Nanoinjection associato e test Elettrofisiologia allo schermo per la bioattività dei composti con il Drosophila melanogaster Sistema Fiber Giant

1. Elettrofisiologia Rig Set-up

1. L'attrezzatura necessaria per l'impianto elettrofisiologia set-up è descritto in dettaglio da Augustin et al. in questo Journal ^14. Si prega di fare riferimento a questo articolo per una spiegazione dettagliata degli apparati elettrofisiologici necessari.
2. Modificare il precedentemente descritto elettrofisiologia rig set-up ¹⁴ con l'aggiunta di un micromanipolatore sesto, che detiene il nanoinjector. Per accedere facilmente alla testa dell'animale deve essere collocato tra i due elettrodi micromanipolatori stimolanti come mostrato nella Figura 2.
3. Prima di iniziare l'esperimento, assicurarsi di avere una gamma comoda su tutti gli assi di rotazione con tutti i micromanipolatori, e che tutti gli elettrodi e la micropipetta iniezione (vedi punto 2) può raggiungere l'animale.

2. Nanoinjection Set-up

1. Il nanoinjection set-up richiede un Nanoliter2000 (World Precisisugli strumenti, Sarasota, FL, USA) o altri tipi di iniettore che permette iniezioni controllate in quantità nanolitri.
2. Preparare ago per iniezione utilizzando le micropipette di vetro forniti con l'iniettore tirando ad una resistenza di 80-100 mQ con un estrattore elettrodo.
3. Per iniezioni lisce è necessario smussare le micropipette ad un'apertura 11-17 micron ad un angolo di 45 gradi (Figura 3).
4. Lentamente la micropipetta in sostegno degli iniezione con olio sintetico, utilizzando una siringa Hamilton come da istruzioni del manuale Nanoliter2000, assicurandosi che non siano presenti bolle d'aria.
5. Cautela fissare il micropipetta sul nanoinjector e si prepara a caricare il composto con lo svuotamento olio in eccesso secondo le istruzioni del manuale Nanoliter2000.
6. Posizionare l'iniettore sul micromanipolatore e caricare il composto come indicato nel manuale Nanoliter2000. Assicurarsi che la punta della micropipetta non si rompe durante questoprocedura.
7. Impostare la quantità desiderata di nanolitri da iniettare nella casella di controllo dell'iniettore secondo le istruzioni del manuale Nanoliter2000. Si prega di notare che l'iniezione di importo complessivo non deve superare i 100 nl. Abbiamo trovato che grandi quantità di soluzioni saline controllo può influenzare la funzione del circuito GFS.
8. È fondamentale disporre l'iniettore scollegato dalla scatola di controllo durante l'acquisizione di registrazione con l'eccezione della stessa iniezione, poiché l'alimentazione del nanoinjector interferisce con le registrazioni, che è visibile come rumore di fondo (Figura 4). Tuttavia, non togliere l 'alimentazione alla scatola di controllo come sarà ri-impostato.

3. Drosophila melanogaster Preparazione

1. Anestetizzare da 2 a 6 mosche giorno di vita con la CO ₂ o su ghiaccio come descritto in precedenza ^14,15.
2. Una volta immobile, usare un paio di pinzette per trasferire l'animale a una rete Wi piccolo piattoth cera molle dentale raccoglierlo dalle sue gambe. Si prega di notare che un moscerino della frutta maschio pesa circa 1,0 mg e un moscerino della frutta femmina pesa circa 1,2 mg, così composto a corpo rapporto peso è diverso nei moscerini maschi contro femmine. Pertanto, si raccomanda di utilizzare solo un genere per gli esperimenti.
3. Come descritto in precedenza ^14,15, con attenzione montare la mosca lato dorsale fino e assicurare che il torace e la testa vengono immobilizzati con morbida cera dentale disposte intorno al corpo. Attentamente diffondere le ali in modo che depongono perpendicolare al torace (Figura 2, C). La mosca deve essere montato con il minor danno possibile.

4. Nanoinjection associati / elettrofisiologia

1. Posizionare il fly montato sul rig elettrofisiologia con la testa verso gli elettrodi stimolanti.
2. Infilzare l'animale con il corrispondente stimolante, a terra e gli elettrodi di registrazione come descritto in precedenza ^14,15 (FIGURA 2, C). Salvo diversa desiderato, posto un elettrodo di registrazione nel DLM e l'altra nel muscolo TTM. Il muscolo DLM è situato nel torace tra le anteriori dorso-centrali capelli e la linea mediana della mosca. Il muscolo TTM si trova vicino gli allegati ala, tra le anteriori e posteriori Supra-alari peli della mosca ^7.
3. Allineare la micropipetta iniezione contenente il composto con il centro delle tre ocelli situata sulla porzione mediale posteriore della testa, ma non ancora iniettare (figura 2, C).
4. Prima di compound per iniezione di ottenere una registrazione di base del GF di TTM e GF a DLM percorsi del sistema Fiber Giant (GFS, Figura 1) attraverso la stimolazione del cervello. Per farlo, attivare le fibre giganti (GFS) con 10 treni di 10 stimoli (40-50 mV), ciascuno determinato per una durata di 0,03 ms a 100 Hz con un ritardo di 1 secondo tra i treni ^14,15 (Figura 4). Tipo selvatico vola should essere in grado di seguire one-to-one a questo ritmo di stimolazione sia per DLM e le vie di TTM. Eliminare la mosca se il GF di DLM e GF a percorsi TTM non seguono la stimolazione 100 Hz con un rapporto 1:1.
5. Passa alla stimolazione continua del GF con singoli impulsi a 1 Hz (Figura 4).
6. Collegare rapidamente l'iniettore nella casella di controllo. Anche se il rumore di fondo interferisce con le registrazioni 1 Hz stimolazione, non interrompere.
7. Inserire delicatamente la micropipetta iniezione nella capsula testa della mosca appena sotto il cuticule, e iniettare la quantità desiderata di composto nella emolinfa della mosca mantenendo la stimolazione 1 Hz (Figura 4). Grazie al sistema circolatorio aperto della mosca, l'intero sistema nervoso verrà esposta al composto in pochi secondi. Anche se un particolare sito di iniezione non è critico per fornire composti nella emolinfa, troviamo la regione del ocelli, che vengono localizzared mediale sul lato più dorsale della capsula testa, per essere un sito conveniente che consente una facile iniezione che porta ad una distribuzione rapida ed uniforme del composto.
8. Rimuovere immediatamente micropipetta iniezione dal sito di iniezione e scollegare l'iniettore dalla casella di controllo, pur continuando la stimolazione GF 1 Hz fino a 1 min dopo l'iniezione (figura 4).
9. Al fine di rivelare effetti più sottili di composti sulla GFS, sottolineano le fibre giganti (GFS) con 10 treni di 10 stimoli a 100 Hz con un ritardo di 1 secondo tra i treni. Continua per testare la funzione dei percorsi GF con questo paradigma ogni 5 minuti fino a 15 minuti (Figura 4). Tuttavia, intervalli più brevi o più lunghi periodi di monitoraggio sono inoltre possibili.
10. Al fine di verificare se il composto ha un effetto a giunzioni neuromuscolari (NMJs) del GFS, ed eventualmente ridurre gli effetti del composto, procedere per attivare il motore neuroni direzioneTLY dalla stimolazione toracica. Per questo, rimuovere gli elettrodi stimolatori dagli occhi e sostituirli sui lati anteriori del torace per stimolare i neuroni motori con 10 treni di 10 stimoli a 100 Hz.

Nota: Le tracce elettrofisiologia mostrati nel video non corrispondono agli effetti di iniezione colorante puro.

5. Risultati rappresentativi

Effetto di un antagonista del PSI di DLM sinapsi del sistema Fiber Giant

Methyllycaconitine citrato (MLA) è un antagonista nAChR che è specifico per α7 sottotipi nAChR. Il PSI di DLMn sinapsi in GF-DLM percorso dipende dal sottotipo Dα7 nAChR per il corretto funzionamento, mentre la rimozione genetica di Dα7 sottotipo nAChR ha alcun effetto sulla GF-TTM percorso ^5,6. Per dimostrare la specificità e la sensibilità del nostro dosaggio MLA abbiamo iniettato a differenti concentrazioni (0, 0,02, 0,04, 0.08, 0,12 ng / mg, 46 nl iniettato) nella testa dell'animale (n = 10 per il trattamento composto; n = 15 per il trattamento salino). Solo le mosche maschio (di tipo selvatico genotipo selvatico 10E) sono stati utilizzati, e l'effetto del composto è stata monitorata per un totale di 15 minuti dopo l'iniezione.

Figura 5 illustra la differenza tra registrazioni di base ottenute prima dell'iniezione e quelli ottenuti dopo l'iniezione in risposta a MLA e soluzione salina di controllo. Abbiamo trovato che l'iniezione di MLA ha portato alla incapacità del GF-DLM percorso da seguire one-to-one a 100 Hz da stimoli del GF nel cervello, mentre il GF-TTM percorso rimasto inalterato. (Figura 5, traccia top e middle, t-test eseguito tra i controlli saline [0 ng / mg] e le diverse concentrazioni di MLA ad ogni tempo a meno che i dati non è parametrico [normalità e varianze uguali testato], altrimenti usiamo uno Mann-Whitney test somma dei ranghi. * p <0,001). Tuttavia, uno-a-uno response del DLM è stata osservata quando i motoneuroni sono stati stimolati direttamente (Figura 5, traccia inferiore), dimostrando che la funzione NMJ del DLM e TTM non è influenzata da MLA. MLA è apparso per raggiungere il suo massimo effetto 1 minuto dopo l'iniezione per 0,04, 0,08 e 0,12 ng / mg di MLA iniettato, poiché non sono cambiamenti significativi sono stati notati durante i successivi 15 minuti di periodo di prova. Inoltre, il composto ha raggiunto un effetto massimo a 0,08 ng / mg poiché forti risposte non sono state osservate con la dose maggiore di 0,12 ng / mg.

Figura 1. Il Gigante Diagramma di fibra del Sistema Fiber Giant (GFS). Le fibre giganti (GFS, mostrato in rosso) sinapsi elettricamente (Gap Junction) e chimicamente (colinergica) su un Interneuron sinapsi periferica (PSI, mostrati in verde) e il Trochanteral Tergo neurone muscolare (TTMn, mostrato in giallo) ^5. Il PSI DLMn (dorsale neurone muscolare longitudinale, in blu) la connessione dipende Dα7 sottotipo nAChR ^6. Infine, la giunzione neuromuscolare (NMJ) del TTMn e DLMn sul salto (TTM, mostrato in viola) e dei muscoli di volo (DLM, mostrato in viola) è glutamatergica.

Nota: il GF e la connessione di PSI è sia elettrica e chimica. Tuttavia, in mutanti shakB (che mancano giunzioni), nessuna risposta può essere registrato dal DLM dopo stimolazione del FG nel cervello, dimostrando che il componente chimico in assenza di collegamenti elettrici non è sufficiente a evocare un potenziale di azione nella PSI ^5,16-18. Perché il GF alla connessione PSI è giunto dipende gap, questa figura mostra solo il bivio GAP alla sinapsi per ragioni di semplicità.

Figura 2.

Micromanipolatori set-up.

1. Una versione modificata del set-up di uno precedentemente pubblicato con il protocollo ¹⁴ è utilizzato per adattare il micromanipolatore iniezione per coppie di registrazioni GFS con nanoinjections simultanei. La preparazione fly montato è orientato con la testa della mosca verso lo sperimentatore. Il micromanipolatore iniezione (# 1) è posto di fronte al sperimentatore tra i due manipolatori per gli elettrodi di tungsteno stimolante (# 2 e # 3). I due elettrodi di registrazione micromanipolatori per il vetro (# 4 e # 5) sono disposti sul lato sinistro e destro, rispettivamente. Il micromanipolatore per l'elettrodo di massa di tungsteno (# 6) è posto più lontano nella parte posteriore o sul lato sinistro (qui illustrato) o sul lato destro.
2. Una stretta vista dall'alto del regime dei vari elettrodi e micropipette iniezione.
3. Un montato correttamente D. melanogaster impalato con elettrodi e micropipette iniezione pronta per l'iniezione. Si noti che il corpo dell'animaleè montato con il torace in orizzontale e le sue ali sparsi. La cera viene saldamente avvolto attorno al corpo impedendo l'animale da movimento. Inoltre, l'elettrodo di massa (# 6, nell'addome), gli elettrodi di registrazione di vetro (# 4 e # 5, nel torace, evidenziato da contorni scuri), e gli elettrodi stimolatori (# 2 e # 3, uno in ciascun occhio ) sono impalati in posizione, come descritto in precedenza ^14. La micropipetta di iniezione (# 1) sia correttamente allineato con il centro dei tre ocelli (cerchiato). Inserimento della micropipetta iniezione deve essere posto in questo settore.

Figura 3. Micropipetta iniezione smussato. Un diagramma di una micropipetta correttamente smussati viene mostrato qui. L'apertura elettrodo deve essere smussata con un angolo di 45 gradi e ha un'apertura tra 11 a 17 um. Una micropipetta corretta iniezione smussata è cruciale per una iniezione regolare con un minimo damage al fly.

Figura 4. Schema generale della nanoinjection / elettrofisiologia protocollo. Un diagramma rappresentante del regime generale per la nanoinjection / protocollo elettrofisiologia. Iniziare ottenendo una registrazione di base, stimolando le fibre giganti (GFS) a 100 Hz con 10 treni di 10 stimoli ciascuna (un solo treno mostrato qui). Prima dell'iniezione, iniziare le stimolazioni 1 Hz uno secondo di distanza. Durante il tempo di iniezione (iniettori, mentre è collegato alla centralina di controllo), si potrà osservare il rumore di fondo significativo, tuttavia, non interrompere le registrazioni. Dopo l'iniezione (iniettore e sia scollegato dalla scatola di controllo), continuare la stimolazione 1 Hz per circa 1 minuto in più. Infine, procedere a sottolineare la FG con 10 treni di 10 stimoli a 100 Hz e continuare a testare la funzione delle vie GF con questo paradigma ogni 5 minuti fino a 15 minuti. Nota: le registrazioni were manipolate per creare lo schema generale e non rappresentano un risultato specifico ottenuto. Non in scala, non tutte le tracce vengono visualizzati. Clicca qui per ingrandire l'immagine .

Figura 5. Gli effetti di mutua assistenza giudiziaria in GFS.

1. Una rappresentazione grafica degli effetti dell'antagonista α7 citrato nAChR Methyllycaconitine (MLA) sul GF-DLM percorso della mosca della frutta a diverse concentrazioni (0, 0,02, 0,04, 0,08, 0,12 ng / mg n = 10 per il trattamento composto.; n = 15 per il trattamento salino). Solo un minuto dopo l'iniezione, un effetto significativo e immediato è stato visto con 0,04 ng / mg di MLA. Un effetto significativo è stato osservato anche con 0.8ng/mg e 0.12ng/mg di MLA a 100Hz stimolazione del GFS. Nessuna differenza significativa è stata osservata tra i controlli saline e 0,02 ng / mg di MLA. Inoltre, non posso cambiaren effetto è stato osservato dopo 1 minuto dopo l'iniezione durante il tempo di prova (15 minuti). A t-test è stato eseguito tra i controlli saline (0 ng / mg) e le concentrazioni diverse di MLA ad ogni tempo. I livelli sono riportati come media + / - SEM, * p <0,001.
2. Tracce del campione delle risposte DLM a 100 Hz stimolazione. Traccia in alto mostra le risposte del muscolo prima dell'iniezione MLA GF dopo stimolazione nel cervello. Si noti che il muscolo è in grado di rispondere ad ogni stimolo uno-ad-uno a 100 Hz. Medio traccia mostra le risposte del DLM MLA dopo l'iniezione (0,12 ng / mg). Si noti che il muscolo non è in grado di rispondere ad ogni stimolo uno-a-uno a 100 Hz. (Asterischi). Traccia in basso mostra le risposte del DLM della stessa preparazione (0,12 ng / mg) dopo stimolazione diretta dei motoneuroni del torace. Poiché DLM risponde uno-ad-uno a 100 Hz con stimolazione toracica, il fallimento delle risposte con stimolazioni cerebrali può essere attribuita alla colinergica PSI-DLMn collegamento.
3. Una rappresentazione grafica degli effetti con differenti concentrazioni di MLA (0, 0,02, 0,04, 0,08, 0,12 ng / mg) sul GF-TTM percorso. Non sono stati osservati effetti significativi tra salina (0 ng / mg) e iniezioni composti in qualsiasi punto nel tempo. A t-test è stato eseguito tra i controlli saline (0 ng / mg) e le concentrazioni diverse di MLA in ogni punto temporale, * p <0,001.
4. Tracce del campione delle risposte TTM a 100 Hz stimolazione. Traccia in alto mostra le risposte del muscolo prima di MLA al momento dell'attivazione di iniezione GF con la stimolazione nel cervello. Si noti che il muscolo è in grado di rispondere a tutti gli stimoli a 100 Hz. Medio traccia mostra le risposte del DLM dopo MLA iniezione (0,12 ng / mg). Risposte dal muscolo TTM alla stimolazione del GF nel cervello rimangono uno-a-uno. Traccia in basso mostra le risposte del TTM della stessa preparazione a 100 Hz stimolazione dei neuroni motori nel torace (0,12 ng / mg).

Il nanoinjection / elettrofisiologia biotest qui presentata consente un rapido screening di composti nel sistema nervoso del moscerino della frutta. Si tratta di una nuova tecnica in vivo che richiede piccole quantità di un composto per provocare un effetto su una varietà di bersagli molecolari in un circuito ben caratterizzato neuronale. Questo metodo può essere utilizzato per testare la bioattività di diversi composti, da tossine sconosciuti agenti farmacologici disponibili in commercio.

Qui abbiamo dimostrato la funzione del nostro dosaggio con MLA, che ha avuto un effetto sul sistema Fiber Giant (GFS), del moscerino della frutta (Figura 5). Abbiamo trovato che selettivamente interrotto il percorso di GF DLM ma non il GF al via TTM. Attivazione dei neuroni motori direttamente attraverso la stimolazione del torace ha dimostrato che il difetto nella GF di via DLM non era dovuta ad una disfunzione a livello della giunzione neuromuscolare (NMJ) ma era coerente con l'efficacia antagonistat di MLA i sottotipi Dα7 nAChR presentarsi al PSI-DLMn sinapsi (Figura 1). Anche se il GF alla connessione TTMn ha dimostrato di essere colinergica, non si sa se Dα7 subunità nAChR sono presenti in questa sinapsi. Inoltre, la mancanza genetica di colina acetiltransferasi (Cha) o il gene Dα7 sottotipo nAChR (Dα7) gene non disturbare la funzione del GF-TTMn connessione a causa della contemporanea presenza di una giunzione elettrica ^{5,6,17,19, 20,} che rende il percorso improbabile che sia influenzata da MLA.

Dopo l'iniezione composto, la soluzione deve immergere immediatamente tutto il sistema nervoso dell'animale grazie al suo sistema circolatorio aperto ^21. Se correttamente iniettato, il composto di solito raggiunge il torace e l'addome in pochi secondi, ma una dispersione omogenea può richiedere fino a un minuto. Tuttavia, se il composto non è iniettato correttamente nella emolinfa (cioè iniettando la micropipetta troppo deep di entrare nel tessuto cerebrale), poi più lenta dispersione in tutta l'animale si osserva. Mentre colorante può essere usato per esercitare una corretta tecnica di iniezione, come mostrato nel video, esso non è raccomandata la co-iniettare il colorante blu alimentare con un composto da testare in quanto può alterare le proprietà del composto e quindi la sua bioattività. Inoltre, poiché la maggior parte delle soluzioni usate come solvente sono di colore chiaro (soluzione salina, DMSO, ecc), è difficile da vedere se il composto è stato espulso dal ago di iniezione. Pertanto, quando sciogliendo un composto specifico, è importante garantire che va completamente in soluzione; particelle altrimenti indisciolte rapidamente intasare la punta di iniezione, impedendo qualsiasi espulsione di liquido. Inoltre, sebbene dispersione composto può essere immediata in tutta la emolinfa, raggiungendo gli obiettivi nel sistema nervoso centrale, nonché raggiungendo il suo dosaggio massimo, può richiedere più basata sulle proprietà chimiche del composto, come le dimensioni e Polarity, e la sua capacità di permeare la mosca barriera ematoencefalica. ²² Così, è importante controllare i potenziali effetti dei composti ignoti diversi minuti dopo l'iniezione perché diversi composti possono avere variazioni nei tempi di effetti insorgenza, che possono aumentare nel tempo in alcuni casi . Effetti forti e immediate del composto che bloccare completamente la funzione dei neuroni può essere già visto con le risposte innescate a 1 Hz, mentre la stimolazione della GFS alle alte frequenze (100 Hz) viene utilizzato per rilevare gli effetti più sottili a causa della minore dosaggio o potenza di un composto. Se non si osservano effetti dopo l'iniezione composto può essere dovuto a uno dosaggio di farmaco piccolo o il fatto che bersaglio molecolare specifico del composto non è presente nel GFS.

Inoltre, quando si utilizza il saggio biologico qui presentata come strumento di screening di nuovi composti, ad esempio conotossine) è importante notare che il saggio sia limitata ai bersagli molecolari presenti nellaGFS della mosca. Sebbene il test non permette di localizzare i bersagli molecolari reali del composto iniettato, non consente per il restringimento degli obiettivi potenziali all'interno del GFS. Ulteriori test, come ad esempio patch clamp sui neuroni o muscoli o studi genetici di interazione con mutanti di Drosophila melanogaster, può essere fatto per determinare l'obiettivo specifico di questi composti. Infine, il protocollo di registrazione presentato è stato progettato per rilevare effetti antagonistici la funzione del GFS. Tuttavia, il protocollo di registrazione può essere facilmente adattata per monitorare gli effetti agonisti passivamente monitoraggio per risposte indotte dal composto anziché testare se il GFS non è in grado di rispondere in modo affidabile quando il circuito viene stimolata dallo sperimentatore.