Амид водород / дейтерий бирже и MALDI-TOF масс-спектрометрии Анализ Pak2 активации

Hsu, Y., Traugh, J. A. Amide Hydrogen/Deuterium Exchange & MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation. J. Vis. Exp. (57), e3602, doi:10.3791/3602 (2011).

Амид водород / дейтерий обмена (H / D обмена) в сочетании с масс-спектрометрии широко используется для анализа интерфейс белок-белковых взаимодействий, белка конформационные изменения, динамики белков и белок-лиганд. H / D обмена на позиции позвоночник амид был использован для измерения дейтерирования темпы микро-регионов белка методом масс-спектрометрии ^1,2,3. Разрешение этого метода зависит от пепсина переваривания дейтерированных белок на пептиды, которые обычно в диапазоне от 3-20 остатков. Хотя разрешение H / D обмена измеряется методом масс-спектрометрии ниже, чем одной резолюции остаток измеряется Гетероядерные одиночной квантовой когерентности (HSQC) методом ЯМР, масс-спектрометрия измерения в H / D обмена не ограничен размер белок ^4. H / D обмена осуществляется в водном растворе, который поддерживает конформации белка. Мы предлагаем метод, который Utilхарактеризует MALDI-TOF для обнаружения ^2, вместо того, чтобы HPLC / ESI (электрораспылением ионизации)-системы MS ^5,6. MALDI-TOF обеспечивает получение точных данных интенсивности массы для пептиды усваиваются белки, в этом случае протеинкиназы Pak2 (также называется γ-Pak). Протеолиз Пак 2 проводится в автономном пищеварения пепсина. Этот альтернативный метод, когда пользователь не имеет доступа к высокоэффективной жидкостной хроматографии и пепсина колонки подключены к масс-спектрометрия, или когда пепсина колонке HPLC не приводит к оптимальным карте пищеварения, например, сильно дисульфидными связями выделяются фосфолипазы ₂ (SPLA _2). Используя этот метод, мы успешно мониторинг изменений в дейтерирования уровне во время активации Pak2 по каспазы 3 расщепления и аутофосфорилирования ^7,8,9.

1. Pak2 активации

1. Добавить соответствующие предварительные испытания количество каспазы 3 до 20 мкл 12 мг / мл Pak2 в буфере (50 мМ Трис-HCl, 150 мМ NaCl, 2 мМ DTT при рН 7,5) и инкубировать при температуре 34 ° С в течение 30 мин полностью расщепляют и активируют Pak2.
2. Анализ расщепления продуктов SDS-PAGE (10%) и Coommassie синего окрашивания.
3. Добавить расщепляется Pak2 к активации буфера B (50 мМ Трис-HCl, 150 мМ NaCl, 15 мМ MgCl _2, 10 мМ АТФ) при рН 7,5, в 20 мкл до конечной концентрации 10 мг / мл Pak2, и инкубировать при 34 ° С в течение 30 минут, чтобы полностью активировать Pak2 по аутофосфорилирование на 8 мест.
4. Подтверждение полной расщепления Pak2 по миграции p34 и p27 фрагментов, как это определено SDS-PAGE ^10. Правильная проверка аутофосфорилирование условиях осуществляется через авторадиографии в отдельном эксперименте с использованием ⁽³² P), АТФ или масс-спектрометрии для обнаружения фосфопептидов.

2. Идентификацияпепсина-дайджестом Pak2 Фрагменты

1. Добавьте 1 мл 0,1% Trifluroacetic кислота (ТФК) при рН от 2,5 до мытья агарозном бисером дважды перед использованием. Тогда, центрифуга образцы в течение 15 сек при 2000 мкг для удаления бисером.
2. Добавить Pak2 (20 мкг в 2 мкл 150 мМ NaCl, 50 мМ Трис-HCl и 2 мМ DTT при рН 7,5) до 100 мкл 0,1% TFA и инкубировать образца в течение 5 мин с 30 мкл пепсина-сопряженных бисером агарозном .
3. Уравновешивать обратный ВЭЖХ C18 колонке с основной системой растворителей в размере 0,1% TFA при рН 2,5. Пепсина переваривать (50 мкл) вымывают с помощью линейного 100-мин градиентом 0 - 80% ацетонитрила, содержащего 0,1% ТФУ при скорости потока 0,2 мл / мин. Фракции собираются каждые 2 мин.
4. Сухой ВЭЖХ фракции со скоростью-VAC (3 ч) и ресуспендируйте образцов в растворе ацетонитрила (5 мкл) и 0,1% TFA (5 мкл) при рН 2,5.
5. Первоначально, каждая фракция, проверенной на пептиды использованием MALDI-TOF PerSeptive Biosystems Voyager DE STR (PE Biosystems, Foster City, Калифорния, США).
6. 16 фракций, содержащих пептиды подвергаются тандемной масс-спектрометрии использованием Q-TOF масс-спектрометра и QStar XL oMALDI MS / MS для идентификации фрагментов.
7. Последовательность каждого пептида проверяется продукт ионов порожденных тандемной масс-спектрометрии с теоретическими т / г коэффициенты, связанные с первичной последовательности Pak2 использовании сайта белка Prospector ( http://prospector.ucsf.edu/ ) ^11.

3. Измерение Амид H / D бирже

1. Держите всех растворов и реагентов, необходимых для H / D обмена при 25 ° С на водяной бане. АТФ растворяют в воде и доводят рН до 7,0 до использования. Дополнительные 4 мм АТФ в D ₂ O буфер для предотвращения АТФ отделена от Pak2 после разбавления.
2. Инициировать H / D обмена путем добавления 18 мкл буфера D ₂ O (50 мМ MOPS рН 6,98, 125 мМ NaCl) до 2 мкл (20 мкг) Из Pak2 в буфере, содержащем 150 мМ NaCl, 50 мМ Трис-HCl (рН 7,5) и 2 мМ DTT, в результате чего Pak2 уровне 10 мг / мл и рН 7,0 при 0 ° C.
3. Инкубируйте образцы в трех экземплярах, H / D обмен на 0, 0,5, 1, 3, 5 и 10 мин, или 24 ч.
4. Quench H / D процесса обмена путем добавления 180 мкл ледяной 0,1% ТФУ при рН 2,2, который приносит рН до 2,5 в конечном объеме 200 мкл. Для образцов, содержащих АТФ, 180 мкл ледяной 0,11% TFA при рН 2,2 используется для поддержания рН на уровне 2,5 в закаленном состоянии.
5. Добавить аликвоты (100 мкл) каждого закаленного образца до 30 мкл активированного пепсина-сопряженных бисером агарозы. Переваривание пепсином разрешено приступить к работе на льду в течение пяти минут и образцы встряхивали каждые 30 сек.
6. Завершить пищеварения путем центрифугирования образца в течение 15 сек при 5000 мкг при 4 ° С для удаления пепсина.
7. Быстрое замораживание образцов в жидком N ₂ и хранить при температуре -80 ° С в течение не более 2дней до MALDI-TOF анализа.
8. Матрицы для MALDI составляет 5 мг / мл α-циано-4-гидроксикоричных кислоты (CHCA) растворяют в растворе (1:1:1) ацетонитрила, этанола и 0,1% TFA при рН 2,5 и выдерживают при 0 ° C.
9. Частично оттепели каждого образца и быстро смешайте 1 мкл каждого образца с 1 мкл матрицы и пятно на 4 ° С пластиной целевой MALDI.
10. Применить умеренной вакуума пластины сухие пятна в 30 сек до MALDI-TOF анализа. Время между таянием образца и спектр поиска составляет около 3 мин.
11. Приобретать MALDI-TOF масс-спектров с PerSeptive Biosystems STR Voyager DE. Приобретать данных на 2-ГГц частота дискретизации в 100 000 каналов передачи данных, с 20 000-V ускоряющего напряжения, а 65% сетке напряжение, используя задержки экстракции с 180-нс импульс задержки. Сто сканирует усредняются в 2 мин. MALDI-TOF прибор не ограничивается какой-либо марки или какого-либо конкретного программного обеспечения.
12. Используйте Data Explorer 4,0 компьютерную программу, чтобы исчислениеели дейтерирования каждого фрагмента.
13. Рассчитать обратно обмена основан на отношение фактической включены дейтрона числа в 24 ч H / D обмена делится на всех возможных сменных сайты, которые являются основой амиды, кроме N-терминал амид (рис. 1).

4. Представитель Результаты:

Расщепление каспаз и аутофосфорилирования проверяются SDS-PAGE окрашивания Commassie. Неактивные Pak2 является одной полосы в 58 кДа. Каспаз расщепления Pak2 завершена, и производит два осколка, p27 и p34, которые мигрируют по отдельности. Миграция аутофосфорилированную p27 и p34 показывает перекрытия на геле из-за отсталых миграции полностью фосфорилированного р27 фрагмента (рис. 2).

H / D обмена эксперименты проводятся несколько раз от 0 до 10 мин (рис. 3). В качестве примера, время конечно дейтерия включения в м / грЕАК 1697,85 неактивных Pak2 состоит из нескольких изотопных пиков как показывает смещение масс конверт с течением времени.

Рисунок 1. Уравнение для расчета дейтерирования.

Рисунок 2. Аутофосфорилирование и каспазы расщепления Pak2. Каспазы-расщепляется Pak2 (левая полоса), неповрежденные неактивных Pak2 (средней полосе) и каспазы-расщепляется аутофосфорилированную Pak2 (правая полоса) были проанализированы SDS-PAGE и Coommassie синего окрашивания. По материалам Хсу, YH и др. ^2.

Рисунок 3. Масс-спектр время курс дейтерия включения для неактивных Pak2. Неактивные Pak2 подвергался H / D exchaНге за 0-10 мин и проанализированы MALDI-TOF. Пример расширенного изотопного распределения MALDI-TOF пика т / г 1697,85 во время хода H / D обмена показано на рисунке. Красная пунктирная линия показывает среднее значение массы оболочки и смещение масс конверт показывает дейтерирование пептида.

Определение Пепсин-дайджестом Фрагменты является важным шагом в H / D эксперимент обмена. Неправильная идентификация пептида может привести к неправильному выводу. Пепсин-переваренной Pak2 вымывается через обратный ВЭЖХ C18 колонке для получения чистой фона. В наших экспериментах в общей сложности 40 фракций были собраны и подвергнуты MALDI-TOF. Несколько пептиды могут быть определены в каждой из фракций. Пептиды были подвергнуты тандемной масс-спектрометрии (Q-TOF MS / MS и oMALDI MS / MS) для определения их последовательности. MS / MS спектры пептида должны иметь не менее трех ионов продукт для подтверждения идентификации пептида.

Данные Explorer 4.0 Компьютерная программа (Applied Biosystems) выполняет начальную коррекция базовой линии и фильтрации шума. Каждый спектр должен быть откалиброван на базе двух последовательных пиков. Мы калибровку наших спектра теоретическая масса undeuterated т / г, которые 923,45 и 1697,84. ТОн массы точность после калибровки может достигать 10 частей на миллион. По дейтерирования, моно-изотопов могут перейти на более высокую массу. Унитарное увеличивает шаг к этим т / г соотношение дали расширенной масс связано с дейтерирования. Пик интенсивности массы конверте не повлияет дейтерирования уровне. Тем не менее, пик интенсивности изотопных пиков в частности массы оболочки имеют решающее значение для расчета средней массы. Первый шаг расчет включены дейтрона вычитания пептид массой, не дейтерированного образца из дейтерированного образца. Три других факторов, D ₂ O разбавления, остаточная дейтронов в боковые цепи и обратно обмена, должны быть дополнительно рассмотрены в расчет (рис. 1). D ₂ O разведения коэффициент разбавления D ₂ O после смешивания образца и D ₂ O буфера инициировать H / D обмена. Остаточные дейтрона (4,5%), в боковых цепей пепсина-дайджестред пептидов необходимо вычесть. Резервное обмен неизбежные потери дейтерирования во всех дейтерированных и пепсина-переваренной пептидов в процессе измерения массы.

Наиболее доступным растворителя пептид (м / г = 1105,60), после 24-часового Н / D обмена представляет собой полный регионе дейтерирования. Включены дейтрона номер для каждого из пептидов представляет собой разницу между центром тяжести дейтерированных и не дейтерированного Pak2 пептидов язвенной. Наиболее дейтерированных пептида т / г 1105 был выбран для представления полной дейтерирования когда Pak2 был в 24 ч H / D обмена. Вернуться коэффициент обмена был рассчитан путем фактического включены дейтрона числа в 24 ч H / D обмена делится на всех возможных сменных сайтов на пептида т / г 1105.

Нет конфликта интересов объявлены.

Эта работа частично поддержана из Национального института здоровья Грант GM-26738 (к JAT).

1. Anand, G.S., Hughes, C.A., Jones, J.M., Taylor, S.S. & Komives, E.A. Amide H/2H exchange reveals communication between the cAMP and catalytic subunit-binding sites in the R(I)alpha subunit of protein kinase A. J. Mol. Biol. 323, 377-386 (2002).
2. Hsu, Y.H., Johnson, D.A. & Traugh, J.A. Analysis of conformational changes during activation of protein kinase Pak2 by amide hydrogen/deuterium exchange. J. Biol. Chem. 283, 36397-36405 (2008).
3. Englander, S.W. & Kallenbach, N.R. Hydrogen exchange and structural dynamics of proteins and nucleic acids. Q. Rev. Biophys. 16, 521-655 (1983).
4. Katta, V. & Chait, B.T. Conformational changes in proteins probed by hydrogen-exchange electrospray-ionization mass spectrometry. Rapid Commun. Mass. Spectrom. 5, 214-217 (1991).
5. Hsu, Y.H., Burke, J.E., Li, S., Woods, V.L., Jr. & Dennis, E.A. Localizing the membrane binding region of Group VIA Ca2+-independent phospholipase A2 using peptide amide hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. J. Biol. Chem. 284, 23652-23661 (2009).
6. Hsu, Y.H., et al. Calcium binding rigidifies the C2 domain and the intradomain interaction of GIVA phospholipase A2 as revealed by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. J. Biol. Chem. 283, 9820-9827 (2008).
7. Lee, N., et al. Activation of hPAK65 by caspase cleavage induces some of the morphological and biochemical changes of apoptosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94, 13642-13647 (1997).
8. Rudel, T. & Bokoch, G.M. Membrane and morphological changes in apoptotic cells regulated by caspase-mediated activation of PAK2. Science. 276, 1571-1574 (1997).
9. Roig, J. & Traugh, J.A. Cytostatic p21 G protein-activated protein kinase gamma-PAK. Vitam. Horm. 62, 167-198 (2001).
10. Walter, B.N., et al. Cleavage and activation of p21-activated protein kinase gamma-PAK by CPP32 (caspase 3). Effects of autophosphorylation on activity. J. Biol. Chem. 273, 28733-28739 (1998).
11. Clauser, K.R., Baker, P. & Burlingame, A.L. Role of accurate mass measurement (+/- 10 ppm) in protein identification strategies employing MS or MS/MS and database searching. Anal. Chem. 71, 2871-2882 (1999).

1 Comment

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.