Kullanarak Bileşiklerin Biyoaktivite için eşli Nanoinjection ve Ekran için Elektrofizyoloji Testi Drosophila melanogaster Dev Elyaf Sistemi

1. Elektrofizyoloji Rig Set-up

1. Elektrofizyoloji kulesi kurulumu için gerekli ekipman Augustin ve arkadaşları tarafından detaylı olarak tarif edilmektedir. Bu Dergisi ^14. Gerekli elektrofizyolojik aparatlarının ayrıntılı bir açıklama için bu makaleye bakın.
2. Nanoinjector tutan altıncı mikromanipülatör, ekleyerek daha önce açıklanan elektrofizyoloji platformu set-up ¹⁴ değiştirin. Şekil 2 de gösterildiği gibi, iki uyarıcı elektrod mikromanipülatörler arasında yer almalıdır hayvanın kafası kolay erişim için.
3. Deney başlamadan önce, bütün mikromanipülatörler ile birlikte dönüş her eksende rahat bir aralığında olmasını sağlamak, ve tüm elektrotlar hem de enjeksiyon mikropipet (adım 2'ye bakınız) hayvan ulaşabileceği.

2. Nanoinjection Set-up

1. Nanoinjection set-up bir Nanoliter2000 (Dünya precisi gerektirirAraçlardan, Sarasota, FL, ABD) veya nanoliter miktarlarda kontrollü enjeksiyon sağlar enjektör benzer tip.
2. Bir elektrot çektirmesi ile MΩ 80-100 bir direnç çekerek enjektör ile birlikte cam mikropipetler kullanarak enjeksiyon iğnesi hazırlayın.
3. Düz enjeksiyonları için konik bir 45 derecelik bir açıda bir 11-17 um açıklığı (Şekil 3) mikropipetler için gereklidir.
4. Yavaşça Nanoliter2000 kılavuzda anlatıldığı gibi sentetik yağ hava kabarcıkları olmasını sağlayarak, bir Hamilton şırınga kullanarak enjeksiyon mikropipet dolgu.
5. Dikkatle nanoinjector üzerine mikropipet güvenli ve Nanoliter2000 kılavuzda belirtildiği gibi aşırı yağı boşaltılması sırasında bileşik yüklemek için hazırlayın.
6. Mikromanipülatör üzerine enjektör yerleştirin ve Nanoliter2000 kılavuzunda anlatıldığı gibi bileşik yükleyin. Mikropipet ucu bu dönemde sonu yok emin olunprosedürü.
7. Nanoliter2000 el tarafından talimat olarak enjektörün kontrol kutusu enjekte edilmek üzere nanoliters istenilen miktarda ayarlayın. Toplam miktar enjekte 100 nl geçmemelidir unutmayın. Biz serum fizyolojik kontrol çözümleri büyük miktarlarda GFS devresinin fonksiyonunu etkileyebileceğini bulundu.
8. Bu nanoinjector bir güç kaynağı arka plan gürültü (Şekil 4) olarak görünür kayıtları, müdahale yana enjektör, enjeksiyon kendisi dışında kayıt edinimi sırasında kontrol kutusu bağlantısının olması önemlidir. Onu yeniden koyacaktır Ancak, kontrol kutusuna güç kaynağı bağlantısını kesmeyin.

3. Drosophila melanogaster Hazırlık

1. Daha önce tarif edildiği gibi ^14,15 CO ₂ veya buz üzerinde 2-6 günlük sinekler uyuşturmak.
2. Bir kere hareketsiz, küçük bir tabak wi için hayvan aktarmak için cımbız kullanınayakları onu toplayarak inci yumuşak diş mumu. Bir erkek meyve sineği yaklaşık 1.0 mg ağırlığında ve bir bayan meyve sineği 1.2 mg ağırlığındadır, böylece bileşik-to-vücut ağırlığı oranının erkek karşısında erkek sineklerin farklı olduğunu unutmayın. Bu nedenle, bu deneyler için sadece tek bir cinsiyet kullanılması tavsiye edilir.
3. Daha önce ^14,15 açıklandığı gibi, dikkatli bir sinek dorsal yüzü yukarı takmak ve toraks ve baş gövde etrafına yerleştirilen yumuşak diş mumu ile immobilize emin olun. Dikkatle onlar toraks (Şekil 2, C) dik yatıyordu böylece kanatları yayıldı. Sinek mümkün olduğu kadar az zarar ile monte edilmelidir.

4. Eşleştirilmiş Nanoinjection / elektrofizyoloji

1. Uyarıcı elektrotlar yönelik kafa ile elektrofizyoloji teçhizat monte sinek yerleştirin.
2. Daha önce ^14,15 (F tarif edildiği gibi, karşılık gelen uyarıcı, zemin ve kayıt elektrotlar ile hayvan kazığa oturtmakigure 2, C). TTM kas içine DLM ve diğer içine aksi istenen sürece, yerini bir kayıt elektrot. DLM kas anterior dorso-Merkez saçlar ve sineğin orta hat arasında toraks yer almaktadır. TTM kas sinek ⁷ anterior ve posterior Supra-Alar kıllar arasında, kanat ekleri yakınında bulunmaktadır.
3. Kafa posterior kısmının üzerinde yer ama (Şekil 2, C) henüz enjekte olmayan üç ocelli merkezine sahip bileşiği içeren enjeksiyon mikropipet hizalama.
4. Bileşik enjeksiyon beyin stimülasyonu ile Dev Fiber Sistemi (GDS, Şekil 1) yollarının DLM TTM ve GF için GF bir temel kayıt edinin. Önce Bunu yapmak için, 10 uyaranların 10 trenler (40-50 mV) trenler ^14,15 (Şekil 4) arasında 1 saniyelik bir gecikme ile 100 Hz'de 0.03 ms bir süre için verilen her ile Dev Elyaf (GF'lerin) etkinleştirin. Yabani tip sh uçarould DLM ve TTM yollar hem de uyarım bu oran bire bir takip edebileceksiniz. TTM yollara DLM ve GF için GF 1:1 oranında 100 Hz uyarımı uymayan sinek atın.
5. 1 Hz'de tek bakliyat (Şekil 4) ile GF sürekli uyarılması geçin.
6. Hızla kontrol kutusu içine enjektör takın. Arka plan gürültü 1 Hz stimülasyon kayıtları engel olacak olsa da, kesmeyen.
7. Sadece derisinden köklerine aşağıda sineğin baş kapsülü içine enjeksiyon mikropipet dikkatle takın ve 1 Hz stimülasyonu (Şekil 4) korurken sineğin hemolimf içine bileşiğin istenen miktarda enjekte. Sineği açık dolaşım sistemi nedeniyle, tüm sinir sistemi saniye içinde bileşiğine maruz kalan edilecektir. Belirli bir enjeksiyon hemolimf içine maddeleri ulaştırmak için kritik olmasa da, biz lokalize olan ocelli bölgesini bulmakd bileşiğin hızlı ve eşit dağılım yol açar kolay bir enjeksiyon için olanak uygun bir sitesi olması kafa kapsül en dorsal tarafı, at medyal.
8. Hemen enjeksiyon sitesinden enjeksiyon mikropipet kaldırmak ve yukarı enjeksiyondan sonra 1 dk (Şekil 4) 1 Hz GF stimülasyonu devam ederken, kontrol kutusundaki enjektör çıkarın.
9. GFS üzerindeki bileşiklerin daha ince etkilerini ortaya çıkarmak amacıyla, trenler arasında 1 saniyelik bir gecikme ile 100 Hz'de 10 uyaranların 10 trenler ile Dev Elyaf (GF'lerin) vurgulamak. 15 dakikaya kadar (Şekil 4) bu paradigmanın her 5 dakika GF yollarının işlevini test etmek için devam edin. Ancak, daha kısa aralıklarla veya daha uzun izleme süreleri de mümkündür.
10. Bileşik GFS'nin nöromüsküler eklemleri (NMJs) bir etkiye sahiptir, ve muhtemelen bileşiğinin etkileri daraltmak olmadığını test etmek için, motor nöron doğrultularda aktif hale getirmek için devamtly torasik uyarılarak. 100 Hz'de 10 uyaranların 10 trenler ile motor nöronları uyarmak amacıyla Bunun için, gözlerden uyarıcı elektrotlar ve toraks ön tarafta bunları değiştirin.

Not: Video gösterilen elektrofizyoloji izleri saf boya enjeksiyon etkilerine karşılık gelmez.

5.. Temsilcisi Sonuçlar

Dev Fiber Sistemi sinaps DLM PSI bir antagonisti etkisi

Methyllycaconitine sitrat (MLA) α7 nAChR alt tipi için spesifik olan bir nAChR antagonistidir. Dα7 nAChR alt genetik çıkarılması GF-TTM yolu ^5,6 üzerinde hiçbir etkisi yoktur ederken GF-DLM yolunda sinaps DLMn için PSI, düzgün fonksiyonu için Dα7 nAChR alt bağlıdır. Bizim testinin özgüllük ve duyarlılık göstermek için farklı konsantrasyonlarda (0, 0.02, 0.04, 0 MLA enjekte.Tuzlu su tedavisi için n = 15); 08, 0.12 ng / mg, 46 nl bir hayvanın kafası (n = 10 bileşiğin tedavi başına içine) enjekte edildi. Sadece erkek sinekler (vahşi tip genotipine yabani 10E of) kullanılmıştır, ve bileşiğin etkisi enjeksiyonundan sonra 15 dakikalık bir toplam izlenmiştir.

Şekil 5 temel enjeksiyon önce elde edilen kayıtlar ve MLA ve serum fizyolojik yanıt olarak enjeksiyon sonrası elde edilen arasındaki farkı gösteriyor. Biz MLA bu enjeksiyon GF-TTM yolu etkilenmemiş kalırken beyinde GF'lerin ve uyarılarla 100 Hz de bire bir takip GF-DLM yolunun yetersizliği sonuçlandı bulundu. (Şekil 5, Üst ve orta izleme, veri parametrik olmayan [test normallik ve eşit değişkenlerle] olmadıkça tuzlu kontrolleri [0 ng / mg] ve her zaman noktasında MLA farklı konsantrasyonları arasında yapılan t-testi, aksi takdirde bizim kullandığımız Mann-Whitney Rank Sum testi. * p <0,001). Bununla birlikte, bir tek-bir rmotor nöron (Şekil 5, alt iz) doğrudan uyarılmış edildiğinde DLM arasında esponse DLM ve TTM'nin NMJ fonksiyonu MLA etkilenmez gösteren, gözlenmiştir. MLA başka önemli değişiklikler test döneminde aşağıdaki 15 dakika kaydedildi gibi, 0.04, 0.08 ve 0.12 ng / enjekte MLA mg enjeksiyon sonra maksimum etkisi 1 dakika ulaşmak için ortaya çıktı. Güçlü yanıtları 0.12 ng / mg daha yüksek doz ile gözlenmemiştir Dahası, bileşik, 0.08 ng / mg azından bir maksimum etki ulaşmıştır.

Şekil 1.. Dev Fiber Sistemi Dev Fiber Sistemi (GDS) diyagramı. (Yeşil renkte PSI) Dev Elyaf (kırmızı ile gösterilen GF'lerin), elektriksel sinaps (Gap Kavşaklar) ve kimyasal (kolinerjik) üzerine bir Periferik Synapsing internöron ve Tergo Trochanteral Muscle nöron (TTMN, sarı gösterilir) ^5. PSBen DLMn (mavi ile Dorsal longitudinal kas nöron) bağlantı Dα7 nAChR alt tipi ⁶ bağlıdır. Son olarak atlama (TTM, mor gösterildiği) ve uçuş kasları üzerine TTMN ve DLMn (DSB, mor görüntülenir) nöromüsküler bileşke (NMJ) glutamaterjik olduğunu.

Not: PSI bağlantısı GF elektriksel ve kimyasal hem de. Bununla birlikte, shakB mutantları (ara bağlantılar yoksun olan), hiçbir tepki elektrik bağlantıları yokluğunda kimyasal bileşen olarak bir aksiyon potansiyelinin uyandırmak için yeterli değildir gösteren, beyinde GFs stimülasyonu üzerine DLM gelen kaydedilebilir PSI ^5,16-18. PSI bağlantısı GF gap junction bağlı olduğundan, bu rakam basit nedenlerden dolayı sinaps sadece GAP kavşak gösterir.

Şekil 2.

Mikromanipülatörler set-up.

1. Bir protokol daha önce yayınlanmış ¹⁴ değiştirilmiş bir ayar eşzamanlı nanoinjections ile eşleştirilmiş GFS kayıtlar için enjeksiyon mikromanipülatör uyması için kullanılır. Monte sinek hazırlık deneyci doğru sineğin kafa ile yönlendirilmiş edilir. Enjeksiyon mikromanipülatör (# 1) tungsten uyarıcı elektrod (2 # # ve 3) için olan iki manipülatör arasındaki deneyi önüne yerleştirilir. Cam kayıt elektrotlar (# # 4 ve 5) için iki mikromanipülatörler, sırasıyla, sol ve sağ tarafında yer alır. Tungsten toprak elektrot (# 6) için mikromanipülatör ya sol tarafında (burada gösterildiği gibi) veya sağ tarafta uzak geri konur.
2. Çeşitli elektrotlar ve enjeksiyon mikropipet ilişkin düzenlemeler üst A görüntülemek yakın.
3. Düzgün monte D. melanogaster elektrotlar ve enjeksiyon için hazır olan enjeksiyon mikropipet impaled. Dikkat edin hayvan vücudununyatay olarak göğüs ve kanat ile monte edilir yayıldı. Bal mumu güvenli bir şekilde hareket etmesini önlemek hayvan gövdesi etrafına sarılır. Ayrıca, toprak elektrot (# 6, karın), cam kayıt elektrotları (karanlık hatları vurgulanan toraks içerisinde 4 ve # 5,) ve uyarıcı elektrotlar (# 2 ve # 3, her iki göz bir Daha önce tarif edildiği gibi ^14), bir yerde impaled edilir. Enjeksiyon mikropipet (# 1) doğru üç ocelli (daire) merkezi ile hizalanır. Enjeksiyon mikropipet yerleştirilmesi, bu alanda yer almalıdır.

Şekil 3. Eğimli enjeksiyon mikropipet. Düzgün eğimli mikropipet şeması burada gösterilir. Elektrot açıklığı 45 derecelik açıyla eğimli ve 11 ila 17 mm arasında bir açıklığa sahip olmalıdır. Uygun bir Eğimli enjeksiyon mikropipet az d ile pürüzsüz bir enjeksiyon için çok önemlidirfly Amage.

Şekil 4. Nanoinjection / elektrofizyoloji protokolü Genel şeması. Nanoinjection / elektrofizyoloji protokolü için genel planın bir temsilci diyagramı. 10 uyaranlara her (sadece bir tren Burada gösterilen) 10 trenler ile 100 Hz Dev Elyaf (GF'lerin) uyararak bir temel kayıt alarak başlayın. Enjeksiyon öncesinde, apart 1 Hz uyarımlar bir saniye başlar. Enjeksiyon süresi (enjektör kontrol kutusuna takılı iken) sırasında, önemli bir arka plan gürültü uyacağız, ancak kayıtları kesmeyen. Enjeksiyondan sonra (ve enjektör kontrol kutusu çıkarıldığından), yaklaşık 1 dakika daha 1 Hz uyarımı devam. Son olarak, 100 Hz'de 10 uyaranların 10 trenler ile GF'lerin vurgulamak ve 15 dakika kadar bu paradigma her 5 dakika GF yollarının fonksiyonunu test etmeye devam geçin. Not: kayıtları were genel düzeni oluşturmak için manipüle ve elde edilen özel bir sonucu temsil etmemektedir. Ölçeksiz değil, bütün izleri görülmektedir. Büyük resim için tıklayınız .

Şekil 5. GFS içinde MLA etkileri.

1. Farklı konsantrasyonlarda (0, 0.02, 0.04, 0.08, at sineği GF-DLM yolu üzerinde α7 nAChR antagonisti Methyllycaconitine sitrat (MLA) etkilerinin grafiksel bir anlatımı 0.12 ng / mg n = 10 bileşik tedavi başına.; n salin tedavisi için = 15). Enjeksiyon sonrası sadece bir dakika, bir önemli ve derhal yürürlüğe MLA 0.04 ng / mg görüldü. Önemli bir etkisi de GF'lerin ve 100Hz uyarılması az 0.8ng/mg ve MLA 0.12ng/mg görüldü. Anlamlı bir fark tuzlu kontrolleri ve MLA 0.02 ng / mg arasında bir fark görülmedi. Ayrıca, i değiştirmek yokn etkisi (15 dakika) test süresince 1 dakika sonrası enjeksiyon sonra görüldü. Bir t-testi fizyolojik kontroller (0 ng / mg), ve her bir zaman noktasında MLA farklı konsantrasyonları arasında yapıldı. SEM, * p <0.001 - Düzeyleri + / ortalama olarak bildirilmiştir.
2. 100 Hz stimülasyon de DLM yanıtları Örnek izleri. En iz beyinde GF stimülasyonu üzerine MLA enjeksiyon öncesinde kas tepkilerini gösterir. Kas Her uyaran 100 Hz az bir-bir cevap verebilmek olduğuna dikkat edin. Orta iz MLA enjeksiyonu (0.12 ng / mg), sonra DLM tepkilerini gösterir. Kas Her uyaran 100 Hz az bir-bir yanıt mümkün değildir dikkat edin. (Yıldız). Taban iz toraksta motor nöron doğrudan stimülasyonu üzerine aynı hazırlanması (0.12 ng / mg) DLM tepkilerini gösterir. DLM torasik stimülasyon ile 100 Hz az bir-bir yanıt nedeniyle, beyin uyaranlar ile tepkiler başarısızlığı kolinerjik PSI-DLMn bağlantısı atfedilebilir.
3. GF-TTM yolu üzerinde farklı MLA konsantrasyonlarda (0, 0.02, 0.04, 0.08, 0.12 ng / mg) ile bir grafik efektleri tasviri. Anlamlı etkileri herhangi bir zaman noktasında tuzlu (0 ng / mg) ve bileşik enjeksiyonlar arasındaki görüldü. Bir t-testi * p <0.001, her bir zaman noktasında salin kontroller (0 ng / mg) ve MLA farklı konsantrasyonları arasında yapıldı.
4. 100 Hz stimülasyon de TTM yanıtları Örnek izleri. En iz beyinde uyarılması ile GF etkinleşme ile MLA enjeksiyon öncesinde kas tepkilerini gösterir. Kas 100 Hz tüm uyarılara cevap mümkün olduğuna dikkat edin. Orta iz MLA enjeksiyonu (0.12 ng / mg), sonra DLM tepkilerini gösterir. TTM kas beyinde GF uyarılması cevapları bire bir kalır. Taban iz toraksta motor nöron (0.12 ng / mg) 100 Hz uyarılması için aynı hazırlanması TTM'nin tepkilerini gösterir.

Burada sunulan nanoinjection / elektrofizyoloji bioassay meyve sineği sinir sisteminde bileşiklerin hızlı bir tarama için olanak sağlar. Bu, iyi karakterize nöronal devrenin moleküler hedefler çeşitli üzerinde bir etki ortaya çıkarmak üzere bir bileşik küçük miktarlarda gerektirir vivo tekniğin bir yenilik arzetmektedir. Bu yöntem, bilinmeyen toksinler ticari olarak temin farmakolojik maddeler için farklı bileşiklerin biyoaktivitenin test etmek için kullanılabilir.

Burada meyve sineği Dev Fiber Sistemi (GDS) (Şekil 5) üzerinde etkili olmuştur MLA kullanarak bizim testinin fonksiyonunu gösterdi. Biz seçici TTM yoluna GF DLM yoluna GF bozulmuş ama o bulundu. DLM yoluna GF defekt nöromüsküler bileşke (NMJ) bir işlev bozukluğuna bağlı değildi ama antagonistik etkili tutarlı olduğunu gösterdi göğüs stimulasyonu ile doğrudan motor nöronları aktif haleDα7 nAChR alt tipleri de MLA t PSI-DLMn sinaps (Şekil 1) sunuyoruz. TTMN bağlantısı GF kolinerjik olduğu gösterilmiş olmasına rağmen, Dα7 nAChR alt birimleri bu sinaps hazır olup olmadığını bilinmiyor. Dahası, kolin asetiltransferazı (Cha) geni ya da Dα7 nAChR alt tipine genetik yokluğunda (Dα7) ^gen, çünkü bir elektrik bileşke ^5,6,17,19 arasında eşzamanlı varlığının GF-TTMN bağlantı fonksiyonu bozmayan ^20, hangi MLA etkilenmesi olası yol yapar.

Bileşik enjeksiyonundan sonra, çözelti hemen açık dolaşım sistemi ²¹ bağlı bir hayvanın tamamı sinir sistemi batırmak gerekir. Düzgün enjekte olursa, bileşik genellikle saniye içinde toraks ve batın ulaşır, ancak homojen bir dağılım bir dakika kadar sürebilir. Bileşik hemolimf içine düzgün şekilde enjekte değildir, ancak, (yani çok de mikropipet enjektebeyin doku girecek EP) daha sonra hayvanın boyunca yavaş dispersiyon görülmektedir. Boya video olarak gösterildiği gibi bir uygun enjeksiyon tekniği uygulamak için kullanılan olsa da, bunun da biyoaktivitesi ve böylece bileşiğin özelliklerini değiştirmek ve olabilir olarak test edilmesi için bir bileşik ile gümüş boyama gıda co-enjekte etmek için tavsiye edilmez. Çözücü olarak kullanılan çoğu eriyik (salin, DMSO, vs) berrak renkli olduğundan Buna ek olarak, bu bileşik, enjeksiyon iğneden çıkartıldığı olup olmadığını görmek için zordur. Bu nedenle, belirli bir bileşik eriterek, bu onu çözeltisi içine tamamen gider sağlamak için önemlidir, aksi takdirde çözünmemiş partiküllerin hızla sıvının herhangi bir ejeksiyon engelleyerek enjeksiyon ucu yapışmasına neden olacaktır. Bileşik dispersiyon hemolimf boyunca hemen olabilir, ancak Dahası, merkezi sinir sistemi içinde hedeflere ulaşmak yanı sıra, maksimum dozaj ulaşan, örneğin boyutu ve polarit gibi, bileşiğin kimyasal özelliklerine bağlı olarak uzayabilirFarklı bileşikler, bazı durumlarda zaman içinde artabilir başlangıçlı etkileri kez değişkenlik olabilir, çünkü y, ve sineğin kan beyin bariyeri. Böylece ²² nüfuz kabiliyeti, birkaç dakika enjeksiyondan sonra bilinmeyen bileşiklerin potansiyel etkilerini gözlemlemek için önemlidir . Yüksek frekanslarda (100 Hz) GFS uyarılması daha düşük doz veya bağlı daha ince etkilerini saptamak için kullanılır ise tamamen nöron fonksiyonu bloke bileşiğin Güçlü ve hemen ortaya çıkan etkileri zaten, 1 Hz'de tetiklenen tepkiler görülebilir bir bileşiğin potansiyeline. Hiçbir bileşiğin etkisi enjeksiyondan sonra gözlenen halinde küçük ilaç dozu ya da bileşiğin spesifik hedef molekül GFS mevcut olmadığı gerçeği de bağlı olabilir.

Ayrıca, yeni bileşiklerin (örneğin conotoxins gibi) için bir tarama aracı olarak burada sunulan biyoassay kullanırken bunu tahlil bulunan moleküler hedeflerin sınırlı olduğunu not etmek önemlidirSinek GFS. Assay kendisi enjekte edilen bileşiğin, gerçek moleküler hedefler yerinin izin vermemektedir rağmen, GFS içinde potansiyel hedefler daralma imkan vermez. Böyle Drosophila melanogaster mutantlarla nöronlar veya kas veya genetik etkileşim çalışmaları yama kelepçe gibi ek testler, bu bileşiklerin belirli hedef belirlemek için yapılabilir. Son olarak, sunulan kayıt protokolü GFS fonksiyonu üzerinde antagonistik etkisi tespit etmek için tasarlanmıştır. Ancak, kayıt protokolü kolay pasif değil GFS devre deneyci tarafından uyarıldığı zaman güvenilir bir şekilde cevap verebilecek değilse test daha bileşik tarafından uyarılan yanıtları izleyerek agonistik etkileri izlemek için ayarlanabilir.