Nanoinjection emparelhado e Eletrofisiologia Ensaio para a tela de bioatividade dos compostos utilizando os Drosophila melanogaster Sistema Fibra Gigante

1. Eletrofisiologia Rig Set-up

1. O equipamento necessário para o equipamento de electrofisiologia de configuração é descrito em detalhe por Augustin et ai. neste Jornal ^14. Por favor, consulte este artigo para uma explicação detalhada dos aparatos necessários eletrofisiológicas.
2. Modifique o descrito anteriormente eletrofisiologia plataforma set-up ¹⁴ por adição de um micromanipulador sexta, que detém a nanoinjector. Para um fácil acesso para a cabeça do animal deve ser colocada entre os dois eléctrodos estimulantes micromanipuladores como mostrado na Figura 2.
3. Antes de iniciar a experiência, garantir que tem uma gama confortável em todos os eixos de rotação com todos os micromanipuladores, e que todos os eléctrodos, assim como a micropipeta de injecção (ver passo 2) pode chegar ao animal.

2. Nanoinjection Set-up

1. O conjunto nanoinjection-se requer uma Nanoliter2000 (World precisisobre os instrumentos, Sarasota, FL, EUA) ou de tipo semelhante de injetor que permite injeção em quantidades controladas nanolitros.
2. Preparar agulha de injecção usando as micropipetas de vidro fornecidos com o injector, puxando-as para uma resistência de 80-100 mohms com um puxador de eléctrodo.
3. Para injecções lisas é exigido que os bisel micropipetas para uma abertura iM 11-17 a um ângulo de 45 graus (Figura 3).
4. Lentamente aterrar a micropipeta de injeção com óleo sintético utilizando uma seringa Hamilton com as instruções do manual do Nanoliter2000, garantindo que nenhuma bolha de ar estão presentes.
5. Cuidadosamente garantir a micropipeta na nanoinjector e prepará-lo para carregar o composto por esvaziar o excesso de óleo com as instruções do manual do Nanoliter2000.
6. Coloque o injector na micromanipulador e carregar o composto como indicado no manual Nanoliter2000. Assegure-se que a ponta da micropipeta não quebre durante esteprocedimento.
7. Defina a quantidade desejada de nanolitros ser injetados na caixa de injetor de controle conforme as instruções do manual do Nanoliter2000. Por favor, note que o montante total injetado não deve exceder 100 nl. Nós descobrimos que maiores quantidades de soluções de controlo de solução salina pode afectar a função do circuito GFS.
8. É crítico para ter o injector desligado da caixa de controlo durante a aquisição de gravação com a excepção da injecção de si, uma vez que a fonte de energia do nanoinjector interfere com as gravações, que é visível como o ruído de fundo (Figura 4). No entanto, não desligue a fonte de alimentação para a caixa de controle como ele vai voltar a defini-la.

3. Drosophila melanogaster Preparação

1. Anestesiar 2 a 6 dias de idade moscas com CO ₂ ou em gelo, como descrito anteriormente ^14,15.
2. Uma vez imóvel, use um par de pinças para transferir o animal para uma pequena placa wicera mole ª dental por pegá-la de suas pernas. Por favor, note que uma mosca da fruta macho pesa cerca de 1,0 mg e uma mosca de fruta fêmea pesa cerca de 1,2 mg, assim composto-a-corpo relação peso é diferente nas moscas do sexo masculino versus feminino. Portanto, recomenda-se usar apenas um dos sexos para as experiências.
3. Como descrito anteriormente ^14,15, cuidadosamente montar o lado dorsal mosca-se e assegurar que o tórax e da cabeça são imobilizados com cera dental macio colocado em torno do corpo. Cuidadosamente espalhar as asas para fora de modo que eles estabelecem perpendicular ao tórax (Figura 2, C). A mosca deve ser montado com como danos pouco quanto possível.

4. Nanoinjection emparelhado / eletrofisiologia

1. Coloque o fly montado sobre a plataforma de eletrofisiologia com a cabeça em direção aos eletrodos de estimulação.
2. Empalar o animal com a correspondente estimulante chão, e eléctrodos de registo, como descrito anteriormente ^14,15 (Figura 2, C). Salvo disposição em contrário desejado, a gravação de um eletrodo lugar para o DLM eo outro no músculo TTM. O músculo DLM está localizado no tórax entre os anteriores dorso-centrais cabelos e da linha mediana da mosca. O músculo TTM está localizado perto das ligações da asa, entre os posteriores e anteriores Supra-Alar pêlos da mosca ^7.
3. Alinhar o micropipeta de injecção contendo o composto com o centro do ocelos três situado sobre a porção média posterior da cabeça, mas não injectar ainda (Figura 2, C).
4. Antes da injecção composto obter uma gravação de linha de base do GF o MTT e GF para DLM vias do sistema de fibras gigante (GFS, Figura 1) através da estimulação do cérebro. Para fazer isso, activar as fibras gigantes (FG) com 10 trens de 10 estímulos (40-50 mV) cada dado para uma duração de 0,03 ms a 100 Hz, com um atraso de 1 segundo entre os trens ^14,15 (Figura 4). Tipo selvagem voa should ser capaz de seguir um-para-um, a este ritmo de estimulação para ambos DLM e vias TTM. Descarte a mosca se o GF a DLM e GF para as vias de TTM não seguem o estímulo de 100 Hz em uma proporção de 1:1.
5. Mudar a estimulação contínua do GF com pulsos simples, no Hz 1 (Figura 4).
6. Rapidamente conecte o injector na caixa de controle. Mesmo que o ruído de fundo vai interferir com as gravações de estimulação 1 Hz, não eliminá-la.
7. Cuidadosamente inserir o micropipeta de injecção para dentro da cápsula cabeça da mosca logo abaixo da cutícula, e injectar a quantidade desejada de composto na hemolinfa da mosca enquanto se mantém a estimulação 1 Hz (Figura 4). Devido ao sistema circulatório aberta da mosca, todo o sistema nervoso será exposto ao composto em poucos segundos. Embora um local de injecção particular não é crítica para entregar compostos na hemolinfa, encontramos a região do ocelos, que são localizard medial no lado mais dorsal da cápsula cabeça, para ser um local conveniente que permite para a injecção fácil que leva a uma distribuição rápida e uniforme do composto.
8. Imediatamente remover micropipeta de injecção a partir de local da injecção e desligue o injector a partir da caixa de controlo, enquanto continua a 1 Hz estimulação GF até 1 min após a injecção (Figura 4).
9. A fim de revelar efeitos mais sutis de compostos no GFS, sublinham os fibras gigantes (GFS), com 10 trens de 10 estímulos de 100 Hz com um atraso de 1 segundo entre os trens. Continuar a testar a função das vias GF com este paradigma a cada 5 minutos até 15 minutos (Figura 4). No entanto, intervalos mais curtos ou longos períodos de monitoramento também são possíveis.
10. A fim de testar se o composto tem um efeito nas junções neuromusculares (NMJs) do GFS, e possivelmente diminuir os efeitos do composto, proceder para activar o motor neurónios direcçãoqüentemente por estimulação torácica. Para isso, remover os eléctrodos estimulantes dos olhos e substituí-los nos lados anterior do tórax, a fim de estimular os neurónios motores com 10 trens de 10 a 100 Hz estímulos.

Nota: Os traços electrofisiologia mostrados no vídeo não correspondem aos efeitos da injecção de corante puro.

5. Os resultados representativos

Efeito de um antagonista sobre o PSI para DLM sinapse do sistema de fibras Gigante

Methyllycaconitine citrato (MLA) é um antagonista nAChR que é específico para α7 subtipos nAChR. A PSI para DLMn sinapse na via de GF-DLM é dependente do subtipo nAChR Dα7 para o bom funcionamento, enquanto a remoção genética de Dα7 subtipo nAChR não tem efeito sobre a via GF-TTM ^5,6. A fim de demonstrar a especificidade e sensibilidade do nosso ensaio que injectado MLA em diferentes concentrações (0, 0,02, 0,04, 0.08, 0,12 ng / mg, 46 nl injectada) para a cabeça do animal (n = 10 por tratamento com composto, n = 15 para o tratamento de solução salina). Apenas as moscas do sexo masculino (do tipo selvagem genótipo selvagem 10E) foram usados, eo efeito do composto foi monitorizado durante um total de 15 minutos após a injecção.

A Figura 5 representa a diferença entre valores basais obtidos antes da injecção e os obtidos após a injecção, em resposta a MLA e solução salina de controlo. Nós descobrimos que a injecção de MLA resultou na incapacidade da via GF-DLM para seguir um-para-um a 100 Hz por estímulos do FG no cérebro enquanto a via GF-TTM permaneceram inalterados. (Figura 5, o traço superior e médio, t-teste realizado entre os controlos de solução salina [0 ng / mg] e as concentrações diferentes de MLA em cada ponto de tempo, a menos que os dados são não-paramétrico [normalidade e variâncias iguais testado], caso contrário, usamos de Mann-Whitney Rank Sum Test. * p <0,001). No entanto, r um-para-umesposto do DLM foi observado quando os neurónios motores foram estimuladas directamente (Figura 5, traço de fundo), demonstrando que a função JNM do DLM e TTM não é afectada pela MLA. MLA apareceu para atingir o seu máximo efeito de 1 minuto após a injecção para 0,04, 0,08 e 0,12 ng / mg de MLA injectado, como não há mais alterações significativas foram observados durante os seguintes 15 minutos de período de teste. Além disso, o composto alcançado um efeito máximo a 0,08 ng / mg uma vez que as respostas mais fortes não foram observadas com a dosagem mais elevada de 0,12 ng / mg.

Figura 1. O diagrama de sistema gigante de fibra do sistema de fibras gigante (GFS). As fibras gigantes (FG, mostrado em vermelho) sinapse electricamente (Junções Gap), bem como quimicamente (colinérgica), sobre um Interneuron sinapse periférica (PSI, mostrado em verde) e o tergo neurónio Muscle Trochanteral (TTMn, mostrado na amarelo) ^5. O PSI DLMn conexão (neurônio músculo dorsal longitudinal, mostrado em azul) é dependente Dα7 subtipo nAChR ^6. Finalmente, a junção neuromuscular (JNM) do TTMn eo DLMn para o salto (TTM, mostrado em roxo) e músculos de vôo (DLM, mostrado em roxo) é glutamatérgica.

Nota: O GF para conexão PSI é tanto elétrica e química. No entanto, em mutantes shakB (que carecem de junções), nenhuma resposta pode ser gravado a partir do DLM após estimulação da FG no cérebro, demonstrando que o componente químico, na ausência de ligações eléctricas não é suficiente para evocar um potencial de acção no PSI ^5,16-18. Porque o GF para conexão PSI é dependente junções, esta figura mostra apenas a junção de GAP na sinapse por razões de simplificação.

Figura 2.

Micromanipuladores set-up.

1. A modificado set-up de um protocolo publicado anteriormente ¹⁴ é utilizado para ajustar a injeção micromanipulador para gravações emparelhados GFS com nanoinjections simultâneas. A preparação fly montado é orientado com o chefe da mosca para o experimentador. O micromanipulador injecção (# 1) é colocado na frente do experimentador entre os dois manipuladores para os eléctrodos de tungsténio estimulantes (2 # e # 3). Os dois micromanipuladores para os eléctrodos de vidro de gravação (# 4 e # 5) são colocados no lado esquerdo e direito, respectivamente. O micromanipulador para o eléctrodo de terra de tungsténio (# 6) é colocado mais distante na parte de trás, quer do lado esquerdo (mostrado aqui) ou no lado direito.
2. Um fim vista a partir do topo do regime dos eléctrodos e vários micropipeta de injecção.
3. Um devidamente montado D. melanogaster empalado com eletrodos e micropipeta de injeção pronto para a injecção. Note-se que o corpo do animalé montado com o seu tórax horizontalmente e as asas se espalhar. A cera está firmemente enrolado em torno do seu corpo impedindo o animal de se mover. Além disso, o eléctrodo de terra (# 6, no abdómen), os eléctrodos de registo de vidro (# 4 e # 5, no tórax, em destaque por contornos escuras), e os eléctrodos de estimulação (# 2 e # 3, uma em cada olho ) são empalado no lugar, como descrito anteriormente ^14. A micropipeta de injecção (# 1) está correctamente alinhado com o centro do ocelos três (círculo). A inserção da micropipeta de injecção deve ser colocado nesta área.

Figura 3. Micropipeta de injeção chanfrada. Um diagrama de uma micropipeta devidamente chanfrado é mostrado aqui. A abertura do eléctrodo deve ser chanfrada a um ângulo de 45 graus e têm uma abertura entre 11 a 17 uM. A micropipeta de injecção adequada chanfrada é crucial para uma injeção suave com mínimo damage à mosca.

Figura 4. Esquema geral do protocolo nanoinjection / eletrofisiologia. Um diagrama representativo do regime geral para o nanoinjection / protocolo de eletrofisiologia. Comece por obter uma gravação de linha de base, estimulando as fibras gigantes (GFS) a 100 Hz com 10 trens de 10 estímulos cada (apenas um trem mostrado aqui). Antes da injeção, começam os estímulos 1 Hz um segundo de intervalo. Durante o tempo de injeção (injetora, enquanto está ligado à caixa de controle), você vai observar o ruído de fundo significativo, no entanto, não interromper as gravações. Após a injeção (e injetor está desconectado da caixa de controle), continuar a estimulação de 1 Hz por cerca de mais 1 minuto. Finalmente, proceder para salientar a FG com 10 trens de 10 estímulos a 100 Hz e continuar para testar a função das vias GF com este paradigma a cada 5 minutos até 15 minutos. Nota: gravações were manipulado para criar o regime geral e não representam um resultado específico obtido. Não à escala, nem todos os traços são mostrados. Clique aqui para ampliar a imagem .

Figura 5. Os efeitos do MLA no GFS.

1. Uma representação gráfica dos efeitos do nAChR citrato antagonista α7 Methyllycaconitine (MLA) sobre a via de GF-DLM da mosca da fruta em diferentes concentrações (0, 0,02, 0,04, 0,08, 0,12 ng / mg n = 10 por tratamento com composto.; n = 15 para o tratamento de solução salina). Apenas um minuto após a injecção, um efeito significativo e imediata foi observada com 0,04 ng / mg de MLA. Um efeito significativo também foi visto com 0.8ng/mg e 0.12ng/mg de MLA a 100Hz estimulação do FG. Nenhuma diferença significativa foi observada entre os controles de salinas e 0,02 ng / mg de MLA. Além disso, não mudar in efeito foi observado após uma injecção de pós minutos durante o tempo testado (15 minutos). Um t-teste foi realizado entre os controlos de solução salina (0 ng / mg) e as concentrações diferentes de MLA em cada ponto de tempo. Os níveis são apresentados como média + / - SEM, * p <0,001.
2. Vestígios de exemplo das respostas DLM a 100 Hz estimulação. Traço superior mostra as respostas do músculo antes MLA injecção após estimulação GF no cérebro. Note-se que o músculo é capaz de responder a cada estímulo de um-para-um a 100 Hz. Meio de rastreio exibe as respostas do DLM após injecção MLA (0,12 ng / mg). Note-se que o músculo não é capaz de responder a cada estímulo de um-para-um a 100 Hz. (Asteriscos). Traço inferior mostra as respostas do DLM da mesma preparação (0,12 ng / mg) com a estimulação direta dos neurônios motores no tórax. Devido DLM responde um-para-um a 100 Hz, com a estimulação torácica, a falha de respostas com estímulos cerebrais pode ser atribuído à ligação PSI DLMn-colinérgico.
3. Uma representação gráfica dos efeitos com diferentes concentrações MLA (0, 0,02, 0,04, 0,08, 0,12 ng / mg) sobre a via do GF-TTM. Não houve diferenças significativas foram observadas entre o soro fisiológico (0 ng / mg) e injeções de compostos em nenhum momento. Um t-teste foi realizado entre os controlos de solução salina (0 ng / mg) e as concentrações diferentes de MLA em cada ponto de tempo, * p <0,001.
4. Vestígios de exemplo das respostas TTM a 100 Hz estimulação. Traço superior mostra as respostas do músculo antes MLA injeção sobre GF ativação com estimulação no cérebro. Note-se que o músculo é capaz de responder a todos os estímulos a 100 Hz. Meio rastreio mostra as respostas do DLM após injecção MLA (0,12 ng / mg). As respostas a partir do músculo TTM à estimulação do GF no cérebro permanecer um-para-um. Traço inferior mostra as respostas do MTT da mesma preparação a 100 Hz estimulação dos neurónios motores no tórax (0,12 ng / mg).

O bioensaio nanoinjection / eletrofisiologia aqui apresentada permite uma rápida triagem de compostos no sistema nervoso da mosca da fruta. Este é um novo na técnica in vivo que requer pequenas quantidades de um composto para eliciar um efeito sobre uma variedade de alvos moleculares em um circuito bem caracterizado neuronal. Este método pode ser usado para testar a bioactividade de compostos diferentes, a partir de toxinas desconhecidos para comercialmente disponíveis agentes farmacológicos.

Aqui demonstramos a função do nosso ensaio usando MLA, que tinha um efeito sobre o sistema de fibra gigante (GFS) da mosca da fruta (Figura 5). Descobrimos que seletivamente interrompeu o GF a caminho DLM, mas não o GF a caminho TTM. A activação dos neurónios motores directamente através da estimulação torácica demonstrou que o defeito na via para GF DLM não era devido a uma disfunção na junção neuromuscular (JNM) mas era consistente com a eficácia antagonistat de MLA com os subtipos Dα7 nAChR apresentar na sinapse PSI-DLMn (Figura 1). Embora o GF a ligação TTMn mostrou ser colinérgica, desconhece-se se Dα7 subunidades nAChR estão presentes neste sinapse. Além disso, a ausência genética do gene de colina (Cha) acetiltransferase ou o subtipo nAChR Dα7 (Dα7) gene não perturbar o funcionamento da ligação de GF-TTMn por causa da presença simultânea de uma junção eléctrica ^{5,6,17,19, 20,} o que faz o percurso improvável que seja afectado por MLA.

Após a injecção composto, a solução deve imediatamente imergir todo o sistema nervoso do animal, devido ao seu sistema circulatório aberto ^21. Se adequadamente injetado, composto geralmente atinge o tórax e abdômen em poucos segundos, mas uma dispersão homogénea pode levar até um minuto. No entanto, se o composto não é injectado adequadamente na hemolinfa (isto é, injecção do micropipeta também deep indo para o tecido do cérebro), em seguida, mais lenta dispersão por todo o animal é observado. Enquanto corante pode ser utilizado para a prática de uma técnica de injecção adequada, como mostrado no vídeo, não é recomendado para co-administrar o corante azul com um composto a ser testado como pode alterar as propriedades do composto e assim a sua bioactividade. Além disso, uma vez que a maioria das soluções utilizadas como solvente são claras na cor (solução salina, DMSO, etc), é difícil de ver ou não o composto foi ejectado a partir da agulha de injecção. Portanto, quando a dissolução de um composto específico que é importante para garantir que ele é totalmente em solução; partículas não dissolvidas em contrário irá rapidamente entupir a ponta de injecção, impedindo a partir de qualquer de ejecção de fluido. Além disso, embora a dispersão composto pode ser imediata ao longo da hemolinfa, atingindo os alvos no sistema nervoso central, bem como atingindo a sua dose máxima, pode levar mais tempo com base nas propriedades do composto químicos, tais como o tamanho e Polarity, ea sua capacidade para permear barreira da mosca hematoencefálica. ²² Assim, é importante para monitorizar os efeitos potenciais dos compostos desconhecidos vários minutos após a injecção, porque os compostos diferentes podem ter variação em tempos de efeitos de início, que podem aumentar ao longo do tempo, em alguns casos . Fortes efeitos e imediata do composto que bloquear completamente a função dos neurónios já pode ser visto com as respostas desencadeadas a 1 Hz, enquanto a estimulação do GFS a frequências mais elevadas (100 Hz) é usado para detectar efeitos mais subtis devido a uma menor dosagem ou potência de um composto. Se nenhum efeito são observados após a injecção composto pode ser devido ou a dosagem da droga pequena ou o facto de alvo específico do composto molecular não está presente no GFS.

Além disso, quando se utiliza o bioensaio aqui apresentado como uma ferramenta de rastreio para compostos novos (tais como conotoxinas), é importante notar que o ensaio é restrito para os alvos moleculares encontrados naGFS da mosca. Embora o ensaio em si não permite localizar os alvos reais moleculares do composto injectado, ele permite o estreitamento para baixo de alvos potenciais dentro do GFS. Testes adicionais, tais como patch clamp em neurônios ou músculos ou estudos de interação genéticas com mutantes de Drosophila melanogaster, podem ser feitos para determinar o alvo específico destes compostos. Finalmente, o protocolo de gravação apresentada foi concebido para detectar efeitos antagonistas sobre a função do GFS. No entanto, o protocolo de gravação pode ser facilmente ajustado para monitorizar os efeitos agonistas por passivamente acompanhamento para as respostas induzidas pelo composto, em vez de testar se o GFS não é capaz de responder com fiabilidade quando o circuito é estimulado pelo experimentador.