Anvendelse av MassSQUIRM for kvantitative målinger av Lysine demethylase aktivitet

Denne protokollen er endret fra Blair et al. ^6.

1. LSD1 demetylering Assay

1. I en endelig volum på 20 mL, kombinere 125 ng rekombinant LSD1 med 0,25 mg di-methyl histone H3 peptid (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-biotin) i demethylase buffer (50 mM Tris-Cl 8,5 pH, 50 mM KCl, 5 mm MgCl _2, 5% glyserol). I tillegg utfører et peptid alene kontroll uten enzym. Kontrollen er for seksjon 3 og trenger ikke reduktiv metylering.
2. Inkuber i 2 timer ved 37 ° C.
3. Å samle peptider, legge til 8 mL Poros R2 20 mikron perler til hver prøve og agitere for 15 minutter ved romtemperatur. Forbered Poros perler ved å henge en volum av perler med en volum av metanol, og deretter legge til 10 bind av 5% maursyre / 0,2% TFA.
4. Tilstand to C ₁₈ ZipTips ved å aspirere 20 mL på 0,1% TFA i spissen, og skyve den ut igjen med en pipettor. Gjør dette to ganger med 0,1% TFA, fire ganger med 70% acetonitril / 0,1% TFA, og fire ganger igjen med 0,1% TFA.
5. Legge de to utvalgene (kontroll og demethylase reaksjon) på de betingede C ₁₈ ZipTips ved pipettering perlen slurry bak C ₁₈ harpiksen i ZipTips og presser volumet gjennom med en pipettor.
6. Vask ZipTips to ganger med 20 mL på 0,1% TFA.
7. Eluer i 40 mL 70% acetonitril / 0,1% TFA.
8. Lyophilize hver eluant helt med en SpeedVac konsentrator.

2. Reduktiv Metylering

Denne delen av protokollen er endret fra Blair et al. Og Rayment et al. ^6,7.

1. Re-suspendere demethylase reaksjonen i 100 mL av 50 mM fosfatbuffer, 7,4 pH.
2. Til demethylase reaksjonen, legger 8 mL av 15 mg / ml Borane dimetylamin. Borane dimetylamin er oppløst i 50 mM fosfatbuffer, 7,4 pH, for å gi 15 mg / ml stamløsning.Dette bør gjøres frisk.
3. Til demethylase reaksjonen, legger 16 mL av 250 mm deuterert formaldehyd. Den 250 mm deuterert formaldehyd er utarbeidet ved å fortynne aksjen i H ₂ 0. Dette bør gjøres frisk.
4. Inkuber ved 4 ° C i 2 timer.
5. Gjenta trinn 2.2, 2.3 og 2.4.
6. Gjenta steg 2.2.
7. Inkuber ved 4 ° C i ~ 15 timer.
8. Til demethylase prøven, legger 12,5 mL av 1M Tris, pH 7,4 for å slukke den reduktive metylering reaksjonen.

3. MALDI massespektrometri

1. Legg Poros R2 20 mikron perler til demethylase reaksjonen, og samle på ZipTips som beskrevet i trinn 1.3-1.6.

Merk: Re-suspendere kontrollen i 100 mL av 50 mM fosfatbuffer, 7,4 pH og behandle som den andre prøven fra punkt 3.1.

2. Eluer kontroll og demethylase reaksjon prøver fra ZipTips på en MALDI utvalg plate ved hjelp av to mL 33% mettetd 2,5-dihydroxybenzoic syre. For å forberede 33% 2,5-dihydroxybenzoic syre, lage en mettet løsning av 2,5-dihydroxybenzoic syre i 70% acetonitril / 0,1% TFA og deretter fortynnes til 33% mettet i 70% acetonitril / 0,1% TFA. La eluted prøvene tørke og krystallisere.
3. Samle masse spektra ved hjelp av en PerkinElmerSciex MALDI-prOTOF massespektrometer eller tilgjengelig høyoppløselig MALDI massespektrometer ^8,9,10.
4. Vis spektra og trekke peak områder ved hjelp PerkinElmerSciex TOFworks programvare eller programvare levert av massespektrometer produsenten.
5. Kontroller reaksjonsprodukter ved MS ² med et tilgjengelig massespektrometrisk system som gir tandem massespektrometri evner.

4. Data Analysis

1. For å kompensere for de isotop overlapp opprettet ved hjelp av tung formaldehyd (figur 1B), bestemme peak området (A) forholdet mellom ¹³ C ₂ og ¹³ C ₄ isotoper relative til monoisotopic topp for kontrollutvalget, som ikke har gjennomgått reduktive metylering (Fig. 2A).
   Eq 1: A _13C2 / A _12C = r ₁
   Eq 2: En _13C4 / A _12C = r ₂
   Dette vil gi deg forholdet mellom peptid eksisterende i disse isotoper statene (r ₁ & r ₂₎ spesifikke for eksperimentet og massespektrometer.
2. Bruk R ₁ & R ₂ verdier i de følgende formler for å kvantifisere den relative mengden peptid som eksisterer i hver modifikasjon tilstand i demethylase reaksjonen prøven (Fig. 2B):
   Eq 3: H3K4me2 = A ₁
   Eq 4: H3K4me = A ₂ - r ₁ (A ₁₎
   Eq 5: H3K4 = A ₃ - r ₂ (A ₁₎ - [r ₁ (A ₂ - r ₁ (A _1))]

5. Representative Resultater

Ved hjelp LSD1, viser vi effekten av MassSQUIRM for å kvantifiserelysin demetylering. Som beskrevet i protokollen tekstdelen, utførte vi en demethylase analysen med 125 ng av LSD1 og 0,25 mg di-methyl histone H3 peptid (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-biotin). Kontrollen og demethylase reaksjon prøvene ble utsatt for reduktiv metylering og MALDI massespektrometri. Kontrollen reaksjon som ikke gjennomgår reduktive metylering viste den typiske isotoper konvolutten for dette peptid og gitt topp områder for likninger 1 og 2 (figur 2a). Massen spektrum for demethylase reaksjonen tilgjengelig Peak områder for likningene 3-5 (figur 2B). Bruke topp områdene fra kontroll og demethylase reaksjon, fant vi ut at LSD1 demetylert peptid å gi denne reaksjonen produkter: 33,7% di-metyl Lys4, 42,3% mono-metyl Lys4, og 24% un-rødsprit Lys 4. Referer til Blair et al. For full analyse av LSD1 demethylase aktivitet samt hemmer studier ^6. Oppmerksom på at endring variabler som reaksjonstid, enzymkonsentrasjon og underlaget konsentrasjon vil gi rom for en grundig analyse av aktivitet.

Figur 1. MassSQUIRM oversikt. (A) En N-terminal peptid fra histone H3 vises som un-(grønn), mono-(rød), eller di-(blå) denaturert ved lysin 4. Variasjon i den kjemiske sammensetningen av hver peptid fører til differensial ionisering gjør kvantifisering kompleks. (B) reduktive metylering konverterer alle lysin rester til di-metyl tilstand som fører til at alle peptider å ionisere tilsvarende. Bruken av tunge formaldehyd i reduktiv metylering reaksjonen tillater oppbevaring av identiteten til den opprinnelige metylering. Åpne sirkler indikerer lys metylering mens lukkede sirkler indikerer tung metylering. Modifisert fra Blair et al. 2011 ^6.

Figure to. MassSQUIRM kan brukes til å kvantifisere ulikt denaturert peptider. (A) En di-rødsprit syntetisk histone H3 peptid (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-biotin) ble analysert ved hjelp av massespektrometri og topp forhold i forhold til monoisotopic toppen ble registrert som r ₁ og r ₂ i ligninger 1 og 2. (B) Det samme syntetiske peptid ble inkubert med 125 ng LSD1 i demethylase buffer for to timer ved 37 ° C. Prøvene ble deretter utsatt for MassSQUIRM analyse. En blandet befolkning av overlappende topper representerer tre ulike metylering tilstander som vist på figur 1B. Områder under monoisotopic toppene ble registrert som A _1, A ₂ og A _3. Peak områder ble brukt i ligninger 3-5. Åpne sirkler indikerer lys metylering mens lukkede sirkler indikerer tung metylering. Modifisert fra Blair et al. 2011 ^6.

MassSQUIRM er en billig og kvantitativ metode for helhetlig analyse av aktiviteten til lysin demethylases involvert i mono-og di-metylering. MassSQUIRM tilbyr kvantifisering ikke bare av produktet av reaksjonen, men også for mellomprodukter. Denne analysen kan brukes som et kraftig verktøy i å studere mekanismen av LSD1 og andre histone demethylases. Det vil også være nyttig for å klassifisere mange nyoppdagede lysin demethylase enzymer som PHF8 og kan brukes til visse metyltransferase enzymer.