Anvendelse af MassSQUIRM for kvantitative målinger af Lysin demetylase aktivitet

Denne protokol er modificeret fra Blair et al. ^6.

1. LSD1 demetylering Assay

1. I et slutvolumen på 20 ul, kombinere 125 ng rekombinant LSD1 med 0,25 ug di-methyl histon H3 peptid (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-biotin) i demethylase puffer (50 mM Tris-Cl pH 8,5, 50 mM KCI, 5 mM _MgCl2, 5% glycerol). Desuden udføres en peptid alene kontrol uden enzym. Styringen er for afsnit 3 og behøver ikke reduktiv methylering.
2. Inkuber i 2 timer ved 37 ° C.
3. At indsamle peptiderne tilsættes 8 gl Poros R2 20 mikron perler til hver prøve og omrør i 15 minutter ved stuetemperatur. Forberede Poros perler ved at suspendere en volumen af ​​perler med en volumen af ​​methanol, og derefter tilsættes 10 volumener 5% myresyre / 0,2% TFA.
4. Forudsat to C ₁₈ ZipTips ved sugning 20 pi 0,1% TFA i spidsen og skubber den ud igen med en pipette. Gør dette to gange med 0,1% TFA, fire gange med 70% acetonitril / 0,1% TFA, og fire gange igen med 0,1% TFA.
5. Læg de to prøver (kontrol og demetylase reaktion) på de betingede C ₁₈ ZipTips ved pipettering af perlen gyllen bag C ₁₈ harpiks i de ZipTips og skubbe volumen igennem med en pipette.
6. Vaskes ZipTips to gange med 20 pi 0,1% TFA.
7. Eluering med 40 pi 70% acetonitril / 0,1% TFA.
8. Lyofiliseres hver elueringsmiddel fuldstændigt med en SpeedVac koncentrator.

2. Reduktiv methylering

Denne del af protokollen er modificeret fra Blair et al. Og Rayment et al. ^6,7.

1. Genopslæmmes demethylase reaktionen i 100 pi 50 mM phosphatpuffer, pH 7,4.
2. Til demethylase reaktionen 8 pi 15 mg / ml boran dimethylamin tilsættes. Boran dimethylamin opløses i 50 mM phosphatbuffer, pH 7,4, til opnåelse af 15 mg / ml stamopløsning.Dette bør gøres frisk.
3. Til demetylase reaktion, 16 pi 250 mM deutereret formaldehyd tilføje. Den 250 mM deutereret formaldehyd fremstilles ved fortynding af bestanden i H ₂ 0. Dette bør gøres frisk.
4. Inkuber ved 4 ° C i 2 timer.
5. Gentag trin 2.2, 2.3 og 2.4.
6. Gentag trin 2.2.
7. Inkuber ved 4 ° C i ~ 15 timer.
8. Til demethylase prøven, 12,5 pi 1 M Tris, pH 7,4 for at standse reduktiv methylering reaktionen tilsættes.

3. MALDI-massespektrometri

1. Tilsættes Poros R2 20 mikron perler til demethylase reaktionen, og samler sig på ZipTips som beskrevet i trin 1,3-1,6.

Bemærk: genopslæmmes kontrol i 100 pi 50 mM phosphatpuffer, pH 7,4 og behandles som den anden prøve med start ved trin 3.1.

2. Eluere kontrol og demethylase reaktionsbetingelser prøver fra ZipTips på en MALDI prøvepladen under anvendelse af 2 pi af 33% mætningd 2,5-dihydroxybenzoesyre. Til fremstilling af 33% 2,5-dihydroxybenzoesyre, at en mættet opløsning af 2,5-dihydroxybenzoesyre i 70% acetonitril / 0,1% TFA og fortyndes derefter til 33% mættet i 70% acetonitril / 0,1% TFA. Tillade de eluerede prøver at tørre og krystallisere.
3. Indsamle massespektre med en PerkinElmerSciex MALDI-prOTOF massespektrometer eller tilgængelige høj opløsning MALDI massespektrometer ^8,9,10.
4. Vis spektre og udtrække toparealer hjælp PerkinElmerSciex TOFworks software eller software leveret af massespektrometer producenten.
5. Kontroller reaktionsprodukter af MS ² med en tilgængelig massespektrometrisk system, der giver tandem-massespektrometriske kapaciteter.

4. Dataanalyse

1. For at kompensere for isotope overlapning ved hjælp tung formaldehyd (figur 1B), det maksimale område (A) mellem ^13C ₂ og ¹³ _C4 isotoper Relative til monoisotopic top for kontrolprøven, som ikke har undergået reduktiv methylering (fig. 2A).
   Ækv 1: A _13C2 / A _12C = _R1
   Ækv 2: A _13C4 / A _12C = _r2
   Dette vil give dig forholdet af peptid findes i disse isotopiske stater (r ₁ & r ₂₎ er specifik for dit eksperiment og massespektrometer.
2. Anvende _R1 og R ₂ værdier i de følgende formler til kvantificering af den relative mængde af peptid, der findes i hver modifikation tilstand i demethylase reaktionen prøve (fig. 2B):
   Ækv 3: H3K4me2 = A ₁
   Ækv 4: H3K4me = A ₂ - _R1 (A ₁₎
   Ækv 5: H3K4 = A ₃ - _R2 (A ₁₎ - _[R1 (A ₂ - _R1 (A _1))]

5. Repræsentative resultater

Med LSD1, viser vi effektiviteten af ​​MassSQUIRM til kvantificeringlysin demethylering. Som beskrevet i protokollen Tekstdel, udførte vi en demethylase assay med 125 ng LSD1 og 0,25 ug di-methyl histon H3 peptid (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-biotin). Kontrol og demethylase reaktionsbetingelser prøver blev udsat for reduktiv methylering og MALDI massespektrometri. Kontrol reaktion, ikke undergår reduktiv methylering viste typisk isotopisk bevilling til dette peptid og gav toparealer for ligninger 1 og 2 (fig. 2A). Massespektret for demethylase reaktion, forudsat toparealer for ligninger 3-5 (fig. 2B). Ved hjælp af toparealerne fra kontrol-og demethylase reaktion, bestemte vi, at LSD1 demethyleres peptidet til opnåelse af følgende reaktionsprodukterne: 33,7% di-methyl Lys4, 42,3% mono-methyl Lys4 og 24% ikke-methyleret Lys 4. Se Blair et al. For den fulde analyse af LSD1 demetylase aktivitet samt hæmmer undersøgelser ^6. Bemærk, at ændring variabler såsom reaktionstid, enzymkoncentration og substratkoncentrationen vil give mulighed for en dybtgående analyse af aktivitet.

Figur 1. MassSQUIRM oversigt. (A) en N-terminalt peptid fra histon H3 er vist som værende un-(grøn), mono-(rød) eller di-(blå) methyleret ved lysin 4. Variation i den kemiske sammensætning af hvert peptid fører til forskellen ionisering at kvantificering kompleks. (B) reduktiv methylering konverterer alle lysinrester til di-methyl-tilstand, som forårsager alle peptider til at ionisere lignende. Anvendelse af tungt formaldehyd i den reduktive methylering reaktionen tillader tilbageholdelse af identiteten af ​​den oprindelige methylering. Åbne cirkler angiver lys methylering mens lukkede cirkler indikerer tungt methylering. Modificeret fra Blair et al. 2011 ^6.

Figure2. MassSQUIRM kan anvendes til at kvantificere differentielt methylerede peptider. (A) en di-methyleret syntetisk histon H3 peptid (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-biotin) blev analyseret under anvendelse af massespektrometri og maksimale forhold i forhold til monoisotopic top blev noteret _som R1 _og R2 i ligninger 1 og 2. (B) Det samme syntetiske peptid blev inkuberet med 125 ng LSD1 i demethylase puffer i to timer ved 37 ° C. Prøver blev derefter underkastet MassSQUIRM analyse. En blandet population af overlappende toppe repræsenterer tre forskellige tilstande for methylering, som det ses i figur 1B. Arealerne under monoisotopic toppe blev noteret som _en, A _2, og A _3. Toparealer blev anvendt i ligningerne 3-5. Åbne cirkler angiver lys methylering mens lukkede cirkler indikerer tungt methylering. Modificeret fra Blair et al. 2011 ^6.

MassSQUIRM er en billig og kvantitativ metode til omfattende analyse af aktiviteten af ​​lysin demethylases involveret i mono-og di-methylering. MassSQUIRM giver kvantificering ikke blot af produktet af reaktionen, men også for mellemprodukterne. Denne analyse kan bruges som et effektivt redskab i at studere mekanismen for LSD1 og andre histon demethylases. Det vil også være nyttige til klassificering mange nyopdagede lysin demethylase enzymer, såsom PHF8 og kan anvendes til visse methyltransferase enzymer.