Aplicação de Medidas para MassSQUIRM quantitativa da actividade demetilase Lisina

Este protocolo é modificado a partir de Blair et al. ^6.

1. LSD1 Ensaio desmetilação

1. Em um volume final de 20 uL, combinar 125 ng LSD1 recombinante com 0,25 ug de di-metil histona H3 péptido (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-biotina) em tampão de desmetilase (50 mM Tris-Cl pH 8,5, 50 mM de KCl, 5 _mM MgCl2, 5% glicerol). Além disso, realizar um péptido de controlo sozinha, sem enzima. O controle é para a secção 3 e não precisa de metilação redutiva.
2. Incubar durante 2 horas a 37 ° C.
3. Para recolher os péptidos, adicionar 8 uL Poros R2 20 micron grânulos para cada amostra e agitar durante 15 minutos à temperatura ambiente. Preparar grânulos Poros suspendendo 1 volume de esferas com um volume de metanol, e depois adicionar 10 volumes de 5% de ácido fórmico / TFA a 0,2%.
4. Condição dois C ₁₈ ZipTips por aspiração de 20 uL de TFA 0,1% na ponta e empurrando-o de volta com uma pipeta. Faça isso duas vezes com T 0,1%FA, quatro vezes com acetonitrilo 70% / TFA a 0,1%, e quatro vezes novamente com TFA a 0,1%.
5. Carregar as duas amostras (controle ea reacção desmetilase) sobre os condicionado C ₁₈ ZipTips pipetando a lama grânulo por trás da resina C ₁₈ nas ZipTips e empurrando o volume através com um pipetador.
6. Lavar duas vezes com ZipTips 20 uL de TFA a 0,1%.
7. Eluir em 40 uL de acetonitrilo 70% / TFA a 0,1%.
8. Liofilizar cada eluente completamente com um concentrador Speedvac.

2. Metilação redutiva

Esta porção do protocolo é modificado a partir de Blair et al. E Rayment et al. ^6,7.

1. Re-suspender a reacção desmetilase em 100 uL de tampão fosfato 50 mM, pH 7,4.
2. Para a reacção de desmetilase, adicionar 8 uL de 15 mg / mL de borano dimetilamina. Borano dimetilamina é dissolvido em tampão fosfato 50 mM, pH 7,4, para dar o 15 mg / ml de solução concentrada.Isto deve ser feito fresco.
3. Para a reacção de desmetilase, adicionar 16 uL de 250 mM de formaldeído deuterado. O formaldeído 250 mM deuterado é preparada diluindo o estoque em H ₂ 0. Isto deve ser feito fresco.
4. Incubar a 4 ° C durante 2 horas.
5. Repita os passos 2.2, 2.3 e 2.4.
6. Repita o passo 2.2.
7. Incubar a 4 ° C durante ~ 15 horas.
8. Para a amostra desmetilase, adicionar 12,5 ul de 1M Tris, pH 7,4 para extinguir a reacção de metilação redutiva.

3. Espectrometria de Massa MALDI

1. Adicionar Poros R2 20 micron grânulos para a reacção desmetilase, e recolher em ZipTips como descrito nos passos 1,3-1,6.

Nota: Re-suspende o controle em 100 uL de tampão fosfato 50 mM, pH 7,4 e tratar como a outra amostra de partida no passo 3.1.

2. Eluir o controlo e as amostras reaccionais desmetilase a partir dos ZipTips sobre uma placa de amostra MALDI usando 2 uL de 33% saturard ácido 2,5-dihidroxibenzóico. Para preparar a 33% de ácido 2,5-dihidroxibenzoico, fazer uma solução saturada de 2,5-di-hidroxibenzóico em acetonitrilo 70% / TFA a 0,1% e, em seguida, diluir a 33% saturado em acetonitrilo 70% / TFA a 0,1%. Permitir que as amostras eluidas para secar e cristalizar.
3. Coletar espectros de massa usando um espectrômetro de massa MALDI PerkinElmerSciex-prOTOF ou disponível de alta resolução espectrômetro de massa MALDI ^8,9,10.
4. Ver espectros e extrair áreas dos picos usando PerkinElmerSciex software TOFworks ou software fornecido pelo fabricante do espectrômetro de massa.
5. Verificar produtos de reacção por MS ^2, com um sistema de massa disponível por espectrometria de proporcionar capacidades de espectrometria de massa em tandem.

4. Análise de Dados

1. A fim de compensar a sobreposição isotópicos criadas usando formaldeído pesada (Figura 1B), determinar a área do pico (A) proporção de ¹³ C e ¹³ C _{2 4} isótopos relative para o pico monoisotópico para a amostra de controle, que não foi objecto de metilação redutiva (Fig. 2A).
   Eq. 1: Um _13C2 / A _12C = r ₁
   Eq. 2: Uma _13C4 / A _12C = r ₂
   Isto lhe dará a relação do peptídeo existentes nesses estados isotópica (r ₁ e r ₂₎ específico para o seu experimento e espectrômetro de massa.
2. Utilizar a r ₁ e valores de r ₂ nas fórmulas seguintes para quantificar a quantidade relativa de péptido existentes em cada estado modificação na amostra reacção desmetilase (Fig. 2B):
   Eq. 3: H3K4me2 = A ₁
   Eq. 4: H3K4me = A ₂ - r ₁ (A ₁₎
   Eq. 5: H3K4 = A ₃ - r ₂ (A ₁₎ - [r ₁ (A ₂ - r ₁ (A _1))]

5. Os resultados representativos

Usando LSD1, mostramos a eficácia do MassSQUIRM para quantificardesmetilação lisina. Como descrito na secção de Texto protocolo, realizou-se um ensaio de desmetilase com 125 ng de LSD1 e 0,25 ug de di-metil histona H3 péptido (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-biotina). O controlo e as amostras reaccionais desmetilase foram submetidos a metilação redutiva e espectrometria de massa MALDI. A reacção de controlo que não foi submetido a metilação redutiva mostrou o envelope típico isotópica para este péptido, e desde as áreas dos picos para as equações 1 e 2 (Figura 2A). O espectro de massa para a reacção de desmetilase desde áreas de pico para equações 3-5 (Figura 2B). Usando as áreas dos picos do controlo e reacção desmetilase, determinou-se que o péptido LSD1 desmetilado para dar os produtos de reacção seguintes: 33,7% de di-metil Lys4, 42,3% de mono-metil Lys4, e 24% un-metilado Lys 4. Consulte a Blair et al. Para a análise completa de LSD1 atividade demetilase bem como estudos de inibidores ^6. Note-se que as variáveis ​​mutação tais como o tempo de reacção da enzima,concentração de concentração e substrato permitirá uma análise aprofundada da atividade.

Figura 1. Resumo MassSQUIRM. (A) um péptido N-terminal a partir de histona H3 é mostrado como sendo un-(verde), mono-(vermelho), ou di-(azul) metilado na lisina 4. A variação na composição química de cada péptido leva a ionização diferencial tornando complexo quantificação. (B) metilação redutiva converte todos os resíduos de lisina para o estado de di-metil que faz com que todos os péptidos para ionizar de forma semelhante. A utilização de formaldeído pesado na reacção de metilação redutiva permite a retenção da identidade do metilação original. Círculos abertos indicam metilação luz, enquanto círculos fechados indicam metilação pesado. Modificado de Blair et al. 2011 ^6.

Figur2 e. MassSQUIRM pode ser usado para quantificar os péptidos diferencialmente metilados. (A) Um di-metilado sintético histona H3 péptido (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-biotina) foi analisado por espectrometria de massa e os rácios dos picos relativos ao pico monoisotópico foram anotados como R1 e _{R 2} nas equações 1 e 2. (B) O péptido sintético mesmo foi incubado com 125 ng LSD1, em tampão de desmetilase durante duas horas a 37 ° C. As amostras foram então submetidas a análise MassSQUIRM. Uma população mista de sobreposição picos representa três estados diferentes de metilação tal como são vistos na Figura 1B. As áreas sob os picos monoisotópico foram notadas como um _1, A _2, e A _3. Áreas de pico foram utilizados nas equações 3-5. Círculos abertos indicam metilação luz, enquanto círculos fechados indicam metilação pesado. Modificado de Blair et al. 2011 ^6.

MassSQUIRM é um método barato e quantitativa para análise abrangente da atividade de demethylases lisina envolvidas na mono-e di-metilação. MassSQUIRM oferece não só a quantificação do produto da reacção, mas também para os intermediários. Este ensaio pode ser utilizado como uma ferramenta poderosa para estudar o mecanismo de LSD1 e outros demethylases histona. Também irá ser útil para a classificação de muitas enzimas recém-descobertas desmetilase de lisina, tais como PHF8 e poderiam ser usados ​​para certos enzimas metiltransferase.