Разбор и культуры Чик Statoacoustic ганглия и спинного мозга при эксплантов Коллаген Гели для нейритов Анализы вырост

Рецепты

Чик Ringers

Примечание: Регулировка рН до 7,4. Принесите конечный объем до 1000 мл воды.

10X PBS

Примечание: Регулировка рН до 7,4. Доведите окончательноеобъем до 500 мл водой. Рабочие концентрации (1X) производится путем разбавления 1 часть 10X акции с 9 частями ткани культуры сорт воды, как, например, полученные с Millipore системы УФ-излучение для получения воды с 18 МОм-см проводимость.

SAG эксплантов проведения среда

• DMEM/F12 с L-глутамина, 10 мМ Hepes
• 10% инсулина, передача, селен (ИТС +1)
• 1% перо-стрептококк

Эксплантов культуральной среде

• SAG эксплантов проведения среда
• 10 нг / мл нейротрофина-3 (NT-3)
• 10 нг / мл цилиарной нейротрофический фактор (CNTF)

Спинной мозг и рассечение проведения среда

• L-15
• 10% эмбриональной телячьей сыворотки
• 1% перо-стрептококк

Инкубировать яйца при 37-38 ° С. Стерилизовать рассекает инструменты и Sylgard рассекает блюдо в 70% этанола. Пройдя через посуду и инструменты могут быть также УФ стерилизовать в одночасье.

1. Место бусины микропробирок с 1 мл стерильной PBS, перемешайте и подождите, пока бусы оседают на дне пробирки.
2. Вымойте бисером несколько раз, удаляя супернатант после бисером поселились и ресуспендируют в PBS.
3. Инкубируйте бусины очищенного белка (разводят в PBS) или PBS в одиночку (контроля) в течение 1 часа при комнатной температуре.
4. Промыть бусин в ФБР и хранить в 24-луночного планшета с 1 мл PBS, пока размещены в коллаген.

2. Statoacoustic рассечение ганглий

1. На Е4 удалить эмбрион из яйцеклетки и поместить его в блюдо с раствором куриного Рингера для удаления зародышевых оболочек.
2. Место эмбриона в Sylgard © выстроились Петри заполнена холодным HBSS и положение эмбриона на бок слухового пузыря вверх. Pin эмбриона блюдо использованием рассекает булавки.
3. Использование двух рассекает контакты, сделать горизонтальный разрез через кожу сразу вентральнееканал сумки, примерно там, где он отвечает улиткового канала. Сделайте вертикальный разрез передней и задней, чтобы SAG. Используйте пинцет или рассекает булавку, чтобы поднять и удалить лоскут кожи граничит с тремя разрезами.

   Примечание: SAG находится на краю антеровентральном отоцист, примерно на полпути между спинной сумке которого хорошо видна с подсветкой базы светлое, и вентральной улиткового канала, какие проекты ventromedially и заслоняется глотки арок. Улиткового канала удлиняется так что его дорсовентральной размер будет постепенно увеличиваться на Е4 между Гамбургер-Гамильтона этапы 23-25 ​​9.

4. Потяните отоцист в заднем направлении, чтобы отделить его от SAG. Свернуть тканей, окружающих SAG с рассечением штифты и осторожно снимите SAG из эмбриона с помощью # 55 щипцами. Удалите большие куски мезенхимальных тканей и нервных пучков выступающие от SAG.
5. Использование широким горлом кончика пипетки, передача эксплантов для24-луночный планшет с 0,5 мл SAG эксплантов проведение среды. Держите эксплантов на льду или при комнатной температуре в течение 4 часов.

3. Спинной рассечение шнур

1. Удалить E6 эмбриона из яйцеклетки и поместить его в блюдо с раствором куриного Рингера. Удалите головы и зародышевых оболочек.
2. Место тела в Sylgard © рассекает блюдо с холодной средой рассечение спинного мозга. Положение и контактный эмбриона "вентральный вниз" и хвостового стоящих перед экспериментатором. Место вскрытия булавки каждой конечности и через передний конец.
3. Использование щипцов и / или рассекает булавки, осторожно снимите кожу и ткани, двигаясь в направлении вентральной, пока дорсальной поверхности спинного мозга видна.
4. Отрежьте спинной средней линии спинной мозг с рассекает контактный, в задней к передней, вдоль всей длины спинного мозга. Это создает "открытая книга", как левая и правая стороны спинного мозга отдельно.
5. Удалить спинной мозг из организма, удерживая хвостового-самый конец спинного мозга пинцетом и поднимая вверх и в сторону от экспериментатора. Удалите оставшиеся DRG и мозговых оболочек.
6. Держите один конец спинного мозга с пинцетом (или контактный его в блюдо) и использовать Vannas ножницы, чтобы разрезать вдоль вентральной средней линии, чтобы делить пополам спинного мозга.
7. Держите один конец эксплантов щипцами для иммобилизации ткани и использовать Vannas ножницы, чтобы вырезать небольшие эксплантов (100-500 мкм в длину) по всей длине ткани. Плиты перекрытия могут быть признаны ясно утолщения ткани вдоль одной эксплантов края.
8. Используйте широкий рот кончик пипетки для передачи эксплантов в 24-луночный планшет с 0,5 мл холодной среды рассечение. Держите эксплантов на льду для поддержания жизнеспособности тканей, еили до 4 часов.

4. Эксплантов культуры с очищенных белков для проверки нейритов отзывчивость

1. Подготовка 1,5 мг / мл раствора коллагена в 15 мл коническую трубку, на льду, в соответствии с инструкциями производителя.
2. Проверьте коллагена решение имеет рН 7-7.4 использованием индикаторной бумаги рН. Отрегулируйте рН путем добавления NaOH в 1 мкл.
3. Передача эксплантов для 24-луночного планшета, используя широкий кончик пипетки ртом и аспирата лишнюю жидкость. Несколько эксплантов можно культивировать в одной скважине, но должно быть как минимум 500 мкм друг от друга.
4. Добавить 0,5 мл коллагена и содержащих эксплантов. Позиция эксплантов на нижней поверхности скважины. Не забудьте настроить каждую культуру полностью, прежде чем перейти к следующему хорошо, потому что коллаген начнет полимеризоваться при комнатной температуре.
5. Место культуры пластины на 37 ° С теплее слайд в течение 30-45 мин для полимеризации коллагена. Когда коллаген polymerized она будет напоминать гель.
6. Добавить 0,5 мл теплой питательной среды эксплантатов дополнены или очищенных белков (разводят в PBS) или PBS (контроль) и инкубировать при температуре 37 ° C, 5% СО _2. Влияние на аксонов должен быть виден на 24 часа.

   ПРИМЕЧАНИЕ: Мы использовали тот же протокол для эксплантов культуры SAG до 42 часов.

5. Эксплантов совместной культуре с белком покрытием бисером проверить результат направленного нейритов

1. Начните с эксплантов шаги культуры 4.1-4.4.
2. С помощью пипетки, передача 1-5 бусы из PBS к колодцу, содержащей решение коллагена и эксплантов.
3. Используйте пинцет, чтобы положение бусин 50-500 мкм от края эксплантов.
4. Место пластины на 37 ° С теплее слайд в течение 30-45 мин для полимеризации коллагена. Ткани или бисер может стать, перемещенных в коллаген полимеризуется. Проверьте культур и повторно позиции ткани и бисера в течение первых 5 мин.
5. Добавить 0,5 мл SAG средств массовой информации в каждую лунку и инкубировать в течение 24 часов.

6. Визуализация аксонов по иммуногистохимии

1. Промыть культур в PBS и исправить в течение 1 часа при комнатной температуре в 4% параформальдегида в ФСБ.
2. Выпуск гели от стен скважины с помощью трассировки по краю гели с закругленным концом лопаточки тефлоновой микро. Выполните immunostain с гелей в скважинах. Промойте несколько раз в PBS.
3. Инкубируйте в 0,5 мл блокирующий раствор (10% телячьей сыворотки, 0,1% Triton X-100, 0,1% азида натрия в PBS) в течение ночи при 4 ° C.
4. Инкубируйте в 0,5 мл первичного антитела (анти-β-тубулина антителами разбавленной 1:500 в блокировании решения) в течение ночи при 4 ° C.
5. Промойте несколько раз в PBS. Инкубируйте в 0,5 мл вторичного антитела (Alexa Fluor 488 антимышиного IgG антител _2b разбавленной 1:500) в течение ночи при 4 ° C. С этого шаг вперед, держать пластины в темных или заверните в фольгу, из-за светочувствительностьвторичные антитела.
6. Промойте несколько раз в PBS и хранить при температуре 4 ° С в PBS на срок до одной недели.

7. Представитель Результаты

Рисунок 1. Представитель результаты нейритов способствующих эффект очищенного NT-3 и NT-3-покрытием бусины на эксплантаты Е4 куриных SAG. SAG нейронов клеточных тел и невриты были immunostained с β-тубулина и полученную с 10-кратным цели по конфокальной микроскопии. После 24 часов в пробирке, SAG эксплантов отображается больше аксонов в присутствии 100 нг / мл очищенной человека NT-3 добавляли в среду клеточной культуры (1B), по сравнению с контрольной группой (1А). SAG нейроны со-культурный бисером пропитанной in100 нг / мл NT-3, чтобы продемонстрировать, что точечный источник NT-3 может локально способствовать аксонов. Эксплантов отображается дольше и плотнее аксонов на сторонеэксплантов сталкивается шарик по сравнению с противоположной стороны (1D) и по сравнению с контрольными культурами бисером пропитанные PBS (1С). Шкала бар = 200 мкм.

Рисунок 2. Представитель результаты нейритов способствующих эффект очищенного Wnt5a и Wnt5a покрытием бусины на E6 куриных спинного мозга. Спинной эксплантов шнур были immunostained с β-тубулина и полученную с использованием конфокальной микроскопии. Через 24 часов роста в присутствии очищенной мыши Wnt5a (400ng/ml), аксонов из куриных спинного эксплантов шнур был увеличен (2B) по сравнению с контрольной культурный без Wnt5a (2А). Бисер пропитанную 500 нг / мл Wnt5a, размещенные 300-500 мкм от края спинного эксплантов мозга, также способствовало аксонов (2D) по сравнению с контрольными культурами (2C). Аналогичные побочные культура результаты ранее были опубликованы с Wnt5a-экспрессирующие клетки ^8. Шкала бар = 200мкм.

Мы представляем метод препарировать и культуры E4 и E6 SAG спинного эксплантов мозга, от цыпленка, под бессывороточной условиях. Эта процедура в настоящее время используется в нашей лаборатории для изучения влияния различных выделяется лигандов на SAG выживанию нейронов и аксонов. Новые аспекты этого протокола включают в себя использование бессывороточной системы для культивирования эксплантатов и использование бисера пропитанные факторами роста для изучения воздействия на SAG результатом аксонов. Бусинка методом, аналогичным нашим был описан для куриных спинного мозга ^10. Традиционно, бусы были использованы в исследованиях с классическим аксон руководством факторов и морфогенов. Здесь мы показали, что шарик анализа также может быть использован для исследования эффектов нейротрофинов (или других факторов роста) на аксонов (рис. 1).

Есть критические шаги в процедуре, которая, возможно, потребуется внести изменения или оптимизированные для различных приложений. Эти шаги также являются важными переменными для troubле-съемки экспериментов, которые могут оказаться неудачными. Во-первых, нейротрофина-3 (NT-3), цилиарный нейротрофический фактор (CNTF) и ITS (инсулин, трансферрин, селен) были добавлены к культуральной среде, содействовать выживанию нейронов SAG и повышения аксонов ^6,8. Эти факторы роста включены в спинной мозг в экспериментах для проверки биологической активности молекул на тех же условиях, что анализ SAG эксплантов были протестированы. Тем не менее, другие факторы роста могут оказаться более подходящими для этих и других видов ткани. Во-вторых, 1,5 мг / мл, концентрация коллагена был выбран после тестирования спектр коллагеновых концентрации (0,5, 1,0, 1,5 и 2 мг / мл), потому что он произвел самый надежный аксонов от SAG куриные Е4 через 24 часа. Другие источники нейроны могут отображать различные оптимальные коллагена. Наконец, белка концентрации, количество бусинок, а расстояние между эксплантов и бисером также должны быть оптимизированы для каждого приложения. Некоторый рост фактПРС, таких как морфогенов, выражаются в градиентах и оказывают концентрация-зависимых эффектов по выращиванию аксоны во время развития ^11. Таким образом, диапазон концентраций всегда должны быть проверены с помощью аксонов анализы результат. Следует проявлять осторожность, чтобы избежать токсичности: у нас наблюдается повышенный уровень гибели клеток с высокой концентрацией некоторых белков (например, Sonic Hedgehog).

Этот метод может быть адаптирован для дополнительных приложений, в том числе других возрастов, типов тканей, со-культуры методов, а также дополнительные иммуноокрашивания (например, анализы выживаемость клеток). Мы успешно культурный E3-E5 SAG, E6 сетчатки, и E7 обонятельных эксплантов луковица, от куриных, с использованием тех же условиях культуры. Когда результат является надежной в контрольных образцах, этот метод может также показать отталкивающим ответы на выделяемые факторы. Аналогичные методы были использованы для тестирования эффектов морфогенов на млекопитающих нейроны ^12,13, и мы в настоящее время изучает последствия BMP, FGFs, Ш.ч на SAG результатом аксонов. Кроме того, поскольку коллаген гели полимеризуется в 24-луночного планшета, они являются достаточно большими для последующего вложения и секционирования с криостата. Мы регулярно выполнять TUNEL пробы на cryosections коллагена гель культур, что позволяет соотнести уровень выживаемости клеток с количеством аксонов из того же образца ^8.

Существуют ограничения на использование анализов коллагеновый гель в том, как мы представили их здесь. Например, ответы наблюдались в намеренно упрощенной, в среду пробирке, могут не отражать ответы на тот же фактор, когда присутствует в более сложной ситуации в естественных условиях. Кроме того, мы не можем отличить периферический из центральных процессов и не может отличить от слухового вестибулярного невриты. Таким образом, неоднородность отклика среди этих групп может дать нерегулярными или неоднородным результат или, если ответ населения небольшая частьВсего ганглия может быть засчитан как показывает никакого эффекта. Наконец, мы представили метод, который может быть использован для культуры эксплантов Е4 SAG под бессывороточной условиях со значительным выживание нейронов, со множеством приложений от изучения выживаемости клеток, чтобы руководство аксона. В целом, эта система выгодна, поскольку она позволяет контролировать эффекты, связанные с добавлением очищенной факторы по отдельности или в комбинации, не вмешивающихся факторов других выделяемых факторов и сигналы аксонов руководством, которое может присутствовать в в естественных условиях окружающей среды.