micropipette (# 1) 적절히 세 ocelli (동그라미)의 중앙에 정렬합니다. 사출 micropipette의 삽입이 지역에 배치해야합니다.

그림 3. Beveled 사출 micropipette가. 제대로 beveled micropipette의 그림이 여기에 표시됩니다. 전극 개막은 45도 각도로 beveled과 11-17 μm의 사이에 개통이되어야한다. 적절한 beveled 사출 micropipette 최소한의 D와 부드러운 분사 데 중요파리에 amage.

4 그림. nanoinjection / 전기 생리학 프로토콜의 전체 구조. nanoinjection / 전기 생리학 프로토콜에 대한 전반적인 계획의 대표적인 다이어그램. 열 자극에 각각 (한 기차가 여기에 표시)의 10 열차 100 Hz에서에서 자이언트 섬유 (GFS)을 자극하여베이스 라인 녹음을 얻어 시작합니다. 주입 전에 떨어져 1 Hz에서 제품 stimulations 잠깐만 시작합니다. 주입 시간 (인젝터는 컨트롤 박스에 연결하는 동안) 동안 중대한 배경 잡음을 관찰할 수 있지만, 레코딩을 중단하지 않습니다. 주입 후 (그리고 인젝터는 컨트롤 박스에서 분리), 약 1 분 정도 더를위한 1 Hz로의 자극을 계속합니다. 마지막으로, 100 Hz에서 10 자극의 10 열차와 GFS를 스트레스와 최대 15 분이 패러다임 5 분 간격으로 GF 경로의 기능을 테스트하기 위해 계속해서 진행합니다. 참고 : 녹음 w감수해야은 전반적인 구조를 만들 수 조작해서 얻은 구체적인 결과를 대변하지 않습니다. 아니라 스케일까지, 모든 트레이스가 표시됩니다. 큰 이미지를 보시려면 여기를 클릭하세요 .

그림 5. GFS의 행방이 묘연의 효과.

1. 다양한 농도 (0, 0.02, 0.04, 0.08,에서 과일 파리의 GF-DLM 경로에 α7 nAChR 길항제 Methyllycaconitine의 구연산 (행방이 묘연)의 효과의 그래픽 묘사 0.12 NG / MG N = 10 화합물 처리 당.; N 식염수 치료 = 15). 주사 후 딱 1 분이는 중요하고 즉각적인 효과가 행방이 묘연의 0.04 NG / MG로 보였다. 큰 영향은 또한 GFS의 100Hz 자극에 0.8ng/mg와 행방이 묘연의 0.12ng/mg 같이 있던 아이. 어떤 중요한 차이점은 식염수 컨트롤과 행방이 묘연의 0.02 NG / MG 사이에 언급되지 않았습니다. 또한, 전을 변경할 없습니다N 효과 (15 분) 테스트 기간 동안 일분 게시물 주입 후 보였다. T-테스트는 염분 조절 (0 NG / MG)와 각 시점에서 행방이 묘연의 서로 다른 농도 사이에 수행되었다. SEM * P <0.001 - 레벨은 + / - 의미로보고됩니다.
2. 100 Hz에서의 자극에 DLM 응답 샘플 흔적. 톱 추적 뇌의 GF의 자극시 행방이 묘연 주입하기 전에 근육의 반응을 보여줍니다. 근육 각 자극 100 Hz에서에서 일대일로 대응할 수납니다. 중동 성분은 행방이 묘연 주사 (0.12 NG / MG) 이후 DLM의 응답을 표시합니다. 근육 각 자극 100 Hz에서에서 일대일로 대응할 수 없다는 것을 알 수 있습니다. (별표). 하단 추적 흉부의 모터 뉴런의 직접적인 자극시 동일한 준비 (0.12 NG / MG)의 DLM의 반응을 보여줍니다. DLM은 흉부 자극 100 Hz에서에서 일대일을 응답하기 때문에 뇌 stimulations과 응답의 실패는 cholinergic PSI-DLMn 연결에 의한 것이.
3. GF-TTM 경로에 따라 달라질 행​​방이 묘연의 농도 (0, 0.02, 0.04, 0.08, 0.12 NG / MG)와 효과의 그래픽 묘사. 더 중요한 효과는 언제든지 지점에서 염분 (0 NG / MG) 및 복합 주사 사이에 본 적이 있었다. T-테스트는 * P <0.001, 각 시간 지점에서 염분 조절 (0 NG / MG)와 행방이 묘연의 서로 다른 농도 사이에 수행되었다.
4. 100 Hz에서의 자극에서 TTM 응답 샘플 흔적. 톱 추적 두뇌에 자극을 가진 GF 활성화시 행방이 묘연 주입하기 전에 근육의 반응을 보여줍니다. 근육은 100 Hz에서에서 모든 자극에 응답할 수 있는지 확인합니다. 중동 성분은 행방이 묘연 주사 (0.12 NG / MG) 후 DLM의 반응을 보여줍니다. TTM 근육에서 두뇌의 GF의 자극에 대한 응답은 일대일 남아 있습니다. 하단 추적 흉부의 모터 뉴런 (0.12 NG / MG) 100 Hz로의 자극에 동일한 준비 TTM의 반응을 보여줍니다.

여기서 제시 nanoinjection / 전기 생리학 bioassay은 과일 파리의 신경계에있는 화합물의 신속한 상영을 허용합니다. 이것은 잘 특성화의 연결 회로에서 분자 표적의 다양한 효과를 유도 화합물의 소량을 필요로 생체내 기법의 소설이다. 이 방법은 알 수없는 독소에서 상용 pharmacological 중개사에게 서로 다른 화합물의 bioactivity을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다.

여기 과일 파리의 거대한 섬유 시스템 (GFS) (그림 5)에 영향을 미쳤다 행방이 묘연 사용하여 우리의 분석의 기능을 보여주었다. 우리는 선택적으로 TTM 경로에 GF을 DLM 경로에 GF을 낫게 아닌 것으로 나타났습니다. DLM 경로로 GF에 결함이 신경근육학 접합 (NMJ)에서 장애로 인해 아니었지만 적대 effec와 일치하는 것을 보여주 흉부 자극을 통해 직접 모터 뉴런 활성화Dα7 nAChR의 subtypes의 행방이 묘연의 T는 PSI-DLMn 시냅스 (그림 1)에서 발표. TTMn 연결에 GF가 cholinergic으로 표시되었지만, 그것은 Dα7 nAChR의 subunits이 시냅스에 존재 여부를 알 수 없습니다. 또한, 콜린 acetyltransferase (차) 유전자 또는 Dα7 nAChR의 나눠 봤는데요의 유전자 부재 (Dα7)는 ^유전자가 있기 때문에 전기 접합 ^5,6,17,19의 동시 존재의 GF-TTMn 연결의 기능을 방해하지 않습니다 ^20, 어떤 행방이 묘연 의해 영향을받을 통로가 없을 수 있습니다.

복합 주입 후, 해결책은 바로 오픈 순환계 시스템에 ^21로 인해 동물의 전체 신경계를 담가해야합니다. 제대로 맞았을 경우, 화합물은 일반적으로 초 이내에 흉부와 복부에 도달하지만, 동질 분산 잠깐 시간까지 소요될 수 있습니다. 화합물이 hemolymph에 제대로 주입되지 않은 경우에는 (즉 너무 드 micropipette를 주입뇌 세포로가는 EP)이 후 동물에 걸쳐 느린 분산을 준수하고 있습니다. 염료는 비디오와 같이 적절한 사출 기술을 연습하는 데 사용될 수 있지만, 그것은 그것의 bioactivity 따라서 화합물의 속성을 변경하고 있으므로 테스트해야하는 화합물과 함께 파란 식용 색소를 공동으로 투입하기 위해 권장하지 않습니다. 용매로 사용되는 대부분의 솔루션 (식염수, DMSO 등) 색이 명확 있기 때문에 또한,이 화합물은 주사 바늘에서 배출되었다 여부를 확인하기가 어렵습니다. 따라서, 특정 화합물을 분해했을 때 그것이 솔루션에 완전히 사라진다는 보장하는 것이 중요하고, 그렇지 않으면 소화 되 다만 입자는 빠른 속도로 유체의 배출에서 예방 주사 팁을 방해할 것입니다. 화합물 분산 hemolymph 걸쳐 즉각있을 수 있지만 또한, 중추 신경계에 목표에 도달뿐만 아니라 최대 복용량을 달성, 같은 크기와 polarit로서 화합물의 화학적 특성을 기반으로 더 오래 걸릴 수도 있습니다다른 화합물은 경우에 따라서 시간이 지남에 따라 증가시킬 수 있습니다 발병 효과의 시간에 변화를 가질 수 있기 때문에 y를, 그리고 파리의 혈액 뇌 장벽. 따라서 ²² 이끌게하는 기능은 몇 분이나 주사 후 미지 화합물의 잠재적인 효과를 모니터링하는 것이 중요하다 . 높은 주파수 (100 Hz에서)에서 GFS의 자극이 낮은 복용량 또는 인해 더 미묘한 효과를 감지하는 데 사용되는 동안 완전히 뉴런의 기능을 차단하는 화합물의 강력하고 즉각적인 효과는 이미 1 Hz에서에서 트리거 답변으로 볼 수있다 화합물의 힘. 아무런 효과가 복합 주입 후 관찰하지 않으면 그것은 작은 약물 투여 또는 화합물의 특정 분자 타겟 GFS에없는 사실 중 하나 때문일 수 있습니다.

또한, 소설 화합물 (예 : conotoxins 등)에 대한 선별 도구로 여기에 제시된 bioassay를 사용할 때 그것은 분석이에서 발견된 분자 표적으로 제한됩니다 점에 유의하는 것이 중요하다파리의 GFS. 분석 자체가 주입 화합물의 실제 분자 표적의 위치를​​ 허용하지 않지만, 그것은 GFS 내에서 잠재적인 공격 대상이 좁아 다운을 허용 않습니다. 이러한 Drosophila melanogaster의 돌연변이가있는 뉴런이나 근육이나 유전자 상호 작용 연구에 대한 패치 클램프와 같은 추가 검사는, 이러한 화합물의 구체적인 목표를 결정 할 수 있습니다. 마지막으로, 제시된 녹음 프로토콜은 GFS의 기능에 대립 효과를 감지하도록 설계되었습니다. 그러나 녹화 프로토콜은 쉽게 수동적으로 오히려 GFS는 회로가 실험자에 의해 자극되었을 때 안정적으로 응답할 수없는 경우 테스트보다 화합물에 의해 유도된 응답을 모니터링함으로써 경기의 영향에 대해 모니터링하는 조정할 수 있습니다.